三聚体Fc融合蛋白及其用途的制作方法

专利名称：三聚体Fc融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明关于新颖的三聚体(trimeriC)FC融合蛋白，特别是关于具有稳定三聚体Fe融合蛋白结构的新颖胶原蛋白基序之新颖Fe融合蛋白。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF-α)为发炎反应的关键调节物，已知涉及多种疾病状态，例如类风湿性关节炎、发炎性肠炎、干癣性关节炎、血管炎、僵直性脊椎炎、及慢性幼年型关节炎等。TNF-α以相似的同质三聚体蛋白存在，每一亚基(subunit)由巨噬细胞及单核球的免疫系统的细胞起始转录翻译为26kDa的第II型跨膜前驱蛋白。在经由TNF-α转变酶(TNF-a converting enzyme ;TACE)将TNF-a跨膜区域远程的位置分解后，释放出TNF-a可溶性三聚体(17kD)，并藉由结合至效应细胞上的两个结构不同的第I型及第II型TNF-a受体(TNFRI及TNFRII)以发挥其活性。跨膜(transmembrane) TNF-a在传递讯息上扮演双重角色，可作为配体及细胞受体。因此跨膜TNF-a在细胞与细胞接触的局部发炎作用中扮演重要角色。抗TNF-a剂,包括infliximab、adalimumab、etanercept及certolizumab pegol,结合于跨膜TNF-α转染细胞的跨膜TNF-α，结合的亲和力较可溶型TNF- α 的亲和力差(Kaymakcalan, Sakorafas et al.2009)。先前报道指出 infliximab、adalimumab 及 etanercept 皆结合于 TNF- α 产出细胞的跨膜 TNF- a , infliximab 及adalimumab单株抗体似乎透过跨膜TNF-α传递较强的抑制信号(Nesbitt, Fossatiet al.2007) 0这些拮抗物对跨膜TNF-α的结合效应不同，在临床上可能造成不同结果(Taylor2010)。与抗TNF-α抗体不同的是，etanerc印t临床上对肉芽肿疾病的发病并不有效，其中跨膜 TNF-α 可能扮演关键角色(Mitoma, Horiuchi et al.2008)。Etanercept 为二聚体分子，由TNF- α受体2 (p75TNF受体)的细胞外区域及人类IgGl的Fe片段所组成。目前被使用在风湿性关节炎的治疗。然而，25%至28%的患者对此治疗没有反应，怀疑可能是因为此蛋白质与TNF-α的亲和力不足。双价的etanercept分子与TNF-a三聚体形成1:1复合体时，TNF-a上的三 个受体结合位，其中两个被etanerc印t占据，但第三个受体结合位为开放(Scallon, Cai et al.2002) 表达结合etanercept的跨膜TNF-α的细胞在体外不被胞解(Iysis),不论补体存在或不存在(Ar or a, Padaki et al.2009)。先前的报道显示etanercept相较于infliximab对跨膜TNF-α展现相对较差的亲和力。发明人等假设透过高亲和力的TNF-α结合剂(例如^即町或抗了即^抗体infliximab)造成的细胞自灭(apoptosis)的诱导是因为跨膜TNF-α的接合(ligation),而不是因为分泌的TNF-α被中和，此可作为单核细胞的存活因子。因此促使双价的etanerc印t与跨膜TNF-α的结合强度可能是增加风湿性关节炎及克罗恩氏病(Crohn’ s disease)治疗效果的解决之道。功能性的亲和力(总结合力(avidity))是抗原与多种抗原决定子(antigenicdeterminant)及多价抗体的整体结合强度的测量。抗原结合对象的聚合作用大幅地增加在非常接近目标细胞时结合于专一的相同配体群的效应(或价数)。TNF-α家族受体在结合至其同族的配体时，形成同质的三聚体。可溶型嵌合受体的寡聚合作用在与配体的亲和性上的效应已被研究。美国专利公开案US2005/0255547记载最佳的结果如预期地不是与三聚体的结合，而是与五聚体的结合。