双特异性抗-her抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供抗HER抗体，包括多特异性抗HER抗体，包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。本文还提供比传统EGFR拮抗剂更低毒性的EGFR/HER3多特异性抗体。
【专利说明】双特异性抗-HER抗体
[0001] 本申请是申请日为2010年3月19日、发明名称为"双特异性抗-HER抗体"的中 国专利申请No. 201080012374. 5的分案申请。
[000引相关申请
[0003] 本申请根据35 use 119(e)要求2009年3月20日提交的美国临时申请号 61/210562的优先权的权益，其公开的全文通过引用并入本文。 发明领域
[0004] 本发明涉及抗肥R抗体，包括多特异性抗肥R抗体，其具有对于至少两种不同肥R 受体的结合特异性，W及所述抗体治疗疾病或病症的用途。
[0005] 发明背景
[0006] 受体酪氨酸激酶的肥R家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包 括四个独特的成员，包括表皮生长因子受体巧GFR、化bBl或肥R1)、肥R2巧rbB2或plSSneu)、 肥R3 巧rbB3)和肥R4 巧rbB4 或 tyro2)。
[0007] 由erbBl基因编码的EGFR已被认为是人类恶性肿瘤的病因。具体而言，在乳腺癌、 膀脫癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌W及成胶质细胞瘤中已经观察到EGFR表达的升高。EGFR 受体表达的升高常常与由同样的肿瘤细胞的EGFR配体，转化生长因子a (TGF-a)的产量 增加有关，其通过自分泌刺激途径导致受体活化。Baselga和Mendelsohn化armac.化er. (药学理论）64:127-154 (1994)。针对EGFR或其配体TGF-a和EGF的单克隆抗体已经作为 治疗此类恶性肿瘤的治疗剂进行了评估。参见例如Baselga和Mendelsohn,见上文；Masui 等，Cancer Research (癌症研究）44:1002-1007 (1984);和 Wu 等，J. Clin. Invest.(临床 研究杂志）95:1897-1905 (1995)。
[0008] 肥R家族的第二个成员肥R2(pl85neu)最初被鉴定成转化基因的产物，来自经 化学处理的大鼠的成神经细胞瘤。neu原癌基因的活化形式产生自所编码蛋白质跨 膜区中的点突变（额氨酸变成谷氨酸）。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同系 物的扩增，而且该与预后不良有关（Slamon等，Science (科学），235:177-182 (1987); Slamon 等，Science (科学），244:707-712 (1989);和美国专利 4,968,603)。在其它癌 瘤中也已观察到肥R2的过表达（频繁但不均一，原因在于基因扩增），所述癌瘤包括胃、 子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、膜和膀脫的癌瘤。参见King等，Science (科 学），229:974 (1985);化kota 等，Lancet (柳叶刀）：1:765-767 (1986) ;Rikushige 等，Mol Cell Biol.(分子细胞生物学），6:955-958 (1986) ;Guerin 等，Oncogene Res.(癌基 因研究），3:21-31 (1988) ;Cohen 等，0ncogene(癌基因），4:81-88(1989);化nemura 等，Cancer Res.(癌症研究），51:1034 (1991) ;Borst 等，Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner 等，Cancer Res.(癌症研究），50:421-425 (1990) ;Kern 等，Cancer Res.(癌症研 究），50:5184(1990) ;Park 等，Cancer Res.(癌症研究），49:6605(1989) ;aiau 等，Mol. Carcinog.(分子致癌作用），3:254-257 (1990) ;Aasland 等，Br. J. Cancer (英国癌症杂 志）57:358-363 (1988) ;Williams 等，Pathobiology(病理学）59:46-52 (1991);和 McCann 等，Cancer(癌症），65:88-92(1990)等。肥R2可在前列腺癌中过表达佑u等，Cancer Lett. (癌症通讯）99:185-9 (I996) ;Ross 等，Hum. Pathol.(人类病理学）28:82了-33 (I997); Ross 等，Cancer(癌症）79:2162-70(1997);和 Sadasivan 等，J.化〇1.(泌尿学杂 志）150:126-31 (1993))。
