c(LyP-1)多肽及其构建的纳米递药系统和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属多肽、高分子材料和药剂学领域，涉及一种酰胺键环合多肽c(LyP-1)及其在肿瘤主动靶向纳米递药系统中的应用；所述c(LyP-1)的序列为CGNKRTRGA，其修饰的高分子载体材料构建成纳米递药系统。实验结果表明，所述c(LyP-1)以酰胺键环合成环状九肽，其比二硫键环合的环状九肽LyP-1具有更好的血中稳定性、受体蛋白结合活性和肿瘤细胞亲和活性；c(LyP-1)修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统脂质体等具有更好的肿瘤组织靶向性和更强的抗肿瘤生长效果，并能更有效地抑制肿瘤淋巴管的新生，防止肿瘤的淋巴转移；所述c(LyP-1)作为可介导纳米递药系统靶向抗肿瘤并防治肿瘤淋巴转移的靶向分子，具有良好的应用前景。
【专利说明】C(LyPH)多肽及其构建的纳米递药系统和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属多肽、高分子材料和药剂学领域，涉及一种新型LyP-I多肽及其构建的 纳米递药系统和应用，具体涉及一种酰胺键环合多肽c (LyP-I)及其修饰的高分子材料，以 及所构成的主动靶向纳米递药系统，特别涉及酰胺键环九肽C(LyP-I)及其对高分子材料 的修饰，以及C(LyP-I)修饰的包载抗肿瘤药物的主动靶向纳米递药系统，和在制备抗肿 瘤、抑制肿瘤淋巴转移和抗淋巴转移肿瘤靶向治疗药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 药物化疗是临床肿瘤治疗的主要手段之一，因其对正常细胞具有杀伤性而存在毒 副作用大的缺点。近年来，纳米递药系统已被广泛用于肿瘤的靶向治疗，研究表明，纳米递 药系统对肿瘤组织的被动靶向主要利用肿瘤的EPR效应（透过性增强及滞留效应），20世 纪90年代起，以该策略为基础的一些纳米药物已被批准用于临床并得到了广泛应用。为使 药物进一步富集于肿瘤组织，研究者多使用主动靶向策略，即在递药系统表面修饰可特异 性结合肿瘤细胞或其他相关细胞的靶向分子，常用的靶向分子有抗体、核酸适体、多肽和其 它小分子物质，其中，多肽类靶向分子因其高肿瘤靶向能力和化学易修饰等优势而被广泛 应用，但一些多肽靶向分子存在体内稳定性差的缺点，降低了其在体内对肿瘤的寻靶能力； 因此，提高多肽靶向分子的稳定性对提高主动靶向纳米递药系统的肿瘤靶向治疗效果具有 重要意义。
[0003] LyP-I多肽（CGNKRTRGC)是一种对多种肿瘤细胞、肿瘤淋巴管内皮细胞和肿瘤相 关巨噬细胞有特异性亲和作用的环状九肽。近年来的研究表明，淋巴管新生在淋巴性肿瘤 转移中发挥着重要作用，抑制肿瘤的淋巴管新生能有效地抑制淋巴转移肿瘤。鉴于LyP-I 的特异亲和性，本发明人在前期研究工作中构建了 LyP-I修饰的阿霉素脂质体用于抑制淋 巴转移肿瘤的生长，效果良好；另外，也有多篇报道将LyP-I用于原位肿瘤的主动靶向治 疗。虽然所述的LyP-I显示出了一定的主动靶向功能，但LyP-I在化学结构上尚存在如下 缺陷；LyP-I是以二硫键进行环合的环肽，二硫键结构稳定性较差，在血液中易被谷胱甘肽 还原酶等破坏，在一定程度上影响了 LyP-I在体内的应用。
[0004] 针对上述问题，本申请的发明人拟提供一种新型LyP-I多肽及其构建的纳米递药 系统和应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型LyP-I多肽及其构建的纳米递药系统和应用，具体 涉及一种酰胺键环合多肽C(LyP-I)及其修饰的高分子材料，以及所构成的主动靶向纳米 递药系统，特别涉及酰胺键环九肽c (LyP-I)及其对高分子材料的修饰，以及c (LyP-I)修饰 的包载抗肿瘤药物的主动靶向纳米递药系统，和在制备抗肿瘤、抑制肿瘤淋巴转移和抗淋 巴转移肿瘤靶向治疗药物中的用途。
[0006] 本发明对LyP-I结构进行优化，使用酰胺键代替二硫键，制备成酰胺键环合多肽 C(LyP-I)，该C(LyP-I)多肽（序列为CGNKRTRGA)为高稳定性的C(LyP-I)靶向分子，用其 修饰高分子载体材料，构建包载药物的纳米递药系统，能提高对肿瘤的靶向递药效果。
[0007] 具体而言，本发明的酰胺键环合多肽C(LyP-I)序列为CGNKRTRGA ;其首尾两个氨 基酸通过酰胺键连接成环状结构；
[0008] 本发明中，所述酰胺键环合多肽C(LyP-I)通过共价键连接所修饰的高分子载体 材料；所述高分子载体材料选自聚乙二醇-磷脂（PEG-PE)、聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA)、 聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚谷氨酸（PEG-PGA)、聚乙二 醇-聚天冬氨酸（PEG-PAA)、聚乙二醇-聚赖氨酸（PEG-PL)、聚乙二醇-聚乙烯亚胺 (PEG-PEI)；
