一种调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂的制作方法
【专利摘要】本发明属中药领域，涉及调控胰腺癌干细胞的中药制剂，该中药复方制剂适用于在胰腺癌治疗过程中对胰腺癌干细胞的控制。本发明根据我国传统中医药湿热毒蕴病机理论，针对胰腺癌“湿热”和“热毒”的病理特点，以“清热化湿，散结解毒”为组方原则，选取蛇六谷、半枝莲、白花蛇舌草、绞股蓝、白豆蔻、生米仁和灵芝七味药物制成。经动物实验证实，本发明对SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠的瘤体有明显的抑制作用，调控瘤体内胰腺癌干细胞的分化。与吉西他滨合用，明显增强抑瘤作用，同时调控肿瘤干细胞的分化。
【专利说明】一种调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂
【技术领域】
[0001]本发明属中药领域，涉及调控胰腺癌干细胞的中药制剂，该中药复方制剂适用于在胰腺癌治疗过程中对胰腺癌干细胞的控制。
【背景技术】
[0002]肿瘤干细胞(CSC)是肿瘤组织中小部分具有自我更新和多向分化的细胞亚群，它决定着肿瘤的形成和发展。换而言之，即使体内残存了极小部分CSC，都会因其高致瘤性而诱发肿瘤的复发和远处转移，最终导致治疗失败，疾病进展，甚至死亡。因此，CSC与肿瘤不良预后有着非常密切的联系。
[0003]CSC与肿瘤预后的相关性已被大量临床研究所证实。Hisae等研究证实结肠癌B期或C期患者外周血肿瘤干细胞标记CEA/CK/⑶133阳性往往提示预后不佳，与CEA/CK/⑶133阴性患者相比，总生存率明显降低，无病进展期明显缩短。Al-Hajj等对乳腺癌患者进行研究，发现CD44+/CD24-乳腺癌干细胞早期就可以在转移性胸腔积液中检测到，并且多数早期扩散至骨髓的乳腺癌细胞都具有肿瘤干细胞的表型特征，与此同时，乳腺癌中CD44+细胞比例升高与不良预后相关。急性髓性白血病中，确诊时较高的肿瘤干细胞比例多预示治疗后较多的微小残余癌细胞和较差的预后。
[0004]针对CSC的治疗策略可改善肿瘤患者生存预后，是未来治疗进展的突破口。如靶向治疗药物伊马替尼对分化活跃和成熟的白血病细胞效果较好，但对处于静止状态，未分化的肿瘤干细胞的作用较差，治疗后仍多见复发，联合针对CSC自我更新和多向分化相关的Hedgehog信号通路抑制 剂的药物可能消除伊马替尼治疗引起的耐药和复发。靶向治疗药物曲妥珠单抗对乳腺癌干细胞也发挥作用，具有减少体外克隆球形成，可以使得转移性乳腺癌患者的生存期延长I年左右。局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗后，⑶44+/⑶24-/lOW乳腺癌CSC比例较化疗前明显升高，而针对EGFR的靶向药物拉帕替尼治疗后，CSC比例却较化疗前下降，患者生存期与肿瘤干细胞变化明显相关。
[0005]中医药治疗恶性肿瘤具有增效减毒、缓解症状、改善生活质量、延长生存期的作用，临床常表现为患者长期带瘤生存，这常是中药治疗的优势所在。胰腺癌的预后极差，5年生存率一直徘徊在5%左右。近10年的中西医综合治疗晚期胰腺癌显示出了明显的优势，5年生存率可达8.4%，中位生存期7.6月，疗效明显优于目前国内外同类研究先进水平，其中16例患者获得3年以上长期带瘤生存(5例生存超过5年)，至今仍然存活良好，这在国内外均属罕见。由此可见，中药制剂在维持晚期肿瘤患者长期带瘤生存方面有很大的优势，可能与调控胰腺癌干细胞的功能有关。
[0006]鉴于此，通过临床经验总结及实验研究，探索出一种调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂显得尤为重要。
【发明内容】
[0007]为了弥补上述药物和敷料的不足，发明人经过多年的研究，根据我国传统中医药湿热毒蕴病机理论，针对胰腺癌“湿热”和“热毒”的病理特点，以“清热化湿，散结解毒”为组方原则，提出一种能够对抑制胰腺癌有很好的疗效，通过调控胰腺癌干细胞发挥作用的调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂。
[0008]本发明的复方制剂采用中药材或所述中药材的提取物:蛇六谷、白花蛇舌草、半枝莲、绞股蓝、白豆蘧、生(或炒)米仁、灵芝配制而成，其中:
[0009]半枝莲:清热解毒、利湿消肿为君
[0010]白花蛇舌草、蛇六谷:清热解毒、化痰散积为臣；
[0011]绞股蓝、生(或炒)米仁、灵芝:化湿健脾、扶助正气、提高机体的免疫功能，增强患者自身的防癌、抗癌能力，为佐；
[0012]白豆蘧:化湿和胃、行气宽中为使；。
[0013]诸药合用，发挥清热化湿、解毒化积之功效。
[0014]本发明制剂的各组分按下述重量比的中药材或所述中药材的提取物制备:
[0015]半枝莲15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~300g、绞股蓝30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、灵芝10~300g。
[0016]本发明中药复合制剂可采用以下两种方法制备:
[0017]制备工艺1:
[0018]将上述中药组分的中药材根据病情按比例用量置于锅中，第一次按中药组分总重8倍加水，加热煎煮2小时，得一煎液；第二次按中药组分总重6倍加水，加热煎煮I小时，得二煎液。然后将一煎液和二煎液合并，采用文火蒸发浓缩至稠厚状。再加入95%的等量乙醇，充分混匀，放置过夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸馏回收乙醇，浓缩后静置24小时，使沉淀完全过滤，滤液再浓缩至稠厚状(比重为1.32/25°C)。取浓缩膏1份，干燥蔗糖粉3份，糊精1.25份，用70%乙醇调整干湿度，然后用颗粒机12目筛制成颗粒，将湿颗粒置低温干燥处，使其干燥，包装后即可。
