针对h3n2犬流感病毒ha2蛋白的单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，属于生物【技术领域】。利用2010年分离的H3N2犬流感病毒江苏分离株JS/10，接种10日龄SPF鸡胚，收集血凝效价大于等于6的尿囊液，纯化病毒接种MDCK细胞，皮内多点注射接种小鼠，细胞融合后，经三次ELISA检测已生成细胞集落的细胞上清，筛选出抗H3亚型杂交瘤细胞株mAbD7，中和抗体效价达1:12800，识别抗原鉴定证实其针对保守的HA2蛋白，抗体亚类为IgG2b。本发明制备针对H3N2犬流感病毒株JS/10的保守的HA2蛋白单克隆抗体，为H3N2犬流感病毒感染的治疗提供了重要的免疫制剂，具有潜在的应用前景。
CCTCC No:C2014176
2014.09.18
【专利说明】针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体
【技术领域】
[0001] 本发明涉及针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，属于生物【技术领域】。标 准的杂交瘤技术，以一株H3N2犬流感病毒株JS/10为试验毒株，最终通过血凝抑制、中和试 验以及Westernblotting筛选得到针对保守蛋白HA2的单克隆抗体D7,为H3N2犬流感病毒 感染的治疗提供重要的免疫制剂。
【背景技术】
[0002] 杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG)为细胞融合剂，使免疫小鼠的脾细胞与 具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让 融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最 终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩 大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。而具有中和 活性的单克隆抗体，可通过阻止病毒吸附或病毒与宿主细胞间的融合，发挥抗病毒感染作 用。有研究表明，具有中和活性的单克隆抗体能有效预防流感病毒感染[SkehelILWiley DC.Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem2000, 69:531-569. ]〇
[0003] 流感病毒属于正黏病毒科的一种单链负股RNA病毒，分为A、B、C三个型，其中A型 流感病毒是一种具有高度传染性的病原体，可感染禽类和多种哺乳动物宿主。犬流感病毒 (canine influenza virus, CIV)是一种新发现的能在犬中引起流行的高度接触性呼吸道 传染病。犬流感病毒不仅对犬类的生存和健康带来严重的危害，同时也给人类健康带来巨 大的风险。一方面，流感病毒通过在犬等哺乳动物体内的适应，可能会更容易获得感染人的 能力，犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，犬有可能会作为中间宿主将流 感病毒传播给人类；另一方面，研究表明多种亚型的流感病毒能够感染犬类，当犬类感染两 种以上的流感病毒时，流感病毒可能会在犬体内经过基因重配形成能够感染人的重组流感 病毒。有学者推测，犬可能成为下一个引起大流行的新型流感病毒"混合器"。因此控制犬 流感病毒的传播和流行非常必要，在公共卫生上具有重要意义。
[0004] 自从2004年马源H3N8亚型犬流感在美国爆发，引起人们极大的关注，改变了 此前人们认为犬对流感病毒具有抵抗力的观点。2007年，H3N2亚型犬流感病毒在韩国 首次报道，随后，在中国陆续分离到此亚型的犬流感病毒。目前H3N2亚型犬流感病毒 已经成为中国犬群中流行的主要亚型[Zeng XJ，Lin Y，Zhao YB et al, Experimental infection of dogs with H3N2canine influenza virus from China. Epidemiol Infect2013, 141:2595-2603.]。