[0009] 已经描述了针对大鼠pissneu和人肥R2蛋白质产物的抗体。化ebin及其 同事制备了针对大鼠neu基因产物，pissneu的抗体。参见例如化ebin等，Cell (细 胞）41:695-706 (1985) ;Myers 等，Meth.Enzym.(酶学方法）198:277-290(1991);和 W094/22478。Drebin 等，Oncogene (癌基因）2:273-277 (1988)报道了与 plSSneu 的两个独 特区域有反应性的抗体混合物对植入裸鼠的neu转化NIH-3T3细胞产生协同的抗肿瘤作 用。还可参见1998年10月20日颁发的美国专利5, 824, 311。
[0010] Hudziak 等，Mol. Cell. Biol.(分子细胞生物学）9 (3) : 1165-1172 (1989)描 述了一组肥R2抗体的生成，并利用人乳房肿瘤细胞系SK-BR-3鉴定。通过72小时后 单层细胞的结晶紫染色测定了暴露于抗体后SK-BR-3细胞的相对细胞增殖。利用此测 定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56%。该组其它抗体在此 测定法中将细胞增殖降低至较低程度。还发现抗体4D5使过表达肥R2的乳房肿瘤细 胞系对TNF-a的细胞毒性作用变得敏感。还可参见1997年10月14日颁发的美国专 利5, 677, 171。化化iak等人的文章中讨论的肥R2抗体还在W下文献中进行了表征： 化11(117 等，Cancer Research (癌症研究）50:1550-1558 (1990) ;Kotts 等，In Vitro (体 外）26(3) :59A (1990) ;Sarup 等，Growth Regulation(生长调节）1:72-82 (1991);化巧 ard 等，J. Clin. Immunol.(临床免疫学）11 (3): 117-127 (1991) ;Kumar 等，Mol. Cell. Biol.(分 子细胞生物学）11 (2) : 979-986 (1991) ;Lewis 等，Cancer Immunol. Immunother.(癌症免疫 学和免疫疗法）37:255-263 (1993) ;Pietras 等，Oncogene (癌基因）9:1829-1838 (1994); Vitetta 等，Cancer Research (癌症研究）54:5301-5309 (1994) ;Sliwkowski 等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志）269 (20) : 14661-14665 (1994) ;Scott 等，J. Biol. Chem.(生物化 学杂志）266:14300-5 (1991) ;D' souza 等，Proc.化tl. Acad. Sci.(美国国家科学院学 报）91:7202-7206 (1994) ;Lewis 等，Cancer Research (癌症研究）56:1457-1465 (1996); 和 Schaefer 等，Oncogene (癌基因）15:1385-1394 (1997)。
[0011] 鼠肥R2抗体4D5的重组人源化型式（化uMAb4D5-8，rhuMAb肥R2,曲妥珠单抗 (trastuzumab)或HERCEPTIN";美国专利5, 821，337)在临床上对患有肥R2过表达的转 移性乳腺癌并已接受广泛的早期抗癌疗法的患者起作用炬aselga等，J. Clin.化col.(临 床肿瘤学杂志）14:737-744(1996))。曲妥珠单抗在1998年9月25日得到了食品和药品管 理局的销售许可，可用于治疗所患肿瘤过表达肥R2蛋白质的转移性乳腺癌患者。
[0012] W下文献中描述了具有各种特性的其它肥R2抗体；Tagli油ue等，Int. J.Cancer(国际癌症杂志）47:933-937(1991) ;McKenzie 等，Oncogene(癌基 因）4:543-548(1989) ;Maier 等，Cancer Res.(癌症研究）51:5361-5369(1991); Bacus 等，Molecular Carcinogenesis(分子致癌作用）3:350-362(1990); Stancovski 等，PNAS(USA)88:8691-8695 (1991) ;Ba州S 等，Cancer Research(癌症研 究）52:2580-2589 (1992) ;Xu 等，Int. J. Cancer (国际癌症杂志）53:401-408 (1993); W094/00136 ;Kasprzyk 等，Cancer Research (癌症研究）52:2771-2776 (1992) ;Hancock 等，Cancer Res.(癌症研究）51:4575-4580 (1991);化 awver 等，Cancer Res.(癌症研 究）54:1367-1373 (1994) ;Arteaga 等，Cancer Res.(癌症研究）54:3758-3765 (1994); Harwerth 等，J. Biol. Chem.(生物化学杂志）267:15160-15167(1992);美国专利 5,783, 186 ;和 Kla卵er 等，Oncogene (癌基因）14:2099-2109 (1997)。