[0009] 所述酰胺键环合多肽C(LyP-I)通过共价键连接上述高分子载体材料，分别制 备成 c (LyP-1) -PEG-PE、c (LyP-1) -PEG-PLA、c (LyP-1) -PEG-PLGA、c (LyP-1) -PEG-PGA、 c (LyP-I) -PEG-PAA、c (LyP-I) -PEG-PUc (LyP-I) -PEG-PEI 含 c (LyP-I)的高分子载体材料； [0010] 本发明中，采用含C(LyP-I)的高分子载体材料构建的纳米递药系统（简称 C(LyP-I)修饰的纳米递药系统）包括：脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘等，其可包载的药 物包括：阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春 新碱，硼替唑米，HNP-1，mellitin， DPMI-theta 等。
[0011] 本发明的C(LyP-I)修饰的纳米递药系统中，表面含有C(LyP-I)的脂质体中的脂 质体膜材料选自天然大豆磷脂或合成的磷脂、胆固醇、甲氧基聚乙二醇-磷脂（MPEG-PE)、 含C(LyP-I)-PEG-PE;其中，脂质体膜材料的摩尔比为a :b = 5:l?1:2、a:c = 1000 : 1 ?1000 : 100、a : d= 1000 : 1 ?1000 : 100;
[0012] 本发明的c (LyP-I)修饰的纳米递药系统中，表面含有c (LyP-I)的聚 合物胶束中的材料由MPEG-PE和c (LyP-I) -PEG-PE组成；其中，材料的摩尔比为 MPEG-PE:C(LyP-I)-PEG-PE= IOOO : 1?1000 : 100;
[0013] 本发明的C(LyP-I)修饰的纳米递药系统中，表面含有C(LyP-I)的聚合物圆盘 中的材料由磷脂、MPEG-PE和c (LyP-1) -PEG-PE组成，材料的摩尔比为磷脂：MPEG-PE 和 C(LyP-I)-PEG-PE = 100 : 15 ?100 : 30，其中，MPEG-PE : C(LyP-I)-PEG-PE = 1000:1?1000:100;
[0014] 本发明中，所述的含C(LyP-I)多肽修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系 统，其平均粒径为20?200nm;
[0015] 本发明还提供了 C(LyP-I)制备和性质考察以及上述所修饰的纳米递药系统用于 肿瘤治疗的物质基础。本发明的试验结果表明：C(LyP-I)比LyP-I在血清中具有更高的稳 定性，且具有更强的受体蛋白P32及其高表达p32蛋白的模型肿瘤细胞亲和活性；与LyP-I 修饰的纳米递药系统相比，c (LyP-I)修饰的纳米递药系统显示出了更好的肿瘤组织靶向性 和更强的抗肿瘤生长作用；c (LyP-I)修饰的纳米递药系统能更有效地抑制肿瘤淋巴管的 新生，对肿瘤淋巴转移显示出了良好的抑制效果，并具有良好的治疗淋巴转移肿瘤的效果。
[0016] 本发明同时提供了所述C(LyP-I)的合成方法和稳定性、亲和性评价，及其修饰的 纳米递药系统的制备方法、体内外靶向性评价、抗肿瘤生长作用，以及体内抗淋巴管新生作 用、抗肿瘤淋巴转移和抗淋巴转移肿瘤作用评价，其包括：
[0017](1)合成C(LyP-I)及其荧光标记物（FAM-C (LyP-I))
[0018] 采用固相合成的方法合成C (LyP-I)直链多肽（CGNKRTRGA-Mpr-L)和LyP-I 直链多肽（CGNKRTRGC);通过"Native Chemical Ligation"反应合成以酰胺键环合的 c (LyP-I)，通过空气氧化的方法形成二硫键环合的LyP-I ;通过马来酰亚胺基团与巯基的 偶联反应来合成FAM-c (LyP-I)，利用羧基与氨基在催化剂下的共轭反应来合成LyP-I的荧 光标记物（FAM-LyP-I)，HPLC、MS表征四者结构；
[0019] (2) c (LyP-I)稳定性和亲和性评价
[0020] 从血清稳定性、与受体蛋白p32结合能力和与高表达p32蛋白的肿瘤细胞结合 能力三方面进行C(LyP-I)性质的考察；将c(LyP-l)、LyP-I与大鼠血清在37°C进行孵 育，在不同时间点检测c(LyP-l)、LyP-I的浓度以进行稳定性的比较；采用表面等离子共 振方法（SPR)和荧光极化方法（FP)测量c (LyP-I)、LyP-I与p32的结合常数Kd值：比较 FAM-c(LyP-l)、FAM-LyP-I对p32蛋白高表达的模型肿瘤细胞（如：黑色素瘤细胞SCI375、 1?八-]\^-435、816?10 ;肺癌细胞5?(：-41、从：1-!1292;乳腺癌细胞41'1;胰腺癌细胞81?(：-3等） 的体外靶向性；
[0021] (3)构建与表征C(LyP-I)修饰的纳米递药系统