[0019]或，制备工艺2:
[0020]将所述中药组分中的7味药材饮片，先分别单独分两次煎煮，经滤过、浓缩、喷雾干燥、加适量麦芽糊精、粉碎混匀后制成中间体(制成颗粒)，最后将等量7味中药材的所述的中间体混合均匀，制粒，得成品；
[0021 ] 其中，分别制备组分中的7味药材饮片的中间体(制成颗粒)，
[0022]1、半枝莲15000g，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0023]2、白花蛇舌草15000g，加水煎煮二次，每次I小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加入麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒1000g，得所述的中间体；
[0024]3、蛇六谷lOOOOg，加水煎煮二次，第一次I小时，第二次I小时，合并煎液，滤过，滤
液浓缩至相对密度为1.10~1.12 (60°C)的清膏，喷雾干燥，加入麦芽糊精适量，混匀，制粒，干燥，制成颗粒1000g，得所述的中间体；
[0025]4、取生(炒)米仁20000g，加水煎煮二次，一煎I小时，二煎0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0026]5、绞股蓝lOOOOg，加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0027]6、灵芝12000g，加水煎煮二次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0028]7、豆蘧配方颗粒制备工艺:取豆蘧lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成1000g颗粒，得所述的中间体；
[0029]最后将等量7味中药材的所述的中间体混合均匀，制粒，得本发明的复方制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为实验设计思路示意图。
[0031]图2为本发明作用于SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠瘤体生长曲线示意图。
[0032]图3为本发明作用于SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠体重的变化示意图。
[0033]图4为本发明及其他治疗组干预SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠后瘤体照片。
[0034]图5为本发明对胰腺癌干细胞的调控作用示意图。
[0035]图6为本发明对胰腺癌干细胞的调控作用示意图。
[0036]图7为本发明干预后胰腺癌干细胞相关标志物mRNA水平的变化示意图。
[0037]图8为各中药组分的制备工艺流程图。
【具体实施方式】
[0038]实施例1
[0039]按下述重量比的中药材或所述中药材的提取物制备中药复方制剂:
[0040]半枝莲15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~300g、绞股蓝30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、灵芝10~300g。
[0041]将上述中药组分的中药材根据病情按比例用量置于锅中，第一次按中药组分总重8倍加水，加热煎煮2小时，得一煎液；第二次按中药组分总重6倍加水，加热煎煮I小时，得二煎液。然后将一煎液和二煎液合并，采用文火蒸发浓缩至稠厚状。再加入95%的等量乙醇，充分混匀，放置过夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸馏回收乙醇，浓缩后静置24小时，使沉淀完全过滤，滤液再浓缩至稠厚状(比重为1.32/25°C)。取浓缩膏1份，干燥蔗糖粉3份，糊精1.25份，用70%乙醇调整干湿度，然后用颗粒机12目筛制成颗粒，将湿颗粒置低温干燥处，使其干燥，包装后即得本发明中药复合制剂。
[0042]实施例2
[0043]将所述中药组分中的7味药材(饮片)半枝莲、蛇六谷、白花蛇舌草、绞股蓝、白豆蘧、生(炒)米仁、灵芝，先分别单独分两次煎煮，经滤过、浓缩、喷雾干燥、加适量麦芽糊精、粉碎混匀后制成中间体(制成颗粒)，最后将等量7味中药材的所述的中间体混合均匀，制粒，得成品；[0044]其中，分别制备组分中的7味药材(饮片)的中间体(制成颗粒)(如图8所示)，
[0045]1、半枝莲15000g，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0046]2、白花蛇舌草15000g，加水煎煮二次，每次I小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加入麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒1000g，得所述的中间体；
[0047]3、蛇六谷10000g，加水煎煮二次，第一次I小时，第二次I小时，合并煎液，滤过，滤
液浓缩至相对密度为1.10~1.12 (60°C)的清膏，喷雾干燥，加入麦芽糊精适量，混匀，制粒，干燥，制成颗粒1000g，得所述的中间体；
[0048]4、取生(炒)米仁20000g，加水煎煮二次，一煎I小时，二煎0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒1000g，得所述的中间体；
