专利名称：一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法。
背景技术：
医用金属材料由于其良好的生物相容性和力学性能，已经成功地被应用于骨缺损修复，成为重要的骨组织替换材料。医用金属表面由于其生物惰性，使得新骨在其表面生长缓慢，且长入的新骨与表面的机械键合较弱。生长因子(如BMPs，VEGF, FGF等)在骨修复过程中起着重要的调控作用。在医用金属表面负载BMP-2可以其提高生物活性.然而生长因子药价昂贵，半衰期短，容易变性，局部给药后很容易在人体组织中散逸，过量输入则可能有潜在的毒性和致癌性。实现生长因子在医用金属表面的固载和缓释是一个难题。现有的方法主要是在金属表面的直接共价固定因子，但因子活性可能会因共价反应受到破坏。另一方面，生物医用材料表面易引起细菌等微生物在其粘附，植入人体后，会导致感染发生，不得不再进行二次手术，取出已感染的植入物，使患者饱受痛苦，严重时常危及生命。可在材料表面再固载抗生素以减少感染，但现有的固载方法是物理吸附方法，抗生素在容易在短期内释放，其抗菌作用的时间短，抗菌效果差。
发明内容
本发明的目的是提供一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，该方法制备的涂层能在正常生理坏境下调控生长因子与抗生素的吸附和释放，生长因子的活性保持好，骨诱导作用强；且抗生素能实现长期缓慢释放，抗菌效果好。本发明实现其发明目的，所采用的技术方案是，一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其具体步骤如下:A、多糖聚合物的氧化将在溶液中显负电性的聚多糖配制成浓度为20mg/ml的溶液，再在该溶液中加入高碘酸钠、避光且搅拌6h，加入的高碘酸钠与聚多糖单体单元的摩尔比为1: 1-2.5;随后加入与高碘酸钠等摩尔的乙二醇反应2h，反应后将溶液进行透析、取透析袋中的液体冷冻干燥，得到多醛基多糖聚合物；B、负载抗生素纳米颗粒的制备:B1、配置聚阳离子浓度为0.5-2.5mg/ml的溶液；B2、将含氨基的抗生素溶解于浓度为0.5-2.5mg/ml的氧化多糖聚合物溶液中得混合溶液，混合溶液中抗生素的浓度为0.1-lmg/ml ；B3、将BI步的聚阳离子溶液与B2步的混合溶液按2-5: I的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，得载有抗生素的正电性纳米颗粒；随后将正电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为0.5-5mg/ml的正电性纳米颗粒溶液。
C、负载生长因子纳米颗粒的制备:
Cl、配置浓度为0.5-lmg/ml的聚阳离子溶液；C2、将对骨生长有促进作用的生长因子溶解于浓度为2.5-10mg/ml的聚阴离子溶液中得混合溶液，混合溶液中生长因子的浓度为0.5-10 μ g/ml ；C3、将C2步的混合溶液与Cl步的聚阳离子溶液按1:1的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有生长因子的负电性纳米颗粒；随后将负电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为0.5-5mg/ml的负电性纳米颗粒溶液。D、在医用金属表面接枝多巴胺涂层，再将其浸入体积分数0.5% -3%的戊二醛溶液中，使其表面接枝醛基；E、将处理后的医用金属浸泡在B步的载有抗生素的正电性纳米颗粒溶液中反应5-30分钟，取出、冲洗，即在医用金属表面组装上一层带正电荷的纳米颗粒；F、将E步处理后的医用金属浸泡在C步的载有生长因子的负电性纳米颗粒溶液中反应5-30分钟，取出、冲洗，即在医用金属表面组装上一层带负电荷的纳米颗粒；G、重复以上E-F步的操作0-100次。与现有技术相比，本发明的有益效果是:1.生长因子和抗生素分别包裹于不同的纳米颗粒中，纳米颗粒能够达到定位给药的目的，实现局部给药，提高生长因子和抗生素的体内生物利用度，减少药物毒副作用，达到提高治疗效果的作用。2.生长因子先与亲因子的聚阴离子充分混合，再通过离子交联的方式而不是共价结合的方式固载于纳米颗粒中，生长因`子活性保持好、骨诱导作用强。3.带氨基的抗生素先接枝到醛基化聚多糖高分子链上，再与聚阳离子发生离子交联固载于纳米颗粒内，随纳米颗粒的缓慢降解而缓慢释放，抗生素的作用时间长，抗菌效果好。4.搭载生长因子和抗生素两种药物的纳米颗粒层交替组装在医用金属表面，通过选用不同的生长因子和抗生素，可以得到不同生长因子/抗生素组配，避免产生耐药性，有效实现植入材料表面的骨诱导与抗菌作用。上述的A步中的多糖聚合物是海藻酸钠，硫酸软骨素或透明质酸。这几种多糖聚合物能够被高碘酸钠氧化，使其分子结构带上醛基，并通过西弗碱反应与带氨基的抗生素发生共价接枝，通过离子交联使抗生素包裹在纳米颗粒中。