[0013] 同源性筛选使得肥R受体家族的两个其它成员得W鉴定：肥R3(美国专利 5, 968, 511,5, 183,884 和 5,480,968 W 及 Kraus 等，PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989))和 肥R4 (欧洲专利申请599, 274 ;Plowman等，Proc.化tl. Acad. Sci. USA,(美国国家科学院学 报），90:1746-1750 (1993);和 Plowman 等，化Uire (自然），366:473-475 (1993))。该两种 受体均在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
[0014] 通常发现肥R受体在细胞中有多种组合，而且认为它的异二聚化增加了对各种 肥R配体的细胞应答的多样性巧a巧等，Breast Cancer Research and Treatment(乳腺癌 研究和治疗）35:115-132(1995))。EGFR受到6种不同配体的结合；表皮生长因子巧GF)、 转化生长因子a (TGF-a)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子（皿-EGF)、目动物纤维素和 epiregulin (Groenen 等，Growth I^actors (生长因子）11:235-257(1994))。由单一基因 的可变剪接产生的一个调蛋白蛋白质家族是肥R3和肥R4的配体。调蛋白化eregulin) 家族包括a、目和Y调蛋白化olmes等，Science (科学），256:1205-1210 (1992);美 国专利 5, 641, 869 ;和 Schaefer 等，Oncogene (癌基因）15:1385-1394 (1997)) ;neu 分化因子（NDFs);神经胶质生长因子（GGFs):己醜胆碱受体诱导活性（ARIA);及感 觉和运动神经元衍生因子（SMD巧。有关综述参见Groenen等，Growth化ctors (生 长因子）11:235-257 (1994) ;Le址 e，G.Molec.&Cel l.Neurosci.(分子和细胞神经科 学）7:247-262 (1996)和 Lee 等，Pharm. Rev.(药学综述）47:51-85 (1995)。还鉴定了另外 H种肥R配体；神经调节蛋白-2 (NRG-2)，据报道它结合肥R3或肥R4 (化ang等，化化re (自 然）387509-512 (1997);和 Carraway 等，化Uire (自然）387:512-516 (1997));神经调节蛋 白-3,它结合肥R4狂hang等，PNAS (USA) 94 (18) : 9562-7 (1997));和神经调节蛋白-4,它 结合肥R4(Harari等，Oncogene (癌基因）18:2681-89 (1999))。皿-EGF、目动物纤维素和 epiregulin 也结合肥R4。
[0015] 尽管EGF和TGF a不结合肥R2,但是EGF刺激EGFR和肥R2形成异二聚体，它活 化EGFR并导致异二聚体中肥R2的转磯酸作用。二聚化作用和/或转磯酸作用似乎活化 肥R2酪氨酸激酶。参见Ea巧等，见上文。同样，当皿R3与肥R2共表达时，形成有活性 的信号复合物，而针对肥R2的抗体能破坏此复合物（Sliwkowski等，J. Biol.化em.(生 物化学杂志），269 (20) : 14661-14665 (1994))。此外，在与肥R2共表达时，肥R3对调蛋白 (HRG)的亲和力提高到了更高的亲和力状态。关于肥R2-肥R3蛋白质复合物还可参见Levi 等，]〇1111131(^爬111'〇3(316]1〇6(神经科学杂志）15:1329-1；340(1995);]\1〇1'1'13367等，？1'〇(3. 化tl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报）92:1431-1435 (1995);和 Lewis 等，Cancer Res.(癌症研究），56:1457-1465 (1996)。肥R4,与肥R3类似，与肥R2形成有活性的信号复 合物（Carraway 和 Cantl巧，Cell (细胞）78:5-8 (1994))。
[0016] 目前祀向肥R途径的治疗剂用于治疗疾病诸如乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠直 肠癌、头和颈癌和膜腺癌。尽管该些治疗剂具有一些成功，存在涉及天然和诱导抗性 和毒性的问题。Arteaga化.J Clin Oncol (临床肿瘤学杂志）21:289 - 91s(2003); HosM S,等，Gan To Kagaku Ryoho 31:1209 - 13(2004) ;Viloria-Petit AM,和 Ke;rbelRS.IntJRadiat0ncolBiolF^hys58:914 - 26(2004);BiancoR，等，E；ndocr Relat Cancer 12 :S159 - 71 (2005) ;Engelman JA,和 Janne PA. , Clin Cancer Res (临 床癌症研究）14:2895 - 9(2008) ;Davoli A,等，Cancer Qiemother 化armacol.(癌 症化疗药学）65 (4): 611-23 (2010);化 hlmann PR,等，Cl in Cancer Res (临床癌症研 究）.15 (24) : 7479-7491 (2009)。具体地，祀向肥RUEGFR)的治疗剂常常与不希望的 副作用相关，诸如显著水平的皮肤毒性。Robert,等，Lancet化cology(柳叶刀肿瘤 学）6:491-500 (2005).