[0049]5、绞股蓝lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0050]6、灵芝12000g，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体；
[0051]7、豆蘧配方颗粒 制备工艺:取豆蘧lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成1000g颗粒，得所述的中间体；
[0052]最后将等量7味中药材的所述的中间体混合均匀，制粒，得本发明的复方制剂。
[0053]实施例3本发明对SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠瘤体有明显的抑制作用
[0054]1.SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠模型建立:取生长良好的SW1990胰腺癌细胞，调整浓度为107/ml的SW1990单细胞悬液。在无菌条件下，用Iml注射器接种于裸鼠左腋下皮下，接种量为0.2ml/只，共48只。随机分为对照组10只、SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠模型组38只。将SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠模型组50只裸鼠经75mg/Kg浓度的吉西他滨腹腔注射dl，d5，d9干预3次后，处死对照组及10只SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠模型组裸鼠，取瘤。将剩余28只SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠模型组裸鼠随机分为生理盐水组、吉西他滨组、本发明组、吉西他滨+本发明组，每组7只。各组分别继续干预4周后，处死取瘤。
[0055]药物干预:
[0056]生理盐水组:生理盐水，每次灌胃0.1ml，每天I次。
[0057]本发明组方:由半枝莲15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~300g、绞股蓝30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、灵芝10~300g组成，按《中药药理研究方法学》人鼠等效剂量进行剂量换算，成人体重以60kg计算，小鼠体重以20g计算，清胰化积方为155g/帖/人/日，则人鼠等效剂量为36g/kg/只/日，浓缩为每毫升含生药
3.6g/ml的药液，置于4°C冰箱保存，每次灌胃0.2ml，每天I次。[0058]吉西他滨组:吉西他滨注射液(LILLY FRANCES,剂型:200mg/支)，每只小鼠按50mg/kg,0.2ml/次,第 1,8,15 天腹腔注射；
[0059]吉西他滨+本发明组:吉西他滨给药方式同上，本发明给药方式同上。
[0060]2抑瘤作用实验
[0061]2.1肿瘤生长曲线
[0062]造模后第7天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量其长径㈧和垂直横径⑶，之后每周测量一次。按公式v=0.52XAXB2计算肿瘤体积，描绘肿瘤体积增长曲线。
[0063]2.2抑瘤率
[0064]脱颈处死，剥离瘤块，称取瘤重,计算抑瘤率:抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重一治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重X 100%。结果显示，本发明对SW1990胰腺癌干细胞荷瘤小鼠瘤体有明显的抑制作用，与生理盐水组比较有显著性差异(P〈0.05)。见图5。
[0065]实施例4本发明对胰腺癌干细胞的调控作用
[0066]l.ffestern blot法检测本发明干预后胰腺癌干细胞相关标志物蛋白水平的变化Western blot组织总蛋白的制备及浓度测定:取IOOmg肿瘤组织,充分研磨，PBS洗漆离心沉淀，5倍体积4% SDS重悬、搅匀，沸水浴中加热10分钟，反复吹打剪切，室温1000Orpm离心10分钟，上清液移至另一管，即为提取好的蛋白质，Lowry法检测蛋白质浓度，从标准曲线上读出抽提蛋白质对应的吸 光值和浓度。Western blotting:固定:蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从凝胶上转移到PVDF膜上；封闭:取下PVDF膜，在盛有封闭液的玻璃平皿中室温平缓摇动I~2小时后，4°C过夜；与第一抗体结合；与第二抗体结合；显色:将PVDF膜放入检测缓冲液中平衡5分钟，在2ml检测缓冲液中加入40 μ I底物，按膜面积
0.1ml/cm2的量加人玻璃平皿中，放入PVDF膜，放入塑料袋中，并塑封，暗中显色lh，弃去显色液，将膜用TE洗涤2次，在TE中浸泡。观察并分析实验结果。
[0067]结果表明本发明干预胰腺癌干细胞后肿瘤干细胞相关标志物⑶24，⑶44，ALDH1A1，⑶133，0CT4, Nanog, S0X2等在蛋白水平有不同程度的下降。见图6。
