专利名称：一种冰致微结构软体组织的制备方法
技术领域：
:本发明涉及一种用于体内器官替换的人工器官软体组织的制备方法，该方法是一种组织工程三维软体组织的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
:世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人数逾千万，仅美国每年以外科手术治疗此类病人约800万。然而，解决这一问题最有效的方法是对缺损器官进行人工替代。而人工替代生物主要途径有以下两个:一是采用自体或异体器官移植，然而，供体的匮乏和排斥反应一直制约着组织器官移植；二是采用人工器官。传统的人工器官常用金属、陶瓷或高分子材料制作。由于这种人造器官的内部结构、生物活性和可降解性方面的不完备性，替代效果不甚理想，不能防止患者的病情进一步恶化。为了克服这些局限，组织工程为体外培养活体组织器官提供了可能，它有望恢复人体器官组织更多的生化功能，基于此目的，提出了一种冰致微结构软体支架的制备方法。由于不同的器官都具有特定的内部微结构，故根据个体差异制备不同特定组织结构器官软体支架是对现有人工器官制备的创新和探索。发明专利CN102525688A公开了一种同时具有内部微结构和个性化外形的组织工程支架的制造方法，该方法首先用三维立体蜡型打印机打印多孔结构的负型；然后将具有自凝或热凝特性的生物材料用溶液或生理盐水均匀成浆状，灌入多孔结构支架负型的孔中，冷却凝固，并将支架表面多余的生物材料刮去；最后将灌注后的支架负型置入加热炉中加热至高于支架蜡型的熔点温度，持续加热至石蜡熔化消失，并用生理盐水对其进行冲洗，从而得到同时具有内部微结构和个性化外形的组织工程支架。该方法的优点是:具有较广的生物材料适应性、内部微结构可控，可实现同时具有内部微结构和个性化外形的组织工程支架的制备。但是该方法仍然存在如下问题及不足:首先，需要设计及制造支架结构负型，延长了支架的制作时间，提高了成本；其次，支架需要经过高温处理，这无形就增加了生物支架的污染几率；最后，该方法不能用于制备人工器官的软体支架。公开号为CN101219240A的发明专利公开了一种带通道的活体组织的制备方法，该方法首先将弹性高分子材料溶于有机溶剂，将细胞基质材料加入细胞冻存液；把选定的细胞与含冻存液的细胞基质材料溶液混合均匀；用计算机设计带管道的活体组织模型，根据离散堆积-原理，利用快速成型设备按照计算机模型结构所规划的路径，将上述弹性高分子材料溶液、细胞-基质材料溶液的混合物通过不同的喷头积压货喷射出来，形成带管道的弹性高分子材料、细胞基质材料的杂合体。然后在低温下冷藏活在液氮中长期冻存，复苏后可直接由于组织或 器官的修复。该方法的优点是:有效避免了细胞在组装后若不及时使用就会出现坏死的现象，同时该方法也克服了所组装的细胞-材料三维结构力学性能较差的缺陷。但是该方法仍然存在如下问题及不足:该方法所制备的活体组织，其内部的三维通道结构并不能得到完全的满足，因为在内部通道结构还没有定型之前其还不能承受负载作用，故实际制备过程中的通道结构与预先设计好的三维通道结构还存在很大的差异；此外通道直接成型还存在一定的难度，软体支架内部通道对通道尺寸有一定的要求
发明内容
:为了克服现有技术不能制备具有特定内部微结构的器官软体组织的要求，本发明提出了一种冰致微结构软体组织支架的制备方法。本发明采用的技术方案是:一种冰致微结构软体组织的制备方法，首先运用计算机设计好具有软体组 织通道网状微结构的模型，然后利用增材制造技术制备具有通道微结构的树脂模具，并往树脂模具中灌注纯水冷冻后剥离，从而得到具有通道微结构的冰致模具；最后在低温下往此冰致模具体系中灌注预先配置好的具有组织活体细胞、生长因子等的PVA水凝胶，待其稳定成型后，将其放置于5 10C°的环境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，最终所获得的软体支架就是具有微通道结构的软体组织支架。该方法具体包括以下步骤:步骤1、运用计算机设计好具有软体组织通道网状微结构的模型； 步骤2、将步骤I所构建的模型数据输入到快速成型机，并利用快速成型技术制造具有通道微结构的树脂模具；步骤3、往步骤2所得的树脂模具中灌注满纯水，并在_5'10C°低温环境下进行冷冻后，将树脂模具剥离，从而得到通道微结构的冰致模具；步骤4、取用病患个体的器官组织细胞进行培养，细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中每IOOml培养液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/链霉素，经过多次传代达到需求数量，使用前用胰酶消化，并加入DMEM细胞培养液从而制备出具有特定细胞密度的细胞悬浮液；步骤5、根据临床需求取具有特定PVA浓度的PVA水溶液，并将该溶液与步骤4所得到的组织细胞悬浮液按一定体积比均匀混合，温度控制在oc° ;步骤6、将步骤5所得到的混合液与适量5%浓度的三磷酸钠水溶液混合均匀，以使水凝胶发生交联，并在_5C°的低温条件下，立即将混合溶液灌注到步骤3所得到的具有通道微结构的冰致模具中，待含有组织细胞的PVA水凝胶稳定成型后将其取出，并置于5C°的环境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，水从通道结构排出软体组织；制备出最终软体组织支架。