[0017] 因此，存在开发祀向肥R途径的改善的治疗剂的需要。
[001引发明概述
[0019] 本发明提供多特异性抗体，其包含特异性结合至少两个肥R受体的抗原结合结构 域，所述肥R受体选自由（a化GFR和肥R2,化化GFR和肥R3,和（C化GFR和肥R4组成的组。 所述抗体抑制至少一个所述HER受体的生物学活性。在具体的实施方案中，所述多特异性 抗体特异性结合其祀标肥R受体并且不特异性结合非祀标肥R受体。因此，在一个实施方 案中，所述抗体特异性结合EGFR和肥R3但是不特异性结合肥R2或肥R4。在另一个实施方 案中，所述抗体特异性结合EGFR和肥R2但是不特异性结合肥R3或肥R4。在另一个实施方 案中，所述抗体特异性结合EGFR和肥R4但是不特异性结合肥R2或肥R3。本发明也提供特 异性结合祀标肥R受体的单特异性抗体。
[0020] 本发明一方面提供能够特异性结合EGFR和另一个肥R受体的多特异性抗体，其比 传统EGFR枯抗剂，诸如西妥昔单抗（cetuximab)毒性更低。在一个实施方案中，所述毒性 是皮肤病学毒性。在一个实施方案中，多特异性肥R抗体包含特异性结合EGFR和HER3的 抗原结合结构域。
[0021] 一方面，本发明提供多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结 构域。在一个实施方案中，所述多特异性抗体比EGH?枯抗剂毒性更低。在一个实施方案 中，所述多特异性抗体抑制EGFR和肥R3中至少一个的生物学活性。在一个实施方案中，所 述抗体抑制EGF结合EGFR。在另一个实施方案中，所述抗体抑制TGF-a诱导的EGH?磯酸 化。在一些实施方案中，所述抗体抑制肿瘤细胞生长。在一个实施方案中，所述多特异性抗 体特异性结合EGFR和肥R3但是不特异性结合肥R2或肥R4。
[002引在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含W低于1(T6M的Kd特异性结合EGFR和 肥R3的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述多特异性抗体包含W低于10-6M的Kd特 异性结合EGFR并且W低于10- 7M的Kd特异性结合肥R3的抗原结合结构域。
[0023] 在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构域的多特 异性抗体包含（a) HVR-H1，其包含氨基酸序列LSGDWIH (SEQ ID NO: 48);化)HVR-肥， 其包含氨基酸序列VGEISAAGGYTD(SEQ ID N0:51);和（c)HVR-册，其包含氨基酸序列 ARESRVS阳AAMDY (SEQ ID NO: 53);和（d) HVR-L1，其包含氨基酸序列 NIATDVA (SEQ ID N0:55) ;(e)HVR-L2,其包含氨基酸序列SASF(SEQ ID N0:56);和（f)HVR-L3,其包含氨基酸 序列 SE阳PYT(SEQ ID N0:57)。
[0024] 在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构域的多特异性 抗体包含（a)重链可变结构域，其与氨基酸序列SEQ ID N0:30具有至少95%的序列同一 性；化）轻链可变结构域，其与氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少95%的序列同一性；或 (C)如（a)中的重链可变结构域序列和如化）中的轻链可变结构域序列。在一个实施方案 中，包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含SEQ ID NO: 30的 重链可变结构域序列。在一个实施方案中，包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构 域的多特异性抗体包含SEQ ID NO: 29的轻链可变结构域序列。在另一个实施方案中，包含 特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构域的多特异性抗体包含SEQ ID NO: 30的重链可 变结构域序列和SEQ ID NO:29的轻链可变结构域序列。
[0025] 在一些实施方案中，包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构域的多特异性 抗体是全长IgGl抗体。
[0026] 本发明的一方面提供编码所述多特异性肥R抗体的分离的核酸。另一方面提供包 含编码所述多特异性肥R抗体的核酸的宿主细胞。还一方面提供产生多特异性肥R抗体的 方法，包括培养包含编码所述多特异性肥R抗体的核酸的宿主细胞，从而产生所述的抗体。
[0027] 本发明一方面提供包含多特异性肥R抗体和细胞毒性剂的免疫缀合物。另一方面 提供包含多特异性肥R抗体和药用载体的药物制剂。