[0022] ①构建与表征c (LyP-I) -PEG-脂质体递药系统
[0023] 首先，合成靶向分子修饰的高分子材料C(LyP-I)-PEG-DSPE和 LyP-I-PEG-DSPE ;将 c (LyP-I)与 Mal-PEG-DSPE 在 pH7. 0 的 PBS 和 DMF 的混合溶液 中反应得到c (LyP-I) -PEG-DSPE ;采用固相合成的方法合成直链Acm保护的巯基化 LyP-I (LyP-1 (2Acm) -Cys)，将 LyP-I (2Acm) -Cys 与 Mal-PEG-DSPE 按上述方法反应得到 LyP-I (2Acm)-PEG-DSPE，再使用碘氧化的方法得到环合的LyP-I-PEG-DSPE ;将上述二者透 析纯化，NMR表征结构；
[0024] 然后，分别制备c (LyP-I)和LyP-I修饰的脂质体（c (LyP-I) -PEG-脂质体 和 LyP-I-PEG-脂质体）；以一定比例的 HSPC/Chol/PEG-DSPE/c (LyP-I)-PEG-DSPE 或 LyP-I-PEG-DSPE为膜材料，采用成膜水化法制备c (LyP-I) -PEG-脂质体和LyP-I-PEG-脂 质体，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，并分别包载DiR、FAM、阿霉素，构建平均粒径在 IOOnm的脂质体；激光散射法测定粒径分布，负染色电镜法观察脂质体形态；
[0025] ②构建与表征c (LyP-I) -PEG-DSPE胶束递药系统
[0026] 以一定比例的 mPEG2000-DSPE/c (LyP-I) -PEG-DSPE 为膜材料，以紫杉醇（PTX)为 模型药物，采用成膜水化法制备c (LyP-I) -PEG-DSPE胶束，构建平均粒径在IOnm的胶束；凝 胶过滤法测定紫杉醇胶束的包封率和载药量，激光散射法测定粒径分布；
[0027] ③构建与表征c (LyP-I) -PEG-DSPE圆盘递药系统
[0028] 以一定比例的 P0PC/Chol/mPEG2000-DSPE/c (LyP-I) -PEG-DSPE 为膜材料，以紫杉 醇（PTX)为模型药物，采用成膜水化法制备C (LyP-I)-PEG-DSPE圆盘，探头超声法减小圆盘 粒径，构建平均粒径在40nm的圆盘；凝胶过滤法测定紫杉醇圆盘的包封率和载药量，激光 散射法测定粒径分布；
[0029] (4) c (LyP-I) -PEG-脂质体递药系统的体内外肿瘤靶向性评价
[0030] 考察 SCI375 细胞、4T1 细胞分别对 C (LyP-I) -PEG-脂质体 /FAM、LyP-l-PEG-脂质 体/FAM和PEG-脂质体/FAM的摄取情况，比较上述两种递药系统对肿瘤细胞的体外亲合能 力：
[0031] 给SCI375细胞皮下移植瘤动物模型静脉注射C (LyP-I) -PEG-脂质体/DiR、 LyP-I-PEG-脂质体/DiR和PEG-脂质体/DiR，在活体成像仪下观测并比较不同递药系统在 实体瘤的影像分布；
[0032] 给SCI375细胞皮下移植瘤动物模型静脉注射c (LyP-I) -PEG-脂质体/ FAM、LyP-I-PEG-脂质体/FAM和PEG-脂质体/FAM，采用免疫荧光染色法，研究 c (LyP-I) -PEG-LS/FAM对肿瘤淋巴管和肿瘤相关巨噬细胞的亲和性；
[0033] (5) c (LyP-I) -PEG-脂质体递药系统的体内外抗肿瘤效果评价
[0034] 以MTT法研究c (LyP-I) -PEG-脂质体-脂质体/阿霉素、LyP-I-PEG-脂质体-脂 质体/阿霉素和PEG-脂质体-脂质体/阿霉素对SCI375细胞的体外生长抑制效果：
[0035] 给SCI375细胞皮下移植瘤动物模型静脉注射c (LyP-I) -PEG-脂质体-脂质体/ 阿霉素、LyP-I-PEG-脂质体-脂质体/阿霉素、PEG-脂质体-脂质体/阿霉素、游离阿霉素 和生理盐水，以肿瘤体积为指标评价不同载阿霉素递药系统的体内抑制肿瘤生长效果；
[0036] 取上述给药组的肿瘤组织，用免疫荧光染色法标记淋巴管，进行淋巴管密度（LVD) 定量检测，比较c (LyP-I) -PEG-脂质体-脂质体/阿霉素和LyP-I-PEG-脂质体-脂质体/ 阿霉素对肿瘤淋巴管的破坏能力；
[0037] 给4T1细胞腋窝皮下移植瘤动物模型静脉注射c (LyP-I) -PEG-脂质体-脂质体/ 阿霉素、PEG-脂质体-脂质体/阿霉素、游离阿霉素和生理盐水，以腋窝淋巴结重量为指标 评价不同载阿霉素递药系统的体内抑制肿瘤淋巴转移效果；
[0038] 给SCI375细胞足垫皮下移植瘤动物模型足垫皮下注射c (LyP-I) -PEG-脂质 体-脂质体/阿霉素、PEG-脂质体-脂质体/阿霉素、游离阿霉素和生理盐水，以接种侧胭 淋巴结（PL)和未接种侧淋巴结（PR)重量比为指标评价不同载阿霉素递药系统的体内治疗 淋巴转移肿瘤效果。