上述B步中的含氣基的抗生素为万古霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、头抱拉定、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素或阿斯霉素。这几种抗生素分子链上都带有不同数目氨基，易和氧化的多糖聚合物反应，从而将抗生素包裹在纳米颗粒中。上述B步中的聚阴离子是肝素，海藻酸钠，硫酸软骨素或透明质酸。这几种物质都是天然的多糖聚合物，在水溶液中表现出负电性，能通过离子交联方式和聚阳离子在温和条件下形成纳米颗粒。上述C步中的生长因子是骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、血管内皮生长因子(VEGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)。这几种生长因子都具有良好骨诱导功能，在中性条件下表现出正电性，在和聚阴离子溶液充分混合后，能有效的固定在多糖聚阴离子上。
上述B步和C步中的聚阳离子是聚赖氨酸或壳聚糖。这是两种正电性的多糖高分子，生物相容性好，易和阴离子搅拌下形成纳米颗粒。上述D步中的医用金属是钛、钛合金或不锈钢。这几种医用金属合金由于良好的生物相容性和力学性能被广泛应用于骨组织替换材料，表面易被活化，能促进骨快速愈合。下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的描述。
具体实施例方式实施例1一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其具体步骤如下:A、海藻酸钠的氧化:将海藻酸钠配制成浓度为20mg/ml的溶液，再在该溶液中加入高碘酸钠、避光且搅拌6h，加入的高碘酸钠与海藻酸钠单体单元的摩尔比为1: 1，随后加入与高碘酸钠等摩尔的乙二醇反应2h;反应后将溶液进行透析、取透析袋中的液体冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠。B、负载万古霉素纳米颗粒的制备:B1、配置聚赖氨酸浓度为2.5mg/ml的溶液；B2、将万古霉素溶 解于浓度为0.5mg/ml的氧化海藻酸钠溶液中，得到混合溶液，混合溶液中万古霉素浓度为0.5mg/ml ；B3、将BI步的聚赖氨酸溶液与B2步的混合溶液按3: I的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有万古霉素的正电性纳米颗粒；随后将正电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为2.5mg/ml的正电性纳米颗粒溶液；C、负载BMP-2纳米颗粒的制备:Cl、配置浓度为0.5mg/ml的聚赖氨酸溶液；C2、将对骨生长有促进作用的骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)溶解于浓度为5mg/ml的硫酸软骨素溶液中，得到混合溶液，混合溶液中中生长因子的浓度为5μ g/ml ；C3、将Cl步的聚赖氨酸溶液与C2步的混合溶液按1:1的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有生长因子的负电性纳米颗粒；随后将负电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为0.5mg/ml的负电性纳米颗粒溶液；D、在纯钛表面接枝多巴胺涂层，再将其浸入体积分数2%的戊二醛溶液中浸泡24h，使其表面接枝醛基；E、将处理后的纯钛浸泡在B步的载有万古霉素的正电性纳米颗粒溶液中反应15分钟，取出、冲洗，即在纯钛表面组装上一层带正电荷的纳米颗粒；F、将E步处理后的纯钛浸泡在C步的载有骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)的负电性纳米颗粒溶液中反应30分钟，取出、冲洗，即在纯钛表面组装上一层带负电荷的纳米颗粒；G、重复以上E-F步的操作10次。实施例2本例的操作与实施例1基本相同，只是将实施例1中使用的抗生素由万古霉素换成头孢拉定、医用金属由钛换成钛合金。
实施例3本例的操作与实施例1基本相同，只是将实施例1中使用的抗生素由万古霉素换成卡那霉素。实施例4一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其具体步骤如下:A、透明质酸的氧化将透明质酸配制成浓度为20mg/ml的溶液，再在该溶液中加入高碘酸钠、避光且搅拌6h，加入的高碘酸钠与透明质酸单体单元的摩尔比为1: 2，随后加入与高碘酸钠等摩尔的乙二醇反应2h;反应后将溶液进行透析、取透析袋中的液体冷冻干燥，得到多醛基透明质酸。