专利名称：一种化疗致血痹动物模型建立方法
一种化疗致血痹动物模型建立方法技术领域：
本发明属于医学研究领域，涉及一种动物模型的建立方法，即一种建立化疗致血痹动物模型的方法。
背景技术：
血痹病名出自《灵枢 九针论》。邪入血分而成的痹症。由气血虚弱，当风睡卧，或因劳汗出，风邪乘虚侵入，使血气闭阻不通所致。《金匮要略 血痹虚劳病脉证并治》:问曰血痹病从何得之？答曰夫尊荣人，骨弱肌肤盛，重因疲劳汗出，卧不时动摇，加被微风，遂得之。《诸病源候论》卷一“血痹者，由体虚邪入于阴经故也。血为阴，邪入于血而痹，故为血痹也。”证见身体不仁，肢节疼痛，脉微涩，尺脉小紧等。治宜益气和营，通阳行痹，用黄芪桂枝五物汤、当归汤、防风散等方。后世医家宗“同病异治，异病同治”之思想，临床在中医辨证以麻木、疼痛为主症的神经科疾病时均有研究，且易与常说的痹证相统一。钼类药物导致的外周感觉神经毒性具有遇冷空气或冰物刺激加重的特点，符合中医恶性肿瘤始于癌毒内生，根本源于正气不足，本虚标实贯穿于疾病的全过程，化疗药物乃大毒之品，往往有虚虚之弊，伤及人之阳气，造成元阳亏损，温煦不足，推动无力，阳气不能达于四末，阴血内虚不能充盈血脉，故遇寒则营血凝滞，遂出现手足麻木或疼痛。且故本病病机为正气不足，寒凝络脉，筋脉失养。属于“血痹”。奥沙利钼(oxaliplatin，0XA)是第3代钼类抗肿瘤药物，继顺钼、卡钼之后，目前作为胃肠道肿瘤化疗方案的基础用药之一。奥沙利钼有着高效、低毒的特性，受到临床医生的青睐。但该药有一定的副作用，主要靶器官在骨髓、外周神经及胃肠道。其治疗中所产生的外周感觉神经毒(Chemotherapy-induced peripheral neuropathy, CIPN)较为明显，可累及感觉神经末梢，故限制了奥沙利钼临床疗效的进一步发挥。初始时主要表现为肢体感觉障碍持续不退，随后可出现震荡感受降低、本体感受迟钝、精细分辨力减退、书写及扣钮扣等精细动作有困难等表现。但其与急性神经毒性不同，症状在冷刺激后不会加重。累积用药剂量越多，感觉障碍持续时间越长，故严重的神经毒性反应常常使患者面临减低化疗药物剂量甚至停药的困境，同时对患者的心理、生理和生活质量都可能产生损害。因此如何预防和减轻OXA的神经毒性已引起广泛关注。现奥沙利钼的慢性外周神经毒性机制尚不明确，可能的机制为脊神经后根神经节损伤，轴突神经病变，神经细胞凋亡及神经生长因子表达下调等。考虑到临床上奥沙利钼致慢性神经毒性的临床表现等事实，辩证后与血痹表现一致，使发明人想到建立化疗致血痹动物模型。正是基于上述事实和思路，本发明人考虑设计化疗致血痹的动物模型来研究其发生的机理，试图为临床防治化疗致血痹和研究其发病机理及化疗致血痹的临床药理试验提供理论依据。对于化疗致血痹建立，人们也进行过不少的探索。人们曾用WISTAR大鼠一次性腹腔注射奥沙利钼20mg/kg或36mg/kg观察O、12 h, l、2、3、7d的DRG变化，采用雄性昆明小鼠腹腔注射奥沙利钼3mg / kg的方法制备神经病理性痛模型，但都基于奥沙利钼的急性外周神经毒性的模型建立，造成的神经毒性有一定自限性，可及时缓解。因此迄今为止还没有一个令人满意的化疗致血痹的动物模型。基于以上现有技术和本发明人临床发现，模拟临床用药，反复多次使用奥沙利钼致一定剂量累积后，可建立化疗致血痹的模型，为探讨化疗致血痹的病理机制、研究治疗方法奠定基础、提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种建立化疗致血痹动物模型的方法，雌性WISTAR大鼠，腹腔注射给药奥沙利钼。在每周给药后24h观察并检测相关指标，进行模型筛选。本发明的目的还在于提供一种筛选化疗致血痹动物模型的方法，采用行为学测试评估小鼠的机械性痛觉超敏。作为本发明的实施方式，采用von Frey纤维细丝观察机械性缩足阈值(MWT)。 本发明我们选择大鼠作为实验对象，一方面基于大鼠实验较为方便，生理特性与人类也较相似，另外由于大鼠感觉较灵敏，做刺激研究、条件反射等实验反应良好，因此只要23天就可逐渐造成外周神经系统的损伤。从本实验结果来看，23天间MWT值逐渐下降，基本造模成功。化疗致血痹的动物模型的诊断目前尚无统一的标准。这主要是由于缺少理想的评价外周神经障碍的指标，使化疗致血痹动物模型难以建立，从而限制了其发展。发明人在实验中发现，MWT指标较为客观，有效的反映出外周神经的微小变化，可以作为评价模型外周神经毒性的理想指标之一。从大鼠脊髓中NR2B mRNA水平鉴定模型是否成功是一种新的尝试。本发明的实验的结果表明，它完全适合对化疗致血痹的进一步鉴定。从本发明结果来看，OXA累积使用32mg/kg后，NR2B水平明显升高，是正常水平的10倍左右。说明奥沙利钼使用后，NR2B蛋白合成速度加快，NR2B在脊髓的水平增多，疼痛中枢敏化激活升高，痛觉较前敏感，加速神经损伤。本发明发现DRG中pNF-H水平也可反映化疗致血痹模型建立是否成功。从本发明结果来看，OXA累积使用32mg/kg后,组织免疫组化示pNF_H免疫反应阳性细胞或产物数量减少，染色变淡，说明PNF-H水平减少，保护神经细胞作用减少，并减缓神经细胞修复作用。综上所述，奥沙利钼的累积剂量使用影响外周神经功能，且与病程直接相关。随着剂量的增加，慢性外周神经毒性程度越高。使用von Frey纤维细丝测MWT可筛选病例，通过观察DRG中pNF-H受体表达和脊髓中NR2B mRNA相对表达量可鉴定模型成功与否。我们建立的化疗致血痹动物模型，对进一步研究化疗致血痹的发生、发展和其病理，对于临床研究对化疗致血痹的防治及有关化疗致血痹治疗的临床药理试验都有一定的理论意义。