[0039] 实验结果表明，所述C(LyP-I)是一种以酰胺键环合的环状九肽，比二硫键环合的 环状九肽LyP-I在血清中具有更高的稳定性，且具有更强的受体蛋白p32及其高表达p32 蛋白的模型肿瘤细胞亲和活性；与LyP-I修饰的纳米递药系统相比，C(LyP-I)修饰的纳米 递药系统显示出了更好的肿瘤组织靶向性和更强的抗肿瘤生长作用；C(LyP-I)修饰的纳 米递药系统能更有效地抑制肿瘤淋巴管的新生，对肿瘤淋巴转移显示出了良好的抑制效 果，并具有良好的治疗淋巴转移肿瘤的效果；所述的c (LyP-I)修饰的纳米递药系统，为一 种更好的可介导纳米递药系统靶向抗肿瘤并防治肿瘤淋巴转移的靶向分子，具有良好的应 用前景，可用于制备治疗肿瘤药物、制备静脉注射抗肿瘤和抑制肿瘤淋巴转移药物、制备皮 下和肌肉注射治疗淋巴转移肿瘤药物。
[0040] 通过下述附图和实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图 1 为 c (LyP-I)、LyP-1、FAM-c (LyP-I)和 FAM-LyP-I 的 HPLC 图谱及质谱图，其 中，
[0042] 色谱方法：色谱柱：Diamonsil C185μm200X4. 6mm 迪马；流动相 A :0· 1 % TFA H2O ;流动相 B :0· 1 % TFA 乙腈；洗脱程序：0-2min5 % B，2 ?32min5 % -65 % B，32 ? 33min65%?90% B，33 ?36min90% B ;流速：0· 7ml/min ;柱温：40°C;波长：UV214nm ;所述 四种多肽其质谱结果计算所得分子量均与理论分子量相符合。
[0043] 图2显示了C(LyP-I)和LyP-I在血清中的降解曲线，其中，
[0044] 采用HPLC法测量血清中未被降解的多肽浓度；c (LyP-I)比LyP-I在血清中的降 解速率明显降低，拟合计算得C(LyP-I)和LyP-I在25 %血清中的半衰期分别为324min和 324min ;结果表明，与LyP-I相比，C(LyP-I)在血清中的稳定性提高了 0. 82倍。
[0045] 图3为C(LyP-I)和LyP-I与p32结合的荧光极化图谱，其中，
[0046] FAM-c (LyP-I)或FAM-LyP-I与不同浓度的p32蛋白溶液反应；荧光极化值代表了 C(LyP-I)或LyP-I与该浓度的p32蛋白溶液所具备的亲和能力；拟合计算得C(LyP-I)和 LyP-I与p32结合的Kd值分别为422. 4nM和790. 5nM ;结果表明，与原型LyP-I相比，新型 C(LyP-I)与p32的结合能力有所提高。
[0047] 图4为C(LyP-I)和LyP-I与p32结合的等离子共振分析图谱，其中，
[0048] 使用Biacore技术分析c(LyP-l) (A)和LyP-I(B)与p32蛋白的结合能力；各曲线 代表该浓度的多肽随时间与P32结合的动态曲线，选取IOOs为结合分析时间，然后使用蛋 白再生剂洗脱掉芯片表明结合的多肽样品；使用BiacoreTlOO软件计算多肽与蛋白结合 的Kd值，c(LyP-I)与p32结合的Kd值为86. 44nM，LyP-I与p32结合的Kd值为116. 9nM ; 结果表明，与LyP-I相比，c(LyP-l)与p32的结合能力更强。
[0049] 图5为SCI375细胞对不同制剂的摄取图，其中，
[0050]A、B 图：FAM-c (LyP-I) (a)、FAM-LyP-I (b)、FAM(c)、c (LyP-I) -PEG-月旨质体 / FAM(d)、LyP-l-PEG-脂质体 /FAM(e)和 PEG-脂质体 /FAM(f)于 37°C分别与 SCI375 细胞作 用2h后的激光共聚焦显微照片；浅色代表多肽的荧光衍生物或包载FAM的各种脂质体，深 色代表被DAPI染色的细胞核；C、D图：流式细胞仪检测SCI375细胞对两种多肽及两种多肽 分别修饰的脂质体的摄取情况；FAM-c (LyP-I)、FAM-LyP-1、FAM组的阳性细胞比例分别为 64. 00 %、34. 46 %、5. 09 %，c (LyP-I) -PEG-脂质体 /FAM、LyP-I-PEG-脂质体 /FAM 和 PEG-脂 质体/FAM组的阳性细胞比例分别为94. 75%、30. 09%、7. 98% ;定性与定量结果均表明，与 LyP-I相比，C(LyP-I)与肿瘤细胞有更强的亲和能力，且能更有效的介导脂质体体外对肿 瘤细胞的靶向。
[0051] 图 6 为C(LyP-I)-PEG-DSPE和LyP-I-PEG-DSPE的IH-NMR图谱，其中，
[0052] A 为 Mai-PEG-DSPE 的核磁图谱，B、C 分别为 C(LyP-I)-PEG-DSPE 和 LyP-I-PEG-DSPE的核磁图谱；A图显示出马来酰亚胺峰，而B、C图中该峰消失，而其余峰基 本保持不变，显示Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团已与C(LyP-I)或LyP-I反应。