[0028] 本发明一方面提供治疗患有癌症的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的多 特异性肥R抗体。在一个实施方案中，所述多特异性肥R抗体包含特异性结合EGFR和肥R3 的抗原结合结构域。在一个实施方案中，通过所述多特异性肥R抗体治疗的癌症包含表达 EGFR和肥R3的细胞。在一个实施方案中，通过所述多特异性肥R抗体治疗的癌症是乳腺 癌化 reast cancer)、结肠直肠癌（colorectal cancer)、膜腺癌（pancreatic cancer)、头 和颈癌化ead and neck cancer)、黑素瘤（melanoma)、卵巢癌（ovarian cancer)、前列腺癌 (prostate cancer)或非小细胞月市癌（non-small lung cell cancer)。
[0029] 本发明另一方面提供抑制个体中肥R受体生物学活性的方法，包括向所述个体施 用有效量的多特异性肥R抗体。在一个实施方案中，所述多特异性肥R抗体包含特异性结 合EGFR和肥R3的抗原结合结构域。
[0030] 本发明一方面提供用作药物的多特异性肥R抗体。另一方面提供用于治疗癌症， 诸如乳腺癌、结肠直肠癌、膜腺癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌或非小细胞肺癌的 多特异性肥R抗体。另一方面提供用于抑制肥R受体的生物学活性的多特异性肥R抗体。 在一个实施方案中，所述多特异性肥R抗体包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构 域。
[0031] 本发明另一方面提供用于制备药物的多特异性肥R抗体。在一个实施方案中，所 述药物可用于治疗癌症，诸如乳腺癌、结肠直肠癌、膜腺癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列 腺癌或非小细胞肺癌。在一个实施方案中，所述药物用于抑制肥R受体的生物学活性。在 一个实施方案中，所述多特异性肥R抗体包含特异性结合EGFR和肥R3的抗原结合结构域。 在一个实施方案中，所述多特异性肥R抗体比传统EGFR枯抗剂，诸如西妥昔单抗毒性更低。
[0032] 附图简述
[0033] 图1显示在A431异种移植模型中通过抗EGFR抗体D1. 5抑制肿瘤生长。
[0034] 图2显示具有双重特异性的克隆的结合特异性。
[00巧]图3显示使用选择的具有双重特异性（抗EGFR/肥R3和抗EGFR/肥R2抗体）的抗 体抑制TGF- a -诱导的EGFR磯酸化。
[0036] 图4显示抗-EGFR/肥R3抗体阻断调蛋白结合肥R3-ECD-FC。
[0037] 图5显示在MCF7细胞中通过抗EGFR/肥R3双特异性抗体抑制HRG诱导的受体磯 酸化。
[003引 图6显示通过抗EGFR/肥R3抗体抑制MDA-175细胞的细胞增殖。
[0039] 图7是显示在4D5-FV结构上定位的D1. 5-100热点的图。
[0040] 图8概述了使用鸟枪文库对于D1. 5-100EGFR-HER3抗体亲和力成熟的策略。
[0041] 图9显示两个选择的亲和力成熟的抗体值L7和化11)对于EGFR和肥R3两者是 特异性的。
[0042] 图10:A)显示亲和力成熟的抗体DL7和化11与母体抗体D1. 5对于EGFR的抑制 功能的比较。B)显示亲和力成熟的抗体DL7和化11与单特异性抗肥R3抗体化3. 6对于 肥R3反式激活的抑制功能的比较。
[0043] 图11A)提供图显示化11与培妥珠单抗（pertuzum油），抗EGFR抗体，和抗肥R3抗 体，或化3. 6, D1. 5,或D1. 5+DL3. 6的组合相比对于H1666细胞生长抑制功能的比较，所述 细胞是NS化C细胞系，表达肥R2,肥R3, EGFR和EGFR配体，生长用HRG刺激。B)提供图显 示化11与培妥珠单抗，抗EGFR抗体和抗肥R3抗体，或化3. 6, D1.5或D1.5+DL3. 6的组合 相比对于化66細SCLC系生长抑制功能的比较，生长用HRG和TGF a刺激。
[0044] 图12A)提供图显示通过化11与pMab，抗EGFR抗体，和抗肥R3抗体相比较抑制 HCA-7细胞的增殖，该细胞是结肠直肠癌细胞系，表达肥R2,肥R3和EGFR。细胞生长用HRG 刺激。B)提供图显示如图12A中的HCA-7细胞生长的抑制，除了细胞生长用HRG+TGFa刺 激。
[004引图13显示化lu-3细胞增殖的抑制，所述细胞是NS化C系，过表达肥R2并且具有 正常水平的肥R3和EGFR。细胞生长用HRG刺激，抗体W剂量依赖方式测试。
[0046] 图14概述了对于D1. 5-201亲和力成熟的分选策略。
[0047] 图15显示通过DL11，DL1化和DLllf抑制MDA-175细胞增殖。
[0048] 图16显示化Ilf抑制调蛋白诱导的皿R3磯酸化和TGF- a诱导的EGFR磯酸化。
[0049] 图17是显示在肥A-7肿瘤移植模型中通过化11和化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0050] 图18是显示在册58NSCLC异种移植模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0051] 图19显示通过化3-1化，化3.化和化3. 6抑制HRG诱导的肥R3磯酸化。
