专利名称：用于治疗骨质疏松和血栓的OGP-AcAP5融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。
背景技术：
老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织(WHO)的标准，美国国家健康和营养调查(NHANES III，1988 1994年)结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的
7.I %。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到
2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995 1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。而对于老年人其凝血系统又有其特殊性，老年人纤维蛋白原(FIB)含量、组织型纤溶酶原激活物增加以及纤溶酶原激活物抑制剂复合物的增加都导致老年人的高凝状态，所以更容易形成血栓；其中研究发现绝经期后的女性的血栓发生率远高于男性。对于老年人骨质疏松和血栓已成为常见多发病，且往往同时存在。如果患者服用多种药物同时治疗骨质疏松和血栓，容易产生药物拮抗反应；若要错开服药时间一方面要靠考虑药物的半衰期，另一方面还要考虑药物有效浓度，而且给患者造成不便。目前缺乏一种可以同时有效治疗骨质疏松和血栓的药品。
发明内容
本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和血栓药品的缺陷，而提供的一种用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。本发明用于治疗骨质疏松和血栓的0GP_AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。本发明上述用于治疗骨质疏松和血栓的0GP_AcAP5融合蛋白的核酸序列如SEQ IDNO 1所示。本发明用于治疗骨质疏松和血栓的0GP_AcAP5融合蛋白含有成骨生长肽(OGP)和犬钩虫抗凝血肽(AcAP5)，共94个氨基酸，成骨生长肽和犬钩虫抗凝血肽之间用GlyThr相连接。本发明用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-ACAP5融合蛋白可同时治疗骨质疏松和血栓,适合同时患有这两种疾病的患者使用。本发明用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于治疗骨质疏松和血栓的0GP_AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本实施方式用于治疗骨质疏松和血栓的0GP_AcAP5融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1所示，该核酸序列由生物工程公司合成，制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC(0GP/AcAP5)。将pUC(0GP/AcAP5)载体用BamH I和EcoR I双酶切出来(酶切反应体系如表I所示)，并用BamHI和EcoR I双酶切pGEX_6P_l (酶切反应体系如表2所示);再将本实施方式用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白的DAN片段(0GP/AcAP5)与 经过双酶切的载体PGEX-6P-1的连接(连接反应体系如表3所示)。表I
~pUC (OGP/AcAP5)20 μ —
IOxMbuffer6μ1BamHI3μ1 —
EcoR I3μ1
"^含 DNA 酶的 ddH2028μ1表2
载体 pGEX-6P-l20 μ '
IOxM buffer6μ1Bamm3μ1 '
EcoR I_3μΙ_
"^含 DNA 酶的 ddH2028μ1表3
双酶切的载体pGEX-6P-l3μΙ
_] 融合蛋白的DNA片段13μ1 —
I 10xT4 DNA 连接酶 buffer2μ1
IΤ4 DNA 连接酶2μ1 ~~融合蛋白的DAN片段与载体pGEX-6P-l 16°C放置连接过夜，得到载体pGEX_0GP/AcAP5 ;然后将载体pGEX-0GP/AcAP5转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，选择阳性重组子命名为大肠杆菌 BL21 (DE3-0GP/AcAP5)。载体pGEX-6P-l上不含有KpnI酶切位点，本实施方式合成的pGEX_0GP/AcAP5均能为Kpn I单酶切开，说明本实施方式用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白基因成功导入质粒PGEX-6P-1中。然后将质粒pGEX-0GP/AcAP5导入大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性克隆。随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)菌落37 °C过夜培养，提取质DNA，用KpnI进行单酶切，并用相应的空白质粒pGEX_6P_l作为对照，将含有KpnI酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21(DE3-0GP/AcAP5)内含有 SEQ ID NO 1 所示 DNA。将大肠杆菌BL21 (DE3-0GP/AcAP5)置于LB培养基28°C培养15h，然后采用GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白的纯度为98%,融合蛋白表达量为38%。本实施方式融合 蛋白(0GP_AcAP5融合蛋白)治疗骨质疏松实验取雌性SD大鼠，无菌条件下摘除双侧卵巢，阴性对照组切除双侧一小块脂肪。5天后取存活健康大鼠32只，随机分为4组，每组8只，分别口服一下药物阴性对照组(control):质量浓度为O. 5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；模型组(model):质量浓度为O. 5%的0GP_AcAP5融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg ；(获得的用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白用无菌水溶解)阳性对照组I :阿仑膦酸钠(Alen) 5mg/kg。阳性对照组2 :质量浓度为O. 5%的OGP蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头8只，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表4，结果表明模型组、阳性对照组I和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用，且模型组的效果最好。表4骨小梁宽度的比较和骨面积(X土SD)
权利要求
1.用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-ACAP5融合蛋白，其特征在于用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.编码权利要求I用于治疗骨质疏松和血栓的0GP-AcAP5融合蛋白的核酸，其特征在于该核酸的序列如SEQ ID N0:1所示。
全文摘要
用于治疗骨质疏松和血栓的OGP-AcAP5融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸，它涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和血栓药品的缺陷。用于治疗骨质疏松和血栓的OGP-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。该融合蛋白核酸的序列如SEQ ID NO1所示。本发明可用于医药领域。
文档编号A61P19/10GK102924607SQ201210477458
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者余琼, 刘祺 申请人:黑龙江大学