[0053] 图 7 为 c (LyP-I) -PEG-DSPE 胶束 /PTX 和 c (LyP-I) -PEG-DSPE 圆盘 /PTX 粒径分布 图，其中，
[0054] c (LyP-I) -PEG-DSPE 胶束 /PTX (A)和 c (LyP-I) -PEG-DSPE 圆盘 /PTX (B)粒径分布 图，结果显示,二者粒径分别为IOnm和40nn左右。
[0055] 图8为4T1细胞对C(LyP-I)-PEG-脂质体/FAM的摄取图，其中，
[0056] A 图：c (LyP-I) -PEG-脂质体 /FAM(a)和 PEG-脂质体 /FAM(b)于 37°C分别与 4T1 细胞作用2h后的荧光显微照片；浅色代表包载FAM的各种脂质体，深色代表被DAPI染色的 细胞核；B图：流式细胞仪检测4T1细胞对两种脂质体的摄取情况；c (LyP-I)-PEG-脂质体 /FAM(C)和PEG-脂质体/FAM(d)组的阳性细胞比例分别为71. 49%和2. 45% ;定性与定量 结果均表明，c(LyP-l)的修饰能有效地介导脂质体体外对p32蛋白高表达的肿瘤细胞的靶 向。
[0057] 图9为SCI375肿瘤对不同制剂的摄取图，其中，
[0058] A图：荷SCI375黑色素瘤裸小鼠经尾静脉注射PEG-脂质体/DiR(a)、 LyP-I-PEG-脂质体/DiR(b)或c (LyP-I) -PEG-脂质体/DiR(c)后不同时间点的活体 荧光成像图；d、e、f分别代表48h时PEG-脂质体/DiR、LyP-I-PEG-脂质体/DiR和 c (LyP-I) -PEG-脂质体/DiR组裸鼠分离出的器官和肿瘤组织的活体荧光成像图；图片右侧 色卡表示荧光强弱程度；
[0059] B图：各组分离出的器官和肿瘤组织的半定量荧光强度值（数据以"平均值土标 准差"表示，η = 3) ;c (LyP-I)-PEG-脂质体/DiR组肿瘤组织的荧光强度是LyP-I-PEG-脂质 体/DiR组的1. 82倍（存在显著性差异，*p < 0. 05)，表明c (LyP-I)修饰的脂质体比LyP-I 修饰的脂质体有更强的体内肿瘤靶向功能。
[0060] 图10为不同制剂对肿瘤淋巴管靶向性的免疫荧光图，其中，
[0061] 荷SCI375黑色素瘤裸小鼠经尾静脉注射C (LyP-I) -PEG-脂质体/FAM、 LyP-I-PEG-脂质体/FAM和PEG-脂质体/FAM后肿瘤组织的免疫荧光切片；半深色代表被染 色的淋巴管（A、B)、巨噬细胞（C)、血管（D)，浅色代表各种包载FAM的脂质体，深色代表被 DAPI染色的细胞核，箭头处显示了脂质体与染色部位的重叠共定位；结果表明，C(LyP-I) LyP-I有效地介导PEG-脂质体/FAM对肿瘤淋巴管和巨噬细胞的靶向，同时对肿瘤血管不会 产生靶向作用。
[0062] 图11为c (LyP-I) -PEG-脂质体/阿霉素、LyP-I-PEG-脂质体/阿霉素和PEG-脂 质体/阿霉素对SCI375细胞的体外生长抑制作用图，其中，
[0063] MTT分析法考察C(LyP-I)-PEG-脂质体/阿霉素、LyP-I-PEG-脂质体/阿霉素 和PEG-脂质体/阿霉素在体外抑制SCI375细胞生长曲线图；三者的半数抑制浓度分别为 I. 05、2. 57和6. 16 μ M。c (LyP-I) -PEG-脂质体/阿霉素的半数抑制浓度是LyP-I-PEG-月旨 质体/阿霉素的〇. 409倍，表明c (LyP-I)比LyP-I能更好地介导阿霉素脂质体对肿瘤细胞 的生长抑制作用。
[0064] 图12为荷瘤裸鼠肿瘤体积随时间变化图，其中，
[0065] 皮下接种SCI375肿瘤的荷瘤裸小鼠的肿瘤生长抑制试验（η= 5);以阿霉素 15mg/kg的剂量共给药3次，间隔时间为5天；相对肿瘤体积=肿瘤体积/首次给药前肿 瘤体积；方差分析结果表明：与LyP-I-PEG-脂质体/阿霉素组相比，C(LyP-I)-PEG-脂质 体/阿霉素组自第10天起开始表现出极显著差异（*P < 0.05)。在第10、12和14天， c(LyP-I) -PEG-脂质体/阿霉素组肿瘤体积分别是LyP-I-PEG-脂质体/阿霉素组肿瘤体积 的0. 56、0. 76和0. 63倍，表明C(LyP-I)比LyP-I能更好地介导阿霉素脂质体的抗肿瘤生 长作用。
[0066] 图13为不同阿霉素脂质体对肿瘤淋巴管新生抑制作用图，其中，
[0067] 测定各种阿霉素制剂治疗后的肿瘤组织的LVD，以评价其抗肿瘤淋巴管新生作 用；A:代表c(LyP-I)-PEG-脂质体/阿霉素组、LyP-I-PEG-脂质体/阿霉素组、PEG-脂 质体/阿霉素组、游离阿霉素组和生理盐水组的肿瘤组织切片经淋巴管显色（红色）后 所拍摄的荧光照片；B:代表了通过分析A图中的荧光照片得到的各组LVD值；结果显示， C (LyP-I) -PEG-脂质体/阿霉素组比LyP-I-PEG-脂质体/阿霉素组具有更强的肿瘤淋巴管 新生抑制作用（极显著性差异，*P < 0. 001)。
[0068] 图14为不同阿霉素脂质体对肿瘤淋巴转移抑制作用图，其中，