[0052] 图20:通过DL3-Ub，DL3.化和DL3. 6抑制MDA-175细胞增殖。
[0053] 图21是显示在FaDu癌症模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0054] 图22是显示在BxPC3膜腺癌模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[00巧]图23是显示在化lu-3非小细胞肺癌模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0056] 图24是显示在A431上皮癌模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0057] 图25是显示在MAXF44乳腺癌模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0058] 图26是显示在DU145前列腺癌模型中通过DLllf抑巧[J肿瘤生长的图。
[0059] 图27是显示在0VXF550卵巢癌模型中通过化Ilf抑制肿瘤生长的图。
[0060] 图28显示在数个细胞系中DLllf诱导ADCC。
[0061] 图 29 显示 DLllf-N297A 缺少 ADCC 活性。
[0062] 图30显示在肥92NS化C癌症模型中通过化Ilf和化llf-N297A抑制肿瘤生长。
[006引图31A-C是提供关于EGFR枯抗剂疗法观察到的非临床和临床毒性信息的表。
[0064] 图32是提供关于疹/脱屑和瘦疮/瘦疮样疹分级信息的表。
[0065] 图33提供具有K油at编号的数个抗肥R抗体的重链可变结构域和轻链可变结构 域的氨基酸比对。图33A显示下述抗体的轻链可变结构域：DUSEQ ID N0:58);D1.5(SEQ ID N0:24) ;D1.5-100(SEQ ID N0:40) ;DL11(SEQ ID N0:27) ;DL1化（SEQ ID N0:29); DLllf(SEQ ID N0:29)。图33B显示下述抗体的重链可变结构域：D1(SEQ ID N0:25); Dl. 5(沈 Q ID N0:25) ;D1.5-100(SEQ ID N0:25) ;DL11(沈 Q ID N0:28) ;DL1 化（SEQ ID NO:28) ;DL1If(SEQ ID NO:30)。
[006引发明详述
[0067] I.定义
[0068] 除非另有定义，本文使用的所有专口术语、符号和其它科学术语意图具有本发明 所属领域技术人员普遍理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或易于引用，本文定义了 具有普遍理解含义的术语，并且本文包含此类定义没有必要解释为其代表了与本领域通常 理解的实质上的差异。本文中描述或提到的技术和程序一般得到了本领域技术人员的充分 理解，而且利用常规方法得W普遍采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的分子克隆 的方法；Sambrook 等人，Molecular Cloning:A L油oratory Manual (分子克隆；实验室指 南）第二片反（1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.。 如果合适，涉及使用市售的试剂盒和试剂的程序一般根据制造商规定的方案和/或参数进 行，除非另有说明。
[0069] 在描述本发明的方法、试剂盒及其用途之前，应当理解本发明不限于所述具体方 法、方案、细胞系、动物种或属、构建物和试剂，因为它们当然可W变化。还应当理解本文所 用术语只是为了描述具体实施方案，并非意图限制本发明的范围，只有所附权利要求才对 本发明范围进行了限制。
[0070] 必须注意的是，在用于本文及所附权利要求时，除非上下文另有明确规定，单数形 式"一个"、"一种"和"所述"包括复数所指物。
[0071] 在本说明书和权利要求书全文中，词语"包括"或变体诸如"包含"或"含有"，应当 理解为意指包括所述的整数（整体）或整数（整体）的组，但是不排除任何其它整数（整 体）或整数（整体）的组。
[0072] 本文中术语"抗体其最广义使用，特别是涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异 性抗体和抗体片段，只要它们表现出所希望的生物学活性。术语"多特异性抗体"W最广义 使用，具体涵盖包含该样的抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域具有多表位特异 性（即，能够特异性结合一种生物分子上的两个或多个不同表位或能够特异性结合在两种 或多种不同生物分子上的表位）。抗原结合结构域的一个具体实例是VgVt单元，其由重链可 变结构域（Vh)和轻链可变结构域（Vl)构成。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具 有两个或多个乂1^和乂11结构域的抗体、抗体片段如？油、？巾、(13。￥、30。￥、双抗体（(1；[油0(1163)、 双特异性双抗体和H链抗体（tri油odies)、已被共价或非共价连接的抗体片段。"双特异性 抗体"是包含该样的抗原结合结构域的多特异性抗体，所述抗原结合结构域能够特异性结 合一个生物分子上的两个不同表位，或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特 异性抗体在本文中也称为具有"双特异性"或是"双特异性的"。