三聚体的结合效果与二聚体相似，但是却低于五聚体的结合效果的五倍。使用三聚体聚合区域使异质的标靶结合区域三价聚合已有报道。三聚体聚合区域，例如原骨胶原蛋白(procollagen)的C-前肽(propeptide)、胶原凝集素(collectin)家族蛋白质的螺旋颈区域(coiled-coil neck domain)、FasL及卩遼菌体T4的fibririn三聚体聚合区域(foldon domain)的C端部分(Holler,Kataoka etal.2000)。标祀结合区域可为蛋白质荷尔蒙、细胞激素、淋巴细胞激素(Iymphokine)、生长激素、凝集素(lectin)、酶及可溶性受体片段；或黏结分子，例如选凝素(selectin)及整合素(integrin)。可自我三聚体聚合及从C端或N端方向传送异质融合蛋白的短链α-螺旋胶原蛋白状的肽也已被欧洲专利ΕΡ1798240Β1报道。与免疫球蛋白G(IgG)分子相比，这些三聚体融合蛋白在医疗的应用上有下列缺点:(I)下游步骤:不像IgG分子可轻易地由亲和性层析法在蛋白质A或G共轭的树脂中经结合于IgG的Fe片段而纯化，使得在纯化流程的第I步骤就获得超过98%的均质产物，上述三聚体融合蛋白用于医疗应用的纯化是具挑战性的工作，因为没有商业上可获得的亲和性柱；以及(2)低血清半衰期。因此，三聚体融合蛋白仍有改良的需求，以增加血浆中半衰期及药物动力，以及容易被纯化而应用于医疗用途。

发明内容
本案提供一种三聚体融合蛋白，包含三条多肽(polypetides),每一多肽由N端向C端依序融合一结合区域、一胶原蛋白区域及一 Fe区域所构成，其中该胶原蛋白区域包括由(GPP)重复单元及GXKGE (D)基序所构成的多肽。本案更提供一种六聚体融合蛋白，由上述的三聚体融合蛋白经二聚体聚合(dimerization)所形成 。本案再提供一种治疗与TNF-α相关的疾病之医药组合物，包括至少一种的上述三聚体融合蛋白及六聚体融合蛋白。


第IA图显示本案所述之三聚体融合蛋白之示意图；第IB图显示本案所述之六聚体融合蛋白之示意图；第IC图显示实施例1构建的融合蛋白的不同形式的示意图，形式A表示EnbCSFc ；形式 B 表示 EnbhFcCS6 ;形式 C 表示 EnbCS4hFc、EnbCS5hFc 及 EnbCS6hFc ;形式 D:表示EnbCS6hFcM ;及形式 E 表示 bGalCS6hFc ;及第ID图显示etanercept的结构示意图。第2A 2D图显示以蛋白A柱层析法自培养基中纯化的Fe融合分子的结构特征。第2A图显示Etanercept及EnbCS6hFc在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在75°C处理10分钟。第2B图显示EnbCS6hFc在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在室温处理10分钟。第2C图显示EnbCS6hFcM在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在75 °C处理10分钟。第2D图显示bGalCS6hFc在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在75 °C处理10分钟。第2A 2D图的所有样品以相同量的蛋白质在4 10% SDS/Bis-Tri聚酰酰胺胶中电泳，以MES为电泳缓冲液。胶以GelCode蓝安全蛋白染色溶液染色。第3 图显不以 ELISA 评估 bGalCS6hFc 对 β -半乳糖昔酶(β-galactosidase)的结合。涂有5yg/ml的β -半乳糖苷酶的96孔滴定盘(Sigma),与不同浓度的纯化bGalCS6hFc培养，以辣根过氧化酶标记的山羊抗人类IgG Fe Y片段检测。测定在450nm的吸光度。第4图显示胶过滤法分离EnbCS6hFc。0.2mg的蛋白A纯化的EnbCS6hFc总体积IOOy I以Superdex 200 (HR 10/30)胶过滤柱分离，以磷酸缓冲食盐水平衡。空白(V。)