[0069] 腋窝皮下接种4T1肿瘤的荷瘤裸小鼠的肿瘤淋巴转移抑制试验（η = 6);以阿霉 素10mg/kg为总剂量分2次给药，间隔时间为5天；取接种侧腋窝淋巴结称重以评价抑制肿 瘤转移的效果；方差分析结果表明：三组阿霉素制剂中只有c (LyP-I)-PEG-脂质体/阿霉 素组有显著性抑制肿瘤转移的效果，c (LyP-I)-PEG-脂质体/阿霉素组腋窝淋巴结的重量 为生理盐水组的47. 67%、为PEG-脂质体/阿霉素组的47. 81 %，表明c (LyP-I)能有效介 导阿霉素脂质体的抑制肿瘤淋巴转移作用。
[0070] 图15为不同阿霉素脂质体对淋巴转移肿瘤治疗作用图，其中，
[0071] 足垫皮下接种SCI375肿瘤的荷瘤裸小鼠的抗淋巴转移肿瘤试验（n = 6);以阿霉 素12mg/kg为总剂量，分4次给药，间隔时间为5天；取两侧胭淋巴结称重，以PL与PR重量 比评价治疗淋巴转移肿瘤的效果；方差分析结果表明：三个阿霉素制剂组的PL与PR的重 量比均远小于生理盐水组，表明三种阿霉素制剂对胭淋巴结SCI375转移肿瘤均有较强的 治疗作用；与PEG-脂质体/阿霉素组相比，c (LyP-I)-PEG-脂质体/阿霉素对胭淋巴结转 移肿瘤具有更好的治疗作用，重量比为前者的25. 53%，表明C(LyP-I)的修饰能显著增加 阿霉素脂质体治疗淋巴转移肿瘤的作用。
【具体实施方式】
[0072] 实施例 1 合成、纯化和表征 c (LyP-I)、LyP-1、FAM-c (LyP-I)和 FAM-LyP-I
[0073] 1.合成、纯化和表征C(LyP-I)和LyP-I
[0074] 合成直链肽 LyP-I-2H 和 c (LyP-I) -Mpr (Trt) -Leu ;合成 LyP-I-2H 时，称取 Boc-Cys (Mbzl)-PAM树脂0. 4167g(取代度0. 6mmol/g)于接肽瓶中，树脂用DMF溶胀二十 分钟，然后抽干；加入约两倍树脂体积的TFA搅拌反应以脱去Boc保护基，抽去TFA，再加入 TFA同法操作一次；树脂用DMF洗涤后加入Boc-Gly活化液（用HBTU的DMF溶液和DIEA活 化），振摇反应；反应结束后抽去反应液，并用DMF洗涤树脂；随后以上述方法按LyP-I序列 顺次连接其余氨基酸；反应结束后按前述方法洗涤树脂、TFA脱保护基。依次用DMF、DCM/ MeOH(l/l，v/v)洗涤树脂，真空干燥。将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后 通入HF，冰浴搅拌反应Ihr ;反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得 沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液用MeCN/H 20 (1/1， v/v)溶解，制备型HPLC纯化，收集主峰冻干，得LyP-l-2H、FAM-LyP-l-2H直链肽纯品；合 成 c (LyP-I) -Mpr (Trt) -Leu 时，称取 0. 67mg 亮氨酸树脂 Boc-Leu (Boc) -PAM (取代度为 0. 6mmol/g),连接氨基酸时以上述方法按C(LyP-I)序列顺次连接,其他方法同上。
[0075] 肽链的环化；LyP-l_2H经空气氧化后得到LyP-I ;将LyP-l_2H分别溶解于超声脱 气的0. IM的NH4HCO3溶液，使其浓度为lmg/ml，将溶液敞口置于空气中，轻微磁力搅拌，HPLC 监测反应；采用制备型HPLC纯化，收集主峰，冻干得LyP-I纯品；c (LyP-I)-Mpr (Trt)-Leu 经"Native Chemical Ligation" 反应后得到 C(LyP-I);将 LyP-I-Mpr(Trt)-Leu 溶解于 Ligation缓冲液（6M盐酸胍（Gu .HCl)溶液）（pH6. 5)液中，浓度为lmg/ml ;然后加入催化 剂硫代苯酚（〇. 1 %，v/v)，密闭搅拌反应，HPLC监测反应；采用用制备型HPLC纯化，收集主 峰，冻干得C(LyP-I)纯品。
[0076] 2.合成、纯化和表征 FAM-C(LyP-I)和 FAM-LyP-I
[0077] FAM-c (LyP-I)通过巯基与马来酰亚胺基团的共价反应合成；称取7. Omg C(LyP-I)溶于 PBS(0. 1M，pH7. 0)中，称取 3mgMal-FAM 溶于 0. 5mlDMF 中；在搅拌状态下 将DMF溶液加入到PBS溶液中；HPLC检测反应。用制备型HPLC纯化，收集主峰，冻干得 FAM-c(LyP-l)纯品；FAM-LyP-I通过羧基与氨基在催化剂下的共轭反应来合成；在合成 LyP-l-2H时，氨基酸序列连接完全后，加入FAM，得到LyP-l-2H-FAM。LyP-l-2H-FAM经空气 氧化得 FAM-LyP-I。
[0078] c (LyP-I)、LyP-l、FAM_c (LyP-I)和 FAM-LyP-I 的 HPLC 图谱及质谱图如图 1 所示。
[0079] 实施例2c (LyP-I)稳定性和亲和性评价