。图I大鼠体重变化。图2大鼠机械性缩足域值变化。图3大鼠脊髓NR2B mRNA的相对表达量RQ。图4大鼠DRG pNF-H的表达显微照片(A、B、C、D，100X ) PNF-H的神经元胞体染色(丨)，神经节神经纤维(一)。图A :对照组；图B :模型组。
具体实施方式。实施例I.使用的研究材料
(I)动物雌性WISTAR大鼠52只，体质量(190 ± 10 ) g，清洁级。(2)主要试剂及设备奥沙利钼，Von frey hairs疼痛触觉测试套件，上下流引物RatNR2B-F、RatNR2B-R,抗 p_NF_H(RT97)Mouse IgG 抗体。2.在以下实施例中采用的数据分析及统计方法
(I)MWT数据采用“ I 土6，”表示，显著性差异用“ t ”检验。(2) NR2B相对定量数据采用“ f ±s ”表示，显著性差异用“t”检验。实验组与对照组之间比较的所有统计结果，以P〈0. 05表示具有统计学意义，P〈0. 01表示具有显著性统计学意义。
实验动物的准备以及动物模型的制备
所有雌性WISTAR大鼠饲养于安静、通风和空气过滤系统的环境中，保持室温20-25°C，相对湿度40%-60%，自由进食和饮水。为保持动物昼夜生物节律，实验室每日8 :00至20 00开灯，20 00至次日8 00熄灯。所有19只雌性WISTAR大鼠随机分为A、B 二组，A、B两组随机分为对照组8只，模型组11只。适应性饲养一周后，模型组腹腔注射给药奥沙利钼4mg/kgd8/9/15/16/22/23/29/30。大鼠每3日称体重，每日观察大鼠给药后反应、饮食、大便；每周MWT测定。机械性痛觉超敏以机械性缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)来评估大鼠的机械性痛觉超敏。方法是用von Frey纤维细丝(折力梯度分别为I. O、I. 4,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. 0,15. Og)以 up—down 法推算缩足阈值将一有机玻璃箱(22X 12X22) cm0置于金属筛网上，待大鼠在有机玻璃箱中适应15 min后处于静止时，用von Frey纤维细丝垂直刺激大鼠一侧后肢足底中部，持续时间< 4S，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定时首先从折力2. Og开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应时，则给予相邻大一级力度的刺激；若出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，每个折力的von Frey纤维细丝均连续测定5次，每次刺激间隔30S，5次当中有3次或3次以上的阳性反应视为有机械痛敏，最大力度为15g，大于此值时记为15g。折合成(4. 08,4. 17,4. 31,4. 56,4. 74,4. 93、5. 07、5. 18)计算统计。结果对照组体重随时间平稳上升，开始造模D8后模型组与对照组相比差异有显著统计学意义(P〈0. 01)。见表1，图I。对照组的机械性缩足阈值趋于稳定。开始造模DlO后模型组出现明显触诱发痛，表现为机械性缩足阈值与基础值和空白组相比明显下降(P〈0. 05)。见表 2，图 2。表I大鼠体重变化表(g) ( X 土 s)
_Dl_D8_D14_D21_D28_D35_D43_D49_
对照组(n=8) 193. 13±11. 13 205. 00±11. 33 208. 38±12.93 217. 12±12.47 222.63±12.58 233. 38±14. 54 241. 13±14. 88 243. 25±15. 57模型组(n=ll) 186.45±8.00 199.45±7.74 194.09±9.55* 189.45±9.75* 193. 45± 11. 32* 192. 64± 11. 84* 202. 64± 11. 20* 197. 09±13. 23*
与空白组相比，*P〈0. 01 表2大鼠机械性缩足阈值变化(_x 土s).o+lge 寸 I *91 .O+IOK 寸 I .0+lgl-o.寸 I *do+ls.寸I *91 .0+I8Z 寸 | .0+186 寸 | 90 .0+leT .SI OT .0+loT .SI (TT=U)F^igg
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权利要求
1.一种化疗致血痹动物模型建立方法，其特征在于选择正常WISTAR大鼠，按大鼠重量4mg/kg予以浓度为4g/L奥沙利钼注射液腹腔注射，按照大鼠重量予以腹腔注射奥沙利钼。
全文摘要
本发明公开了一种建立化疗致血痹模型的方法，包括选择正常大鼠，腹腔注射给药奥沙利铂模拟临床用药，用药过程中进行检测，及造模结束后予以分子生物学鉴定。本发明建立的化疗致血痹的动物模型，方法简便，效果明显，为研究化疗致血痹的病理机制、研究治疗方法及临床新药开发及药物验证提供了必要依据。
文档编号A61K31/282GK102743372SQ20121022644
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月30日 优先权日2012年6月30日
发明者曹鹏, 王小宁, 胡春萍, 胡莹, 霍介格 申请人:江苏省中医药研究院