[0073] 在某些实施方案中，本发明的抗体对于其祀标肥R或肥Rs具有的解离常数化d) 《1 y M,《lOOnM,《lOnM,《InM,《0. InM,《0. OlnM,或《0. OOlnM(例如 1〇-8m W下，例如 i〇-8m 至 i〇-i3m,例如，i〇-9m 至 i〇-i3m)。
[0074] 基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链（L)和两条相同的重链化）构成的异四 聚体糖蛋白（IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肤组成，因此包含10 个抗原结合位点；而分泌型IgA抗体可聚合形成包含2-5个基本的4链单元及J链的多价 装配物）。在IgG的情况中，4链单元通常约150, 000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫 键与重链相连，而取决于重链的同种型，通过一个或多个二硫键彼此连接两条重链。每条重 链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有一个可变结构域（Vh)，接 着是H个（对于每种a和y链）和四个（对于y和e同种型）恒定结构域（Ch)。每条 轻链在N-末端具有一个可变结构域（￥^，接着是其另一端的一个恒定结构域（片)。￥^与￥? 排列在一起，而片与重链的第一恒定结构域（ChI)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为 在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的Vh和Vl 一起形成一个抗原结合位点。关 于不同类另。抗体的结构和性质，参见女口 Basic and Clinical ImmunoloRV(基本矛口临巧酶 学）,第八版，Daniel P. Stites, Abba I. Terr 和 Tristram G. Parslow (编辑），Appleton & Lange, Norwa化，CT, 1994,第 71 页和第 6 章。
[0075] 来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作 K和A的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域（Ch)氨基酸序列，免疫球蛋白可 归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白；IgA、I曲、I班、IgG和IgM,分别具有称作a、 5、Y、e和y的重链。根据Ch序列和功能的相对较小差异，Y和a类可进一步分为亚 类，例如人表达下列亚类；IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。
[0076] 术语"可变的"指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。V结 构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于 可变结构域跨越的110个氨基酸。而V区由15-30个氨基酸，称作构架区（FR)的相对不 变异的区段及将构架区分开的称作"高变区"或HVR的极度变异的较短区域组成。天然重 链和轻链的可变结构域各自包含四个FRs，它们大多采取目-折叠构象，通过形成环状连接 且在有些情况中形成目-折叠结构一部分的H个高变区连接。每条链中的高变区通过FR 非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成（参 见 Rabat 等，Sequences of Proteins of Tmmunol ogical Interest (资'疫学感兴疎的蛋 白质的序列）.第五版.Public Health Service (公共卫生署），^tional Institutes of Health(国立卫生研究所），Bethesda, MD. (1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的 结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)中抗体的参 与。