[0080] I.C(LyP-I)血清稳定性评价
[0081] 将C (LyP-I)、LyP-l分别与25%的大鼠血清混合，多肽浓度为lmg/ml。分别于0、 0. 167、0. 5、1、2、4、6和8h吸取100μ 1生物样品溶液，加入20μ 1的TCA溶液以沉淀血清 蛋白，涡旋震荡后以13000rpm. /min的速度离心lOmin，吸取上清液，HPLC进样检测多肽浓 度；结果如图2所不。
[0082] 2. c (LyP-I)亲和性评价
[0083] 2. Ic (LyP-I)与p32蛋白亲和性评价
[0084] 2. I. 1荧光极化实验
[0085] 使用具有荧光偏正测定模式的酶标仪进行FP实验；在386孔酶标黑板中依次加入 不同浓度的 P32 蛋白溶液（0· 9nM ?3. OX 104nM) 10 μ 1，再加入 FAM-c(LyP-l)、FAM-LyP-I 的PBS (ρΗ7. 4)溶液10 μ 1，使多肽终浓度为30ηΜ ;将黑板在37°C孵育lh，再用酶标仪测量 各孔的荧光偏振值，用GraphPad Prism5. 0软件分别计算其Kd值；结果如图3所示。
[0086] 2. I. 2SPR 实验
[0087] 使用Biacore技术进行SPR实验。首先是p32蛋白与CM5芯片的偶联。使用 EDC/NHS溶液活化芯片表面的羧基后，将p32蛋白的NaAc溶液（pH4. 0)进样。结果表明， 蛋白在芯片上的偶联量约为1600RU。然后是多肽与p32蛋白结合Kd值的检测。将流动 相流速设置为30 μ 1/min，样品与芯片的接触时间设置为100s。将c(LyP-l)、LyP-I分别 配制为浓度从13. 71nM到IOOOOnM的一系列样品溶液，从低到高浓度依次进样，用Biacore T200Evaluation software软件计算(3仏}^-1)、1^?-1与口32蛋白的结合常数1((1值。结果 见附图4。
[0088] 2. 2c (LyP-I)与SCI375肿瘤细胞亲和性评价
[0089] 使用含10 %胎牛血清的DMEM培养液在37°C，5 %二氧化碳及饱和湿度条件下 培养SCI375细胞；将SCI375细胞以每孔IX IO5个细胞接种于24孔培养板中，将培养 板移入培养箱中培养过夜，使细胞贴壁；次日，用培养液配制一系列FAM浓度为20μ M的 FAM-c (LyP-I)、FAM-LyP-l和FAM溶液；将培养板中的培养液吸出，分别加入c (LyP-I) -FAM、 FAM-LyP-I和FAM溶液，37°C孵育2h，吸弃上清液；用磷酸盐缓冲液洗板两次，在荧光显微境 下观察，并运用流式细胞仪计数阳性细胞比例，结果如图5所示。
[0090] 实施例3构建与表征c (LyP-I) -PEG-脂质体递药系统
[0091] L 合成、纯化和表征 c (LyP-I)-PEG-DSPE、LyP-I-PEG-DSPE
[0092] 首先是按照上述固相合成方法合成LyP-I (2Acm)-Cys直链肽，即将原序列中的 Boc-Cys (Mbzl)替换为Boc-Cys (Acm)，并最后连接Boc-Cys (Mbzl)。脱保护、切割、纯化并冻 干后，得LyP-I (2Acm) -Cys纯品。
[0093] 将 c (LyP-I)、LyP_l (2Acm) -Cys 分别溶于 PBS 溶液中（ρΗ7· 0)，取 Mal-PEG-DSPE 溶 于DMF，将DMF溶液滴入PBS溶液中，磁力搅拌反应lh，过量的c (LyP-I)、LyP-l (2Acm) -Cys 和DMF通过透析（截留分子量3. 5kDa)除去；冷冻干燥，得到C(LyP-I)-PEG-DSPE和直 链的LyP-1 (2Acm)-PEG-DSPE ;最后，取直链LyP-1 (2Acm)-PEG-DSPE溶于甲醇中，加入适 量柠檬酸溶液和IM的盐酸溶液；逐滴加入碘甲醇溶液使溶液始终保持微黄色持续反应， 反应结束后加入适量抗坏血酸溶液使微黄色褪去，反应液透析除去盐类，冷冻干燥得到 LyP-I-PEG-DSPE ;NMR表征二者结构，如图6所示。
[0094] 2.制备与表征c (LyP-I)-PEG-脂质体
[0095] 2. 1制备与表征c (LyP-I) -PEG-脂质体/阿霉素
[0096] PEG-脂质体膜材料处方组成为 HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE(55 : 40 : 5， mol/mol)，多肽修饰的PEG-脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE/ c (LyP-I)-PEG-DSPE 或 LyP-I-PEG-DSPE (55 : 40 : 5 : (λ 5，mol/mol);称取上述膜材料溶 于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h。采用硫酸铵梯度法包载 模型药物阿霉素。加入一定体积的〇. 155M硫酸铵溶液，60°C (水浴震荡2h，得脂质体混悬 液；在60°C水浴中，使用微型挤出器依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使 其粒径减小；然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱更换外水相；按照药脂比 I : 10(w/w)加入阿霉素生理盐水溶液，60°C水浴20min。以生理盐水洗脱通过S^hadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得阿霉素脂质体；脂质体用动态光散射法测定粒径，结果如表 1所示，