[0005] 疫苗接种是预防和控制流感病毒感染的主要措施，目前对CIV疫苗研究已取得一 些进展。2009年，美国农业部门（USDA)批准的H3N8亚型CIV疫苗上市，有效减少了病毒 的传播[Deshpande MS, Jirjis FFj Tubbs AL, et al. Evaluation of the efficacy of a canine influenza virus (H3N8)vaccine in dogs following experimental challenge. Vet Ther2009, 10:103-112.]。2012 年，韩国针对 H3N2CIV 的疫苗也已授权[Cho YS, Ha GW, Oh JS, et al. Canine influenza virus and vaccine therefore. United States Patent2012, Patent No:US8, 246, 962B2.]。尽管如此，疫苗接种仍有一定的局限性，在幼 年、老年及免疫力低下的犬群中疫苗接种有相当大的风险。而有中和活性的单克隆抗体，通 过抑制病毒对宿主细胞的吸附或复制过程而中和病毒；还可能参与体内其他的抗病毒保护 机制如免疫调理作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC)作用等，从而激活患犬体内的 细胞免疫，达到清除病毒的作用。目前为止，还没有针对犬流感病毒制备单克隆抗体进行治 疗的报道。
[0006] 血凝素（HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，参与病毒受体结合以及病毒入侵靶细 胞。HA分为两个亚单位HAl和HA2,流感病毒只有当HA裂解为HAl和HA2时才能发挥病毒 感染作用，因此制备针对HA抗原位点的具有中和活性的单克隆抗体一直被作为评价流感 病毒保护性的标准。然而，由于HAl氨基酸序列的高度变异性，针对HAl的单抗中和活性有 限[de Jong JC, Palache AM, Beyer ff, et al. Haemagglutination-inhibiting antibody to influenza virus. Dev Biol (Basel) 2003, 115:63-73.];而 HA2 位于 HA 的茎部，是所有 亚型流感病毒HA的保守区域，对病毒的黏附以及病毒入侵宿主细胞膜起到关键作用。本发 明制备针对H3N2犬流感病毒株JS/10的保守的HA2蛋白单克隆抗体，为H3N2犬流感病毒 感染的治疗提供了重要的免疫制剂，具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的目的在于制备针对H3N2犬流感病毒JS/10株的HA2蛋白单克隆抗体，为 H3N2犬流感病毒感染的治疗提供重要的免疫制剂。
[0009] 技术方案
[0010] 本发明将H3N2犬流感病毒江苏分离株JS/10扩增纯化后，用标准的杂交瘤技术获 得针对该毒株的mAbs，通过血凝抑制试验、细胞中和试验以及分段表达HA蛋白后Western blotting分析，最终鉴定获得针对HA2保守蛋白的mAb。步骤包括：
[0011] 1.通过鸡胚接种扩增H3N2犬流感病毒JS/10株，并采用差速离心和蔗糖密度梯度 超速离心纯化病毒；
[0012] 2.纯化病毒接种犬肾细胞（MDCK)，培养后测定半数组织细胞感染量（TCID5tl);
[0013] 3.采用杂交瘤技术制备H3N2犬流感病毒单克隆抗体以及制备腹水；
[0014] 4.单克隆抗体特性分析，包括血凝抑制抗体效价、中和抗体效价测定，以及抗原特 性鉴定等；
[0015] 5.单抗对3株流感病毒株的动物交叉保护试验。
[0016] 本发明提供了一种分泌针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细 胞，该杂交瘤细胞株mAb D7于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中 国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No :C2014176,分类命名：杂交瘤细胞株mAb D7。
[0017] 用所述杂交瘤细胞株mAb D7制备的单克隆抗体，可以在制备预防或控制流感病毒 的药物或免疫制剂中应用，或者在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中得 到应用。
[0018] 有益效果