本发明的有益效果是:I)本发明的软体组织的制备过程中采用了冰来制备软体组织通道微结构，不但保证了通道结构在成型之前不会因外界作用发生结构变形，同时结构负型的去除也不必做任何特殊处理，只需要在5C°环境下带冰致通道溶化即可，这无形中就避免了因高温处理给原体组织带来污染；2)本发明的通道微结构可以根据实际需求来设计，从而实现组织通道微结构的人为控制，这为实践制备带来了极大的便利；此方法不但满足了组织对通道微结构的需求，而且其制备过程较为简便，容易操作，制备成本也很低廉，具有广泛的适用性；3)本发明采用的器官自身组织细胞和PVA水凝胶来制备的软体组织，故该软体组织是一种活体组织，可以减少器官组织替换过程中的排斥免疫反应和给病人带来的痛苦。
图1是实施例中冰致模具所制备的类肝软组织支架。
具体实施实例本实施例中以肝软组织为的制备例，来描述一种冰致微结构软体组织的制备方法，具体包括以下步骤:步骤1、运用CAD软件设计需要制备的，具有肝软体组织通道网状微结构的组织模型；步骤2、将步骤I所构建的模型数据输入到快速成型机，并利用快速成型技术制造具有通道微结构的树脂模具；步骤3、往步骤2所得的树脂模具中灌注满纯水，并在_5C°冷冻后将树脂模具剥离，从而得到通道微结构的冰致模具；
步骤4、取用1.0X IO6个病患个体肝组织细胞进行培养，细胞培养液为高糖DMEM培养液，每IOOml培养液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/链霉素，经过多次传代已达到需求数量,使用前用胰酶消化,并加入DMEM细胞培养液从而制备出细胞密度为7.0X IO8细胞/ml的细胞悬浮液；步骤5、本实施例根据临床需求，取PVA百分含量为25%的水凝胶材料，并将其与步骤2所得到的组织细胞悬浮液按2:3的体积比均匀混合；步骤6、将步骤5所得到的混合液与5%浓度的三磷酸钠水溶液混合均匀，体积比为49:1，以使水凝胶发生交联，并在_5C°的低温环境条件下，立即将混合溶液灌注到步骤3所得到的具有通道微结构的冰致模具中直至灌满，待含有组织细胞的PVA水凝胶稳定成型后将其取出，并置于5C°的环境下，直至冰致通道慢慢完全溶化，水从通道结构排出软体组织；获得最终软体组织支架。
权利要求
1.一种冰致微结构软体组织的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、设计好具有软体组织通道网状微结构的模型； 步骤2、将步骤I所构建的模型数据输入到快速成型机，并利用快速成型技术制造具有通道微结构的树脂模具； 步骤3、往步骤2所得的树脂模具中灌注满纯水，并在-5 -10C°低温环境下进行冷冻后，将树脂模具剥离，从而得到通道微结构的冰致模具； 步骤4、取用病患个体的器官组织细胞进行培养，细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中每IOOml培养液中添加有IOml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和IOmg青霉素/链霉素，经过多次传代达到需求数量，使用前用胰酶消化，并加入DMEM细胞培养液从而制备出具有特定细胞密度的细胞悬浮液； 步骤5、根据临床需求，取具有特定PVA浓度的PVA水溶液，并将该溶液与步骤4所得到的组织细胞悬浮液按一定体积比均匀混合，温度控制在0C° ; 步骤6、将步骤5所得到的混合液与适量5%浓度的三磷酸钠水溶液混合均匀，以使水凝胶发生交联，并在_5C°的低温条件下，立即将混合溶液灌注到步骤3所得到的具有通道微结构的冰致模具中，待含有组织细胞的PVA水凝胶稳定成型后将其取出，并置于5C°的环境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，水从通 道结构排出软体组织；制备出最终软体组织支架。
全文摘要
本发明公开了一种冰致微结构软体组织的制备方法，属于生物组织工程领域。该方法首先设计好具有软体组织通道网状微结构的模型，然后利用增材制造技术制备具有通道微结构的树脂模具，并往树脂模具中灌注纯水冷冻后剥离，从而得到具有通道微结构的冰致模具；最后在低温下往此冰致模具体系中灌注预先配置好的具有组织活体细胞、生长因子等的PVA水凝胶，待其稳定成型后，将其放置于5~10C°的环境下，直至冰致通道慢慢溶化完全，最后所获得的就是具有通道微结构的软体组织。本方法保证了通道结构在成型之前不会因外界作用发生结构变形，避免了因高温处理给原体组织带来污染；制备过程较为简便，容易操作，制备成本也很低廉，具有广泛的适用性。
文档编号A61L27/16GK103120807SQ20131001617
公开日2013年5月29日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者汪焰恩, 魏庆华, 潘飞龙, 叶东东, 龙水军, 毛海龙, 郭叶, 李欣培, 李川川, 张磊, 杨明明, 魏生民 申请人:西北工业大学