B、负载链霉素纳米颗粒的制备:B1、配置壳聚糖浓度为0.5mg/ml的溶液；B2、将链霉素溶解于浓度为1.0mg/ml的氧化硫酸软骨素溶液中，得到混合溶液，混合溶液中链霉素浓度为0.lmg/ml ；B3、将BI步的壳聚糖溶液与B2步的混合溶液按2: I的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有链霉素的正电性纳米颗粒；随后将正电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为0.5mg/ml的正电性纳米颗粒溶液；C、负载BMP-7纳米颗粒的制备:Cl、配置浓度为0.7mg/ml的壳聚糖溶液；C2、将对骨生长有促进作用的骨形态发生蛋白-7(BMP-7)溶解于浓度为10mg/ml的透明质酸溶溶液中，得到混合溶液，混合溶液中中生长因子的浓度为10yg/ml ；C3、将Cl步的壳聚糖溶液与C2步的混合溶液按1:1的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有生长因子的负电性纳米颗粒；随后将负电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为5mg/ml的负电性纳米颗粒溶液；D、在纯钛表面接枝多巴胺涂层，再将其浸入体积分数0.5%的戊二醛溶液中浸泡24h，使其表面接枝醛基；E、将处理后的纯钛浸泡在B步的载有链霉素的正电性纳米颗粒溶液中反应30分钟，取出、冲洗，即在纯钛表面组装上一层带正电荷的纳米颗粒；F、将E步处理后的纯钛浸泡在C步的载有骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)的负电性纳米颗粒溶液中反应5分钟，取出、冲洗，即在纯钛表面组装上一层带负电荷的纳米颗粒；实施例5本例的操作与实施例4基本相同，只是将实施例4中使用的抗生素由链霉素换成妥布霉素。实施例6本例的操作与实施例4基本相同，只是将实施例4中使用的抗生素由链霉素换成丁胺卡那霉素。实施例7—种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其具体步骤如下:A、硫酸软骨素的氧化
将硫酸软骨素配制成浓度为20mg/ml的溶液，再在该溶液中加入高碘酸钠、避光且搅拌6h，加入的高碘酸钠与硫酸软骨素单体单元的摩尔比为1: 2.5，随后加入与高碘酸钠等摩尔的乙二醇反应2h;反应后将溶液进行透析、取透析袋中的液体冷冻干燥，得到多醛基硫酸软骨素。B、负载庆大霉素纳米颗粒的制备:B1、配置聚赖氨酸浓度为2mg/ml的溶液；B2、将庆大霉素溶解于浓度为2.5mg/ml的氧化硫酸软骨素溶液中，得到混合溶液，混合溶液中庆大霉素浓度为lmg/ml ；B3、将BI步的聚赖氨酸溶液与B2步的混合溶液按5: I的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有庆大霉素的正电性纳米颗粒；随后将正电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为5.0mg/ml的正电性纳米颗粒溶液；C、负载VEGF纳米颗粒的制备:Cl、配置浓度为1.0mg/ml的壳聚糖溶液；C2、将对骨生长有促进作用的VEGF溶解于浓度为2.5mg/ml的海藻酸钠溶液中，得到混合溶液，混合溶液中中生长因子的浓度为0.5 μ g/ml ；
C3、将Cl步的壳聚糖溶液与C2步的混合溶液按1:1的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有生长因子的负电性纳米颗粒；随后将负电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为2.0mg/ml的负电性纳米颗粒溶液；D、在不锈钢表面接枝多巴胺涂层，再将其浸入体积分数3%的戊二醛溶液中浸泡24h，使其表面接枝醛基；E、将处理后的不锈钢浸泡在B步的载有庆大霉素的正电性纳米颗粒溶液中反应5分钟，取出、冲洗，即在不锈钢表面组装上一层带正电荷的纳米颗粒；F、将E步处理后的不锈钢浸泡在C步的载有VEGF的负电性纳米颗粒溶液中反应20分钟，取出、冲洗，即在不锈钢表面组装上一层带负电荷的纳米颗粒；G、重复以上E-F步的操作100次。实施例8本例与实施例7基本相同，不同的是将实施例7中的生长因长由血管内皮生长因子(VEGF)换成成纤维细胞生长因子(FGF)、抗生素由庆大霉素换成阿斯霉素、聚阴离子由海藻酸钠换成肝素。实施例9本例与实施例7基本相同，不同的是将实施例7中的抗生素由庆大霉素换成新霉素。实施例10本例与实施例7基本相同，不同的是将实施例7中的抗生素由庆大霉素换成核糖
霉素O实施例11本例与实施例7基本相同，不同的是将实施例7中的抗生素由庆大霉素换成小诺
霉素O
权利要求