[0019] 本发明针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体制备方法，为防控该病毒引起 的犬群感染，以及应对其对人类健康和公共卫生构成的潜在威胁奠定基础。在本发明中，术 语"半数组织细胞感染量（TCID 5tl) "是指能够引起半数组织细胞感染的病毒量，用来判定病 毒的毒力。
[0020] 在本发明中，术语"杂交瘤技术"是指骨髓瘤细胞与免疫动物脾细胞融合，形成能 分泌针对免疫抗原的特异性抗体即单克隆抗体的技术。该技术生产的单克隆抗体具有高特 异性、高纯度、重复性好、敏感性强、生产成本低等优点。
[0021] 本发明有以下创新点：
[0022] 1.采用注射单克隆抗体的方法预防和控制流感病毒的感染，具有特异性强、效价 高等优点。与传统的疫苗接种手段相比，取代了后者的不易大范围推广以及对犬群接种对 象的局限性的缺点，降低了风险性，提高了安全性；
[0023] 2.所获单抗具有中和活性，中和效价高达1 :12800,可阻止病毒吸附或病毒与宿 主细胞间的融合，从而有效预防流感病毒的感染；
[0024] 3.本发明所获单抗针对HA2蛋白，而针对HA抗原位点的具有中和活性的单克隆抗 体一直被作为评价流感病毒保护性的标准。
[0025] 由于HAl氨基酸序列的高度变异性，针对HAl的单抗中和活性有限，而HA2位于HA 的茎部，是所有亚型流感病毒HA的保守区域，并且对病毒的吸附以及病毒入侵宿主细胞膜 起到关键作用，因此本发明制备的针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体可对H3N2 亚型不同犬流感病毒株，甚至其他流感病毒株均具有良好的保护效果，具有潜在的应用前 旦 -5^ 〇
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1 :利用差速离心及蔗糖密度梯度离心法纯化的病毒电镜学观察，图片放大倍 数为 130000。
[0027] 图2 :H3N2犬流感病毒株感染MDCK后的细胞病变情况
[0028] A图为病毒感染组，可见细胞出现明显的空泡、拉丝结网现象；B图为对照组，即未 接毒的MDCK细胞，细胞菱形且排列较整齐。
[0029] 图3 :mAbD7的抗原鉴定，即D7对重组蛋白HA、HA1和HA2的Western Blotting结 果，1-4泳道分别为蛋白Marker、D7针对HA蛋白、D7针对HAl蛋白和D7针对HA2蛋白。
[0030] 图4 :mAb D7预处理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10 (A)和⑶/12 (B)以及猪流 感病毒株SD/05(C)后的体重变化。结果用体重百分比表示，*，P〈0.05和**，P〈0.01，分别 指mAbD7处理组的小鼠体重相比病毒感染组差异显著和极显著；#，P〈0.05,指mAb D7处理 组的小鼠体重相比PBS对照组差异显著。
[0031] 图5 :mAb D7预处理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10 (A)和⑶/12 (B)以及猪流 感病毒株SD/05 (C)后的肺脏病毒载量检测。结果以IoglO为底数的每克肺脏组织中RNA 病毒拷贝数表示。*，P〈〇. 05和**，P〈0. 01，分别指单抗D7组相比于其他两组差异显著和极 显著。
[0032] 图6 :mAb D7预处理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10和⑶/12以及猪流感病 毒株SD/05后的肺脏病变计分。基于肺脏病理组织学变化给予0-3分的计分。*，P〈0. 05 和**，P〈0.01，分别指mAb D7处理组的小鼠肺脏病变计分相比病毒感染组差异显著和极显 著。
[0033] 生物保藏
[0034] 杂交瘤细胞株mAb D7于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC N〇:C2014176,分类命名：杂交瘤细胞株mAb D7。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件， 例如《分子克隆实验室手册》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (Sambrook等人）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。而标准的杂交瘤技术，则 参照[Vareckova E, Betakova T, Mucha V，et al. Preparation of monoclonal antibodies for the diagnosis of influenza A infection using different immunization protocols. J Immunol Methodsl995, 180:107-116] 〇