及洗脱(elution)体积对应的蛋白质分子量标准以箭头标示。流速为0.4ml/min。第5图显示不同TNF-α拮抗物与TNF_a的结合亲和力。使用涂有2yg/ml的TNF- α的96孔微滴定盘。2倍系列稀释的TNF- α拮抗物，adalimumab (▼)、etanercept ( O )及EnbCS6hFc(.)37°C培养I小时。清洗后以辣根过氧化酶标记的山羊抗人类IgG Fcy片段检测已结合的TNF-α拮抗物，及使用3，3’，5，5’，-四甲基联苯胺为基质。以微滴定盘读取器读取在450nm的吸光度。第6图显示竞争性取代结合分析。稳定表达跨膜型TNF- α的NSO细胞与系列稀释的 adalimumab (▼)、etanercept (〇)及 EnbCS6hFc (.)在 4°C 培养 I 小时。加入饱和量的FITC标记的etanerc印t，再培养I小时。清洗细胞，以流式细胞技术定量已结合的FITC标记的etanercept。以无TNF-α拮抗物存在时，etanercept-FITC染色表达在跨膜TNF-α的NSO细胞之平均荧光强度定义为最大荧光强度的百分比抑制率。第7图显示以pH依赖的结合ELISA分析人类FcRn与TNF- α拮抗物的细胞结合分析。将FITC标记的KLH( O )、etanercept ( Λ )及EnbCS6hFc ( # )与稳定表达功能性人类FcRn的CHO细胞在pH7.2 (实线)或pH5.5 (虚线)的96孔盘4°C培养I小时。以相同缓冲液清洗细胞后，以微滴定盘读取器分析盘中的免疫荧光度。第8图显不小鼠体内etanercept、EnbCS6hFc及EnbCS6hFcM的药物动力。雄BALB/c鼠分别静脉注射50 μ g各TNF-α拮抗物。在不同时点纪录血液样品。残存在血浆中的各TNFa拮抗物的量以涂覆于ELISA盘的重组TNF α定量，使用辣根过氧化酶(HRP)-标记的山羊抗人类IgG Fe Y片段。结果为每一时点的3只动物的平均值。
第9图显示不同TNF-a拮抗物在L929细胞中TNFa媒介的细胞毒性的中和活性。将 L929 细胞与 2 倍系列稀释的 adalimumab (▼)、etanercept ( Δ ) > EnbCS6hFc ( # )及EnbCS6hFcM( O )分别于含有放射菌素(actinomycin D) (2 μ g/ml)及重组人类TNF-α (100ng/ml)的培养基中37°C培养16小时。细胞变化以MTT显色分析法分析。第10图显示关节炎小鼠模式中etanercept与EnbCS6hFc的效力。在发病时间(第O天)，每群小鼠每日分别给予腹腔注射100 μ I磷酸缓冲食盐水(未处理组)、etanercept (50 μ g)或 EnbCS6hFc (50 μ g)连续 10 天。比较未处理组(n = 2)、etanercept处理组(η = 4)及EnbCS6hFc处理组(η = 4)在处理过程中的关节炎级数。主要组件符号说明I 结合区域2 胶原蛋白区域3 Fe区域11 结合区域12 胶原蛋白区域13 Fe 区域31 TNF-α受体区域32 Fe 区域
具体实施例方式本案的发明策略之一为，诱导Fe片段形成三聚体分子的一端，形成三聚体Fe融合蛋白。由于三聚体Fe融合分子可在蛋白质A-共轭的树脂上有效地被纯化，更重要地，因为Fe结合至存在于血管内皮细胞的新生儿Fe受体(FcRn)，IgG分子的Fe片段具有延长的全身性半衰期。藉由结合于FcRn，IgG受到保护不被分解，并再生循环回到循环系统，使此分子存在于循环系统中的时间较长所以可同时解决纯化及药物动力的问题。形成三聚体Fe融合蛋白的方法`已有描述，可藉由Fe片段与不同的TNF同构型区域由N端向C端方向依序融合，之后在哺乳动物细胞中以分泌的融合蛋白表达(Muller，Wyzgol et al.2008 ；ffyzgol, Muller et al.2009)。TNF 同构型区域(TNF homologydomain ；THD)位于TNF配体家族的C端，负责TNF配体的三聚体聚合及其同源受体的结合。