[0097] 表1各种脂质体的粒径及多分散指数表
[0098]
【权利要求】
1. 一种酰胺键环合多肽C (LyP-1)，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为CGNKRTRGA ;其 首尾两个氨基酸通过酰胺键连接成环状结构。
2. -种纳米递药系统，其特征在于，由权利要求1所述酰胺键环合多肽c (LyP-1)修饰 的高分子载体材料构建成纳米递药系统。
3. 按权利要求2所述的纳米递药系统，其特征在于，所述酰胺键环合多肽c (LyP-1) 通过共价键连在聚乙二醇-磷脂（PEG-PE)、聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA)、聚乙二醇-乳 酸羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚谷氨酸（PEG-PGA)、聚乙二醇-聚天冬氨 酸（PEG-PAA)、聚乙二醇-聚赖氨酸（PEG-PL)、聚乙二醇-聚乙烯亚胺（PEG-PEI)上， 形成 c (LyP-1) -PEG-PE、c (LyP-1) -PEG-PLA、c (LyP-1) -PEG-PLGA、c (LyP-1) -PEG-PGA、 c (LyP-1) -PEG-PAA、c (LyP-1) -PEG-PL 或 c (LyP-1) -PEG-PEI 高分子载体材料。
4. 按权利要求2所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的纳米递药系统是表面含有 c (LyP-1)的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘。
5. 按权利要求4所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的表面含有c (LyP-1)的脂质 体，其脂质体膜材料选自：a :天然大豆磷脂或合成的磷脂，和b :胆固醇，和c :甲氧基聚乙 二醇-磷脂（MPEG-PE)，和d :含c (LyP-1) -PEG-PE ;其中：脂质体膜材料的摩尔比为a : b = 5:1?l:2、a:c = 1000 : 1 ?1000 : 100、a : d = 1000 : 1 ?1000 : 100。
6. 按权利要求4所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的表面含有c(LyP-l) 的聚合物胶束，其材料由MPEG-PE和c (LyP-1) -PEG-PE组成，其中材料的摩尔比为 MPEG-PE : c (LyP-1)-PEG-PE = 1000 : 1 ?1000 : 100。
7. 按权利要求4所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的表面含有c (LyP-1)的聚合 物圆盘，其材料由磷脂、MPEG-PE和c (LyP-1) -PEG-PE组成，材料的摩尔比为磷脂：MPEG-PE 和 c (LyP-1)-PEG-PE = 100 : 15 ?100 : 30，其中 MPEG-PE : c (LyP-1)-PEG-PE = 1000 : 1 ?1000 : 100。
8. 按权利要求2所述的纳米递药系统，其特征是，其平均粒径为20?200nm。
9. 按权利要求2所述的纳米递药系统，其特征在于，所述的纳米递药系统包载下述药 物：阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春新 喊，硼替唑米，HNP-1，mellitin 或 DPMI-theta。
10. 权利要求2所述的纳米递药系统在制备靶向治疗肿瘤的药物中的用途。
11. 权利要求2所述的纳米递药系统在制备靶向治疗肿瘤和抑制肿瘤淋巴转移的静脉 注射药物中的用途。
12. 权利要求2所述的纳米递药系统在制备靶向治疗肿瘤淋巴转移的皮下或肌肉注射 药物中的用途。
【文档编号】A61K47/42GK104341488SQ201310334417
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】陆伟跃, 王飞, 吴美霖, 谢操, 张小雨, 高洁 申请人:复旦大学