1.一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其具体步骤如下: A、多糖聚合物的氧化: 将在溶液中显负电性的聚多糖配制成浓度为20mg/ml的溶液，再在该溶液中加入高碘酸钠、避光且搅拌6h，加入的高碘酸钠与聚多糖单体单元的摩尔比为1: 1-2.5;随后加入与高碘酸钠等摩尔的乙二醇反应2h，反应后将溶液进行透析、取透析袋中的液体冷冻干燥，得到多醛基多糖聚合物； B、负载抗生素纳米颗粒的制备: B1、配置聚阳离子浓度为0.5-2.5mg/ml的溶液； B2、将含氨基的抗生素溶解于浓度为0.5-2.5mg/ml的氧化多糖聚合物溶液中得混合溶液，混合溶液中抗生素的浓度为0.1-lmg/ml ； B3、将BI步的聚阳离子溶液与B2步的混合溶液按2-5: I的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，得载有抗生素的正电性纳米颗粒；随后将正电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为0.5-5mg/ml的正电性纳米颗粒溶液； C、负载生长因子纳米颗粒的制备: Cl、配置浓度为0.5-lmg/ml的聚阳离子溶液； C2、将对骨生长有促进作用的生长因子溶解于浓度为2.5-10mg/ml的聚阴离子溶液中得混合溶液，混合溶液中生长因子的浓度为0.5-10 μ g/ml ； C3、将C2步的混合溶液与Cl步的聚阳离子溶液按1:1的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出载有生长因子的负电性纳米颗粒；随后将负电性纳米颗粒溶于水中得到浓度为0.5-5mg/ml的负电性纳米颗粒溶液； D、在医用金属表面接枝多巴胺涂层，再将其浸入体积分数0.5% -3%的戊二醛溶液中，使其表面接枝醛基； E、将处理后的医用金属浸泡在B步的载有抗生素的正电性纳米颗粒溶液中反应5-30分钟，取出、冲洗，即在医用金属表面组装上一层带正电荷的纳米颗粒； F、将E步处理后的医用金属浸泡在C步的载有生长因子的负电性纳米颗粒溶液中反应5-30分钟，取出、冲洗，即在医用金属表面组装上一层带负电荷的纳米颗粒； G、重复以上E-F步的操作0-100次。
2.根据权利要求1所述的一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其特征在于:所述的A步中的多糖聚合物是海藻酸钠，硫酸软骨素或透明质酸。
3.根据权利要求1所述的一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其特征在于:所述B步中的含氨基的抗生素为万古霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、头孢拉定、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素或阿斯霉素。
4.根据权利要求1所述的一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其特征在于:所述B步中的聚阴离子是肝素，海藻酸钠，硫酸软骨素或透明质酸。
5.根据权利要求1所述的一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其特征在于:所述C步中的生长因子是骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、血管内皮生长因子(VEGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)。
6.根据权利要求1所述的一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方法，其特征在于:所述B步和C步中的聚阳离子是聚赖氨酸或壳聚糖。
7.根据权利要求1所述的一种医用金属表面具有骨诱导与抗菌性作用涂层的制备方 法，其特征在于:所述D步中 的医用金属是钛、钛合金或不锈钢。
全文摘要
本发明公开了一种在医用金属表面制备了具有骨诱导与抗菌性作用的纳米颗粒涂层。该方法以带不同电性的纳米颗粒为载体，纳米颗粒由高分子聚合物相互交联形成，在制备电性相异的纳米颗粒过程中分别载入生长因子和抗生素。其中，因子与亲因子的聚阴离子先充分混合反应，通过离子交联固载于纳米颗粒中；带氨基的抗生素先通过化学交联接枝到多醛基阴离子聚合物上，再通过离子交联载入到纳米颗粒中。两种纳米颗粒通过静电吸附交替组装在医用金属表面，颗粒间还形成共价交联，增强涂层的稳定性。该方法制备的涂层能在正常生理坏境下调控生长因子与抗生素的吸附和释放，生长因子的活性保持好，骨诱导作用强；且抗生素能实现长期缓慢释放，抗菌效果好。
文档编号A61L27/34GK103203039SQ20131012558
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月12日 优先权日2013年4月12日
发明者鲁雄, 王振铭, 董丽, 谢超鸣, 郭亚楠, 韩璐, 刘敏, 孙红龙, 姜丽丽 申请人:西南交通大学