实验结果显示当Fe的N端与不同的THD融合时，Fe区域的二聚体聚合力会与不同的THD的三聚体聚合力彼此竞争，导致生产出二聚体、三聚体、六聚体的不同寡聚合型态。为了有效地形成均质的三聚体或六聚体Fc-THD融合蛋白，必须使用另外一个聚合力较强的三聚体，例如:将tenascin-C(TNC)的次级三聚体螺旋区域导入于Fe及THD区域之间，以稳定生产出均质-寡聚物结构。美国专利公开案US2005/0255547记载六聚体多肽可藉由TNF受体家族蛋白的细胞外区域与六聚体部分融合而聚成，此述六聚体部分可以是真实的六聚体，或者是”三聚体的二聚体”或”二聚体的三聚体”。然而，没有实例证实上述稳定的六聚体结构可以成功地聚合。因此，为了获得一主要且均质、含Fe片段的三聚体及/或六聚体融合分子，需要一新颖的三聚体聚合区域，用以克服Fe稳定的二聚体聚合力，形成稳定融合蛋白的三聚体聚合物。肽序列Gly-Pro-Hyp是最稳定且在胶原蛋白中常见的三联体(triplet),肽(Gly-Pro-Hyp):(!可在体外自我形成高度安定的三联体螺旋结构(ChopraandAnanthanarayanan 1982 ；Yang, Chan et al.1997)。短链胶原蛋白状的妝(Gly-Pro-Pro) 10过去被选用于驱动其单体融合对象的三聚体聚合作用，透过重组cDNA构建体在哺乳动物系统中表达(Fan，Huang et al.2008)。然而，实施例并未提及当稳定的二聚体区域，例如IgG Fe片段，导入其N端或C端时，(Gly-PiO-PiO)ltl是否仍可引发其融合对象在哺乳动物细胞中的三聚体聚合。为了有效地形成均质含Fe片段与(Gly-Pr0-Pr0) 10的三聚体融合蛋白聚合物，强化(Gly-Pro-Pro)ltl的三聚体聚合力用以克服Fe稳定的二聚体聚合力也许是一种选择。强化(Gly-Pr0-Pr0)ltl胶原蛋白-肽的三聚体聚合稳定度的方法可能有以下数种:(1)导入具有高度聚合能力的其它三聚体区域。例如原骨胶原蛋白(procollagen)的C-前肽、胶原凝集素(collectin)家族蛋白质的螺旋颈区域、FasL及卩遼菌体T4的fibririn三聚体聚合区域(foldon domain)的C端部分，或是使用前案tenascin-C(TNC)的次级三聚体螺旋区域；(2)增加Gly-Pro-Pro三联体(triplet)重复的数目。但是，人类血小板上的糖蛋白VI与交联的Gly-Pro-Hyp三联体肽的黏合随着其中所含有的Gly-Pro-Hyp的量而增加(Smethurst, Onley et al.2007),可能会引发血小板活化与血栓的隐忧；(3)力口入含有赖氨酸(lysine)等有关的胶原蛋白三联体序列,利用电稳定作用(electrostaticinteraction)方式来稳定胶原蛋白三聚体聚合力(Persikov,Ramshaw et al.2005)。文献曾经报道脂联素(adiponectin)分子结构中的胶原蛋白区域中有4个保守性的赖氨酸残基羟基化及糖基化基序(motif)，称为GXKGE(D)基序。多聚体聚合脂联素分子能有效的调节胰岛素敏感活性(Wang，Xu et al.2002)。而这些GXKGE (D)基序是脂联素能够形成多聚体聚合的重要因子(Richards, Stephens et al.2006)。但是，前述并未提及GXKGE (D)基序本身是否能强化(Gly-Pro-Pro) 10的三聚体聚合力用以克服Fe稳定的二聚体聚合力。另一方面，如果减弱Fe 二聚体聚合区域的聚合力，来获得一不稳定、甚至于单聚体的Fe片段,如此一来(Gly-Pro-Pro)ltl的三聚体聚合区域应该可以有效地形成均质含Fe片段与(Gly-Pro-Pro)ltl的三聚体融合蛋白聚合物。目前已知在两个IgG1Fc区域间有许多非共价的交互作用，这些交互作用足以维持二聚体而无需形成二硫键。关键残基的改变可减弱二聚体聚合的力量，导致单体的Fe区域的量增加。例如使用立体互补的”knobs-1nto-holes”突变重新设计抗体重链的策略,也可促使IgG的异质二聚体聚合作用(Ridgway，1996)。根据此策略，也可使用结构引导的噬菌体展示法以筛选出促进稳定的异质二聚体形成的Fe CH3区域的界面残基的组合(Shane Atwell, 1997)。先前的研究证实在CH3区域之T366S:L368A:Y407V突变可形成最稳定的IgG异质二聚体，因此显示出此突变具有二聚体聚合力较弱的Fe区域。因此，突变型Fe区域(FcM)与三聚体区域的融合可获得均质的三聚体FcM融合蛋白。