[0068]2.Real-time PCR法检测本发明干预后胰腺癌干细胞相关标志物mRNA水平的变化总RNA的提取:参照GENERAY公司总RNA抽提试剂盒(Trizol-离心柱型)使用说明进行RNA抽提后，取I μ I RNA溶液，用双蒸水稀释至100 μ 1，经紫外分光光度仪检测其0D260及0D280并计算其RNA浓度(C = 0D260X40X稀释倍数X 10 — 3，单位:μ g/μ I);用DEPC水调整RNA浓度至I μ g/ μ 1，置一 70°C冰箱保存。逆转录合成cDNA (RT):具体操作参照Fermentas^RevertAidTM^irst strand cDNA synthesis Kit，，，_20oC保存。SYBR GREEN法实时半定量 RT-PCR:realtime PCR 反应体系:SYBR premix (2x) 12.5ul，上游引物(IOumol/L) 0.5ul，下游引物(10umol/L) 0.5ul，模板 cDNA2.0ul，DEPC 水 9.5ul,总体积 25ul。PCR反应条件:95°C热启动15分钟之后，94°C变性30秒，53°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，共40个循环，至4°C结束。
[0069]P0U5F1 (0CT4)引物 F:5，-GAGCAACTCCGATGGGGCCT-3，
[0070]R:5’-TGTCCTGGGACTCCTCCGGGT-3’
[0071 ] Nanog 引物 F: 5，-GCAATGGTGTGACGCAGAAGGC-3，
[0072]R:5’-TGGGTCTGGTTGCTCCAGGTTG-3’
[0073]S0X2 引物 F: 5，-GGGGGAAAGTAGTTTGCTGCCTCT-3’[0074]R:5’-TGCCGCCGCCGATGATTGTT-3’
[0075]GLII 引物 F: 5，-AGGGAGTGCAGCCAATACAG-3’
[0076]R:5’-ATTGGCCGGAGTTGATGTAG-3’
[0077]结果表明本发明干预胰腺癌干细胞后肿瘤干细胞相关标志物0CT4, Nanog, S0X2, GLIl等在mRNA有不同程度的下降(如图7所示)。
【权利要求】
1.一种调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂，其特征在于:由下述重量比的中药材或所述中药材的提取物及药物辅料组成:半枝莲15~300g、蛇六谷10~200g、白花蛇舌草10~.300g、绞股蓝30~300g、白豆蘧5~100g、生(炒)米仁30~300g、灵芝10~300g。
2.权利要求1所述的调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂的制备方法，其特征在于:所述中药组分按重量比用量置于锅中，第一次按中药组分总重8倍加水，加热煎煮2小时，得一煎液；第二次按中药组分总重6倍加水，加热煎煮I小时，得二煎液，然后将一煎液和二煎液合并，采用文火蒸发浓缩至稠厚状，再加入95%的等量乙醇，充分混匀，放置过夜，使其沉淀，次日取其上清液，蒸馏回收乙醇，浓缩后静置24小时，使沉淀完全过滤，滤液再浓缩至稠厚状，比重为1.32/25°C，取浓缩膏1份，干燥蔗糖粉3份，糊精1.25份，用70%乙醇调整干湿度，然后用颗粒机12目筛制成颗粒，将湿颗粒置低温干燥处，使其干燥，包装后即得。
3.权利要求1所述的调控胰腺癌干细胞的中药复方制剂的制备方法，其特征在于:将所述中药组分中的7味药材饮片，先分别单独分两次煎煮，经滤过、浓缩、喷雾干燥、加适量麦芽糊精、粉碎混匀后制成颗粒中间体，最后将等量7味中药材的所述的中间体混合均匀，制粒，得成品； 其中，分别制备组分中的7味药材饮片的颗粒中间体， 半枝莲15000g，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为.1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体； 白花蛇舌草15000g，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加入麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体； 蛇六谷lOOOOg，加水煎煮二次，第一次I小时，第二次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10~1.12 (60°C)的清膏，喷雾干燥，加入麦芽糊精适量，混匀，制粒，干燥，制成颗粒1000g，得所述的中间体； 取生(炒)米仁20000g，加水煎煮二次，一煎I小时，二煎0.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒1000g，得所述的中间体； 绞股蓝lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为.1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体； 灵芝12000g，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为.1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成颗粒lOOOg，得所述的中间体； 豆蘧配方颗粒制备工艺:取豆蘧lOOOOg，加水煎煮二次，每次I小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.10-1.12 (600C )的清膏，喷雾干燥，粉碎，加麦芽糊精适量，混匀，制成1000g颗粒，得所述的中间体； 最后将等量7味中药材的所述的中间体混合均匀，制粒，得本发明的复方制剂。
【文档编号】A61K9/16GK103800731SQ201210437189
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2012年11月5日
【发明者】刘鲁明 申请人:复旦大学附属肿瘤医院