[0036] (一）H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体的制备
[0037] 1 ?标准毒株的选择
[0038] 本发明中所使用的标准毒株为犬流感病毒病毒株A/Canine/ Jiangsu/06/2010 (H3N2)(简称 JS/10)，其 GenBank 序列号从 JN247615 到 JN247623。毒株 及其序列参照网址：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore。
[0039] 2. H3N2犬流感病毒JS/10株的扩增与纯化
[0040] 将病毒株JS/10的悬液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每个鸡胚接种0. 2mL。无菌 收取接种病毒后48-96h鸡胚尿囊液，选择血凝效价大于等于26的尿囊液；分别采用3000， 5000和8000rpm的转速进行差速离心，使流感病毒充分释放出来，再用20 %，40 %及60 %的 蔗糖密度梯度离心，使病毒沉降后，PBS重悬洗涤一次后，沉降的病毒颗粒用PBS重悬。纯 化的病毒电镜结果见图1。
[0041] 3. JS/10细胞毒的获得以及TCID5tl的测定
[0042] JS/10株鸡胚尿囊液接种MDCK细胞，感染48_96h后，当细胞出现明显的空泡、拉丝 结网细胞病变现象时，收集细胞毒，细胞病变（CPE)见图2。
[0043] TCID5tl试验：感染前ld，96孔细胞板铺上单层MDCK细胞。第二天，JS/10株尿囊 液100 y L接种MDCK细胞，横向依次倍比稀释，倒数第二列为阳性对照，最后一列为空白对 照，每个稀释度3个重复。每日观察CPE，记录各稀释度出现细胞病变的孔数。病毒滴度表 示为 TCID5Q/mL，测得 JS/10 毒株毒价为 10713TCID5Q/mL。
[0044] 4. H3N2犬流感病毒单抗的制备
[0045] 1)动物免疫
[0046] 纯化的病毒JS/10用PBS稀释后接种6周龄BALB/c小鼠，一免加弗氏完全佐剂 (Sigma)皮内多点注射200 iiL，其中含有IOOiig的病毒。二免和三免采用弗氏不完全佐剂 (Sigma)皮内多点注射，免疫剂量与一免相同。三免两周后眶下丛毛细管采血。ELISA检测 血清抗体效价达到1 :25600。血清抗体效价达到峰值后进行最后一次加强免疫，即腹腔注 射PBS稀释的100 ii g纯化病毒200 ii L，3d取小鼠脾脏，进行细胞融合。
[0047] 2)饲养细胞的制备与细胞融合
[0048] 饲养细胞的制备：将1只BALB/c小鼠处死，体表酒精消毒。无菌剪开腹部皮肤，露 出腹膜，用无菌注射器吸取SmLHAT完全培养基（Sigma)注入腹腔，用酒精棉球轻轻按压腹 腔数次，吸出培养基，置于细胞培养瓶中，计数后补加HAT完全培养基，使细胞密度为2 X IO5 个/mL，在融合前12h，每孔100 ii L加入96孔细胞培养板。
[0049] 细胞融合：无菌取脾，制备免疫脾细胞，与对数生长期的sp2/0细胞按1:6的比例 混合，IOOOrpm离心lOmin，弃上清。用手掌轻击离心瓶底，使沉淀的细胞打散。将离心瓶底 部放入40°C水浴中，边旋转边加入融合用的PEG50001mL，在Imin内加完，继续旋转同时加 入无血清1640培养基15mL，在90s内加完，由慢到快，前5s加lmL。室温静置IOmin后， IOOOrpm离心5min，弃上清，将HAT选择培养液加入到细胞融合物中，悬浮细胞，分配到已有 饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37°C、5% CO2的温箱中培养。细胞融合后5d，用HAT培 养基半换液，IOd后用HT培养基（Sigma)全换液，筛选获得生长良好的杂交瘤细胞。
[0050] 3)亚克隆与腹水的制备
[0051] 亚克隆：有限稀释法进行。每次亚克隆均通过ELISA方法检测上清效价，三次亚 克隆均阳性的单个克隆扩大培养并及时冻存。通过血凝抑制试验筛选得到7株可分泌针对 JS/10病毒株的特异性单抗的杂交瘤细胞株。