基于上述的认知，本案提出利用一段新颖的胶原蛋白区域来强化(Gly-PiO-PiO)η的三聚体聚合力，用以形成含有Fe片段的三聚体融合蛋白。本案所述之三聚体融合蛋白由三个相同结构的融合蛋白所聚合而成，每一个融合蛋白由N端向C端依序融合一结合区域(binding domain)、一胶原蛋白区域(collagenous domain)及一Fe 区域(Fe fragmantdomain)所构成(如第IA图所示)。此述的”结合区域”表示用于结合活性分子的区域，可例如受体或抗体，更具体地如TNF-α受体、抗-β-半乳糖苷酶的抗体等，但不限于此。本案所述之“胶原蛋白区域”为由(GPP)重复单元及GXKGE (D)基序(motif)所构成的多肽。具体地说，本案之胶原蛋白区域可为(GPP)n-GXKGE (D)基序_(GPP)m所表示之氨基酸序列，η及m表示5或以上的整数。此述”GXKGE (D)基序(motif) ”系指由 GEKGEKGDPGPKGDP 或 GEKGEKGDPGPKGDI 之氨基酸序列所构成的三级蛋白质结构。在透过GXKGE (D)基序与(GPP)重复单元形成(GPP) n-GXKGE (D)基序- (GPP) m的排列，当η及m值等于5或以上时(如表I所示)，各融合蛋白的胶原蛋白区域之间的三聚体聚合力开始大于Fe区域之间的二聚体聚合力，而形成稳定三聚体的融合蛋白。此述”Fe区域”表示来自人类IgGl的Fe片段的区域，因为人类IgGl的Fe片段本能上可稳定地形成二聚体。当形成上述三聚体融合蛋白时，由于Fe三聚体包含一个未配对的单体Fe片段，透过两个三聚体的未配对片段的分子间二聚体聚合，形成I个六聚体融合蛋白(如第IB图所示)。如后述的实施例所示，本案之六聚体融合蛋白对结合对象的亲和力远高于已知二价体etanercept亲和力的6倍以上。而且,在血中的半衰期与etanercept相当，表示Fe具有药物动力的提升之效果。更具体地说，本案之三聚体融合蛋白中的一多肽，可由序列识别号9、11或13其中之一所示的氨基酸序列所构成，或者由序列识别号10、12或14其中之一所示的核苷酸序列所编码的多肽所构成。本案一实施例中，结合区域由TNF-α受体所构成。因此在此实施例中，所形成的三聚体融合蛋白或六聚体融合蛋白可专一性且高亲和力地与TNF-α结合。因此，本案可进一步提供治疗与TNF-a相关之疾病的医药组合物，包括结合区域由TNF-a受体所构成之上述三聚体及/或六聚体融合蛋白。本案所述”与TNF- α相关之疾病”包括所有与TNF- α分泌增加有关之疾病或症状，没有特别限定 ，可例如退化性关节炎、类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎、干癣性关节炎、慢性幼年型关节炎、血管炎、发炎性肠炎或克罗恩氏病(Crohn' s disease)等疾病。本案之医药组合物除包含上述三聚体及/或六聚体融合蛋白作为活性成分外，可视需要添加医药上容许的载剂或添加剂。此述医药上容许的载剂或添加剂可例如赋形剂、抗氧化剂、乳化剂、分散剂、制菌剂、矫味剂、着色剂、缓冲剂、溶剂、pH调整剂、界面活性剂等。可制成的剂型包括锭剂、胶囊剂、膜衣锭、发泡剂、颗粒、粉末、悬浮液、糖浆等，透过口月艮、经皮肤投药、腹腔注射、静脉注射等路径投药。本案之优选实施例为口服投药。再者，本案之医药组合物可单独投药或者与其它药剂组合投药。投药的剂量可根据患者年龄、体重、健康状况、疾病种类、疾病的进展、患部等因素，由相关医疗人员依该技术领域中共通知识决定。相较于已知的二价etanercept,本案之三聚体融合蛋白因具有新颖的(GPP)n-GXKGE(D)基序_(GPP)m所示之胶原蛋白区域与Fe区域，可稳定地形成三聚体及六聚体，并可大幅增加与结合对象的结合强度，促进药效。其次，虽有报道胶原蛋白区域中的GXKGE(D)基序具有相当的三聚体聚合度，但本发明证实当含有Fe融合同时存在时，仅能形成二聚体的聚合体，并未稳定地形成三聚体或六聚体。再者，利用已知技术(Muller, Wyzgolet al.2008 ；ffyzgol, Muller et al.2009)教导将Fe区域融合于胶原蛋白支架复合物的N端，本发明实验结果发现该融合蛋白无法分泌于宿主细胞外的问题(表1，型态B)。根据本案发明，将Fe区域融合于胶原蛋白支架复合物的C端的设计，可有效地使蛋白质分泌于宿主细胞外，解决已知技术的难题。而且，由于Fe片段可利用蛋白A管柱层析法分离纯化，本案发明之三聚体融合蛋白克服已知三聚体胶原融合蛋白无法纯化的困难。本案更证实在酸性环境下，例如PH5.5，本案之六聚体Fe融合蛋白展现与人类新生儿FcRn受体优良的结合强度。药物动力分析亦证实小鼠体内静脉血液中三聚体Fe或六聚体Fe融合蛋白浓度测量值与etanercept相当。本发明之具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步公开本发明之技术内容，不应藉以限制本案的发明范畴。[实施例1]构建 EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc, EnbCS5hFc、EnbCS6hFc、EnbCS6hFcM 及 bGalCS6hFcEnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc, EnbCS5hFc、EnbCS6hFc 及 EnbCS6hFcM 各构建体的型态示意图如第IC图所示。(I)编码EnbCSFc的cDNA核苷酸序列如序列识别号2所示，经重叠PCR(overlapping PCR)制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体 pSecTag2/Hygro (Invitrogen)。EnbCSFc之氨基酸 序列(序列识别号I)，从N端向C端包括信号肽、TNF α RH细胞外区域、枢纽区、(GPP)ltl胶原蛋白状区域、第XXI型胶原蛋白的二硫键节(disulfide knot)(GKDPSLC)、及人类IgGl的CH2及CH3区域(如第IC图型态A)。(2)编码EnbhFcCS6的cDNA核苷酸序列如序列识别号4所示，经重叠PCR制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbhFcCS6之氨基酸序列(序列识别号3)，从N端向C端包括信号肽、TNF a RII细胞外区域、枢纽区、人类IgGl的CH2及CH3区域、结合子、及编码(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP)6肽序列的胶原蛋白状区域(如第IC图型态B)。(3)编码EnbCS4hFc的cDNA核苷酸序列如序列识别号6所示，经重叠PCR制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS4hFc之氨基酸序列(序列识别号5)，从N端向C端包括信号肽、TNF a RII细胞外区域、枢纽区、编码(GPP) 4-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 4肽序列的胶原蛋白状区域及人类IgGl的CH2及CH3区域(如第IC图型态C)。(4)编码EnbCS5hFc的cDNA核苷酸序列如序列识别号8所示，经重叠PCR制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS5hFc之氨基酸序列(序列识别号7)，从N端向C端包括信号肽、TNF a RII细胞外区域、枢纽区、编码(GPP) 5-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 4肽序列的胶原蛋白状区域及人类IgGl的CH2及CH3区域(如第IC图型态C)。