[0052] 腹水制备：10周龄的经产母鼠预先腹腔注射液体石蜡，一周后腹腔注射扩大培养 的PBS稀释的杂交瘤细胞，一周后观察母鼠腹部及其精神状态，待其腹部隆起明显时，收集 腹水，离心后取上清56°C水浴30min灭活，-20°C冷冻保存。
[0053] (二）针对H3N2犬流感病毒JS/10株的单克隆抗体的鉴定
[0054] 1 ?血凝抑制（HI)效价测定
[0055] 将腹水用PBS稀释5倍后做血凝抑制试验。
[0056] 首先进行血凝试验，以确定H3N2犬流感病毒JS/10株尿囊液的血凝效价。首先在 一次性血凝板的第一排的1-12孔加入50 ii L PBS，其次在第一孔加入50 ii L病毒尿囊液，混 匀后吸50 ii L到第3孔，依次倍比稀释直到第10孔，混匀后弃去50 iiL。最后两孔（11、12) 为红细胞对照。接着每孔加入50iiLl%红细胞轻轻摇动混匀。手动震荡，37°C静置30min 后观察结果。以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作为该病毒液的红细胞凝 集效价。JS/10株尿囊液的血凝效价为2 6。
[0057] 做血凝抑制试验前，首先用PBS稀释病毒尿囊液以获得4个血凝单位的犬流感病 毒。血凝抑制试验的步骤如下：
[0058] (1)在血凝版的1-12孔加入25 ii L PBS，最后两孔加入50 ii L分别作为阳性与阴 性对照。
[0059] (2)第一孔加入待捡已稀释的腹水25 L，混匀后吸25 L至第2孔，倍比稀释至 第10孔，混匀后弃25 iiL。
[0060] (3)在1-10孔，每孔加稀释好的25 ii L4个血凝单位的病毒悬液，37°C静置20min， 让病毒与腹水，即抗原抗体充分反应。
[0061] (4)将1 %红细胞轻轻摇动混勻，在1-12孔中每孔加入50 ii L。
[0062] (5)手动震荡Imin后，37°C静置30min后观察结果。
[0063] 能将病毒凝集红细胞的作用完全抑制的血清的最高稀释倍数即为该稀释腹水的 红细胞凝集抑制效价。7株单抗的HI效价见表1。
[0064] 2?细胞中和效价测定
[0065] 将5倍稀释的腹水作倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50 y L营养 液DMEM，再加50 L已稀释的腹水，混匀后吸50 L至下一孔直至倒数第三孔），每支单 抗的腹水做3个重复。然后各孔内加入50iiL稀释至200TCID5(I的JS/10细胞毒（毒价 为10 713TCID5(l/mL)37°C孵育Ih后，吸出每孔液体，加至长满单层的MDCK细胞孔中。倒 数第二列为阳性对照，即细胞仅与病毒作用；最后一列为空白对照，即正常的MDCK细胞。 Reed-Muench法计算细胞中和效价。同时，将7株获得的H3N2犬流感病毒单抗用小鼠单克 隆抗体Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒（Tiangen公司）对7株单抗亚类进行鉴定。HI效价 和中和效价及其抗体亚类见表1。单抗株D7中和效价高达I :12800。
[0066] 表17株针对H3N2犬流感病毒JS/10株的单抗特性
[0067]
【权利要求】
1. 一种分泌针对H3N2犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞 株mAb D7于2014年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大 学，保藏编号为CCTCC No :C2014176,分类命名：杂交瘤细胞株mAb D7。
2. 用权利要求1所述杂交瘤细胞株mAb D7制备的单克隆抗体。
3. 权利要求2所述单克隆抗体的应用。
4. 权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应 用。
5. 权利要求2所述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物 中的应用。
【文档编号】A61P31/16GK104293739SQ201410535918
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月11日 优先权日:2014年10月11日
【发明者】刘永杰, 谢星, 庞茂达, 林焱, 赵艳兵, 梁珊, 陆承平 申请人:南京农业大学