(5)编码EnbCS6hFc的cDNA核苷酸序列如序列识别号10所示，经重叠PCR制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS6hFc之氨基酸序列(序列识别号9)，从N端向C端包括信号肽、TNF α RH细胞外区域、枢纽区、编码(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 6肽序列的胶原蛋白状区域及人类IgGl的CH2及CH3区域(如第IC图型态C)。(6)编码EnbCS6hFcM的cDNA核苷酸序列如序列识别号12所示，经重叠PCR制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。EnbCS6hFcM之氨基酸序列(序列识别号11)，从N端向C端包括信号肽、TNF α RH细胞外区域、枢纽区、编码(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGD1-(GPP) 6肽序列的胶原蛋白状区域及人类IgGl的CH2及带有3个点突变(序列识别号11之第Ser472、Ala474与Val513个氨基酸)之CH3区域(如第IC图型态D)。(7)编码bGalCS6hFc的cDNA核苷酸序列如序列识别号14所示，经重叠PCR制备。所得的PCR产物中NheI及BamHI限制酶切割位之间的片段，克隆于表达载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。bGalCS6hFc之氨基酸序列(序列识别号13)，从N端向C端包括信号肽、抗-β -半乳糖苷酶的Vh区域抗体、结合子、编码(GPP) 6-GEKGEKGDPGPKGDP- (GPP) 6肽序列的胶原蛋白状区域、枢纽区及人类IgGl的CH2及CH3区域(如第IC图型态Ε)。[实施例2]含胶原蛋白状的肽之Fe融合蛋白的表达与纯化将实施例1 构建的 EnbCSFc、EnbhFcCS6、EnbCS4hFc、EnbCS5hFc、EnbCS6hFc、EnbCS6hFcM、及bGalCS6hFc构建体,使用Effectene (Qiagen)根据其操作指示,转染至小鼠骨髓瘤(myeloma)NSO 细胞(European Collectionof Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)。以Hygromycin B (400 μ g/ml)筛选4周后,将稳定的克隆株(clone)培养于含2%胎牛血清之无血清化学定义培养基(chemically-defined medium) HyQCDM4NS0 (Hyclone)的摇瓶，起始的接种密度为5X105cells/ml。于37°C维持130rpm培养5天。将经过滤的培养基约每I公升加入HiTrap蛋白质A HP管柱(Inl柱床体积，GE Healthcare)，以pH 7.4磷酸缓冲食盐水(PBS) (0.0lM磷酸缓冲液、0.0027M KCl、0.14MNaCl)流速60ml/h平衡，以纯化上述含胶原蛋白状的肽之Fe融合蛋白。之后以相同缓冲液清洗后，以pH 2.5的50mM磷酸钠缓冲液洗脱重组抗体。监测280nm的UV吸收光谱，收集峰的分层，以1.0M碳酸氢钠中和至pH 7.5。进行SDS-PAGE，使用4 12 % NuPAGE双-三聚乙酰胺胶，以MES作为移动的缓冲液(Invitrogen, San Diego, CA)。蛋白质以 InstantBlue (Expedeon, Cambridgeshire, UK)染色，使用 HiMark and Bench Mark (Invitrogen, SanDiego, CA)作为分子体积标准。下列表I显示上述Fe融合分子的结果。EnbCSFc的型态A由TNF a RII的N端细胞外区域、(GPP)ltl胶原蛋白状肽及人类IgG1的Fe片段所构成，在小鼠骨髓瘤细胞NSO中表达为可溶性分泌蛋白。然而，在SDS胶中的主要型态在非还原状态时为二元体，显示Fe片段的二聚体聚合力强于(GPP)ltl胶原蛋白状肽区域与其融合蛋白的三聚体聚合力。为了获得主要的含三聚体Fe的融合分子，含有GXKGE (D)基序的肽序列GEKGEK⑶PGPKGDP之新颖三聚体区域，首先用于取代(GPP)ltl胶原蛋白基序。然而，串联的GXKGE(D)基序仍然形成含Fe的融合分子二聚体结构。因此，本案设计具有(GPP) n-GEKGEKGDPGPKGDP-(GPP) m序列之组合的胶原蛋白状肽，希望在稳定的二聚体Fe片段存在时，稳定地形成融合蛋白的三聚体聚合。如表I所示的型态C及E的不同结构，经由逐渐增加横跨于串联的GXKGE⑶基序的GPP三联体的重复数目，稳定的三聚体Fe融合蛋白开始较二聚体结构强势。由于Fe三聚体包含一个未配对的单体Fe片段，透过两个三聚体的未配对片段的分子间二聚体聚合，形成一个六聚体Fe融合蛋白。[表I]Fe融合 分子的结果
权利要求
1.一种三聚体融合蛋白，包含三条多肽，每一多肽由N端向C端依次融合一结合区域、一胶原蛋白区域及一Fe区域所构成，其中该胶原蛋白区域包括由三联体(GPP)重复单元及GXKGE(D)基序所构成的多肽氨基酸序列，X表示任意氨基酸。
2.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该胶原蛋白区域包括(GPP)n-GXKGE(D)基序- (GPP) m所示之氨基酸序列，η及m表示5或以上的整数。
3.如权利要求2所述的三聚体融合蛋白，其中该η表示5或6,m表示6。
4.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该GXKGE(D)基序包括由氨基酸序列GEKGEKGDPGPKGDP 或 GEKGEKGDPGPKGDI 所构成。
5.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该结合区域由受体或抗体所构成。
6.如权利要求5所述的三聚体融合蛋白，其中该受体包括TNF-α受体。
7.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该Fe区域包括人类IgGl的Fe片段。
8.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该三聚体融合蛋白中的每一多肽由序列识别号9、11或13其中之一所示的氨基酸序列所构成。
9.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该三聚体融合蛋白中的每一多肽由序列识别号10、12或14其中之一所示的核苷酸序列所编码的多肽所构成。
10.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该三聚体融合蛋白在酸性环境中与人类新生儿Fe受体具有结合亲和力。
11.一种六聚体融合蛋白，由权利要求1-10所述的三聚体融合蛋白经二聚体聚合所形 成。
12.—种治疗与TNF-α相关的疾病之医药组合物，包括至少一种如权利要求1-10所述的三聚体融合蛋白及如权利要求11所述的六聚体融合蛋白。
13.如权利要求12所述的医药组合物，其中，与TNF-a相关的疾病包括退化性关节炎、类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎、干癣性关节炎、慢性幼年型关节炎、血管炎、发炎性肠炎或克罗恩氏病(Crohn' s disease)。
全文摘要
本发明关于新颖的Fc融合蛋白，包含稳定融合蛋白的三聚体结构之新颖胶原蛋白基序。可溶性结合区域的寡聚合作用可作为改善标靶结合强度及有效地增加疗效，与降低剂量疗程。本案亦公开包含TNF受体家族的成员之医药组合物及其应用于急性及慢性免疫疾病的用途，例如风湿性关节炎。
文档编号A61P29/00GK103172746SQ201110454340
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月26日
发明者周民元, 邱伟钧, 赖雅萍 申请人:财团法人工业技术研究院