[0077] 术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可 变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR;H个在VH中（HVR-H1、 HVR-肥、HVR-册），H个在化中（HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)。在天然抗体中，册和L3展示该 六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体W精细特异性中发挥独特作用。参 见例如Xu等，免疫性（Immunity) 13:37-45(2000) Johnson和Wu于；分子生物学中的方 法（Methods in Molecular Biology) 248:1-25 化〇,编辑，Human 出版社，Totowa，NJ, 2003)。 事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼科动物（camelid)抗体在缺乏轻链时是有功能的且 稳定的。参见例如 Hamers-化sterman 等，自然（化1:脚6)363:446-448(1993) ;Sheriff 等， 自然结构生物学（化化 re Shuct. Biol.) 3:733-736 (1996)。
[007引 HVRs -般包含来自高变环和/或"互补决定区"仰Rs)的氨基酸残基，后者具有 最高的序列变异性和/或参与抗原识别。本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。K油at互 补性决定区（CDR)是W序列变异性为基础的，而且是最常用的化abat等，免疫学感兴趣的 蛋白质的序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版.公共卫 生署（Public Health Service),国立卫生研究所（^tional Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991))。Qiothia改为指结构环的位置（Qiothia和Lesk分子生物学杂志 (J.Mol.Biol.) 196:901-917(1987))。AbM HVR 代表 K油at HVR 与 Chothia 结构环之间的折 衷，而且由化化rd Molecular的AbM抗体建模软件使用。"contact"HVR是W对可获得的 复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了该些HVR中每一个的残基。
[0079]
【权利要求】
1. 多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包 含 (a) LSGDWIH(SEQ ID N0:48)的 HVR-H1 ; (b) LGEISAAGGYTD(SEQ ID N0:50)的 HVR-H2;和 (c) ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID N0:53)的 HVR-H3;和 (d) DLATDVA(SEQ ID N0:54)的 HVR-L1 ; (e) SASF(SEQ ID N0:56)的 HVR-L2;和 (f) SEPEPYT(SEQ ID N0:57)的 HVR-L3。
2. 权利要求1的抗体，包含： (a) SEQ ID NO: 28的重链可变结构域； (b) SEQ ID NO:27的轻链可变结构域序列；或 (c) SEQ ID NO:28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO:27的轻链可变结构域序列。
3. 权利要求2的抗体，包含SEQ ID N0:28的重链可变结构域。
4. 权利要求2的抗体，包含SEQ ID N0:27的轻链可变结构域序列。
5. 多特异性抗体，其包含SEQ ID N0:28的重链可变结构域序列和SEQ ID N0:27的轻 链可变结构域序列，其中所述抗体特异性结合EGFR和HER3。
6. 权利要求1或5的抗体，其中所述抗体是全长IgGl抗体。
7. 权利要求6的抗体，其中所述抗体显示ADCC活性。
8. 多特异性抗体，其包含特异性结合EGFR和HER3的抗原结合结构域，其中所述抗体包 含 (a) LSGDWIH(SEQ ID N0:48)的 HVR-H1 ; (b) LGEISAAGGYTD(SEQ ID N0:50)的 HVR-H2;和 (c) ARESRVSFEAAMDY(SEQ ID N0:53)的 HVR-H3;和 (d) NIATDVA(SEQ ID N0:55)的 HVR-L1 ; (e) SASF(SEQ ID N0:56)的 HVR-L2;和 (f) SEPEPYT(SEQ ID N0:57)的 HVR-L3。
9. 权利要求8的抗体，包含： (a) SEQ ID NO: 28的重链可变结构域； (b) SEQ ID NO: 29的轻链可变结构域序列；或 (c) SEQ ID NO :28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO :29的轻链可变结构域序列。
10. 权利要求9的抗体，包含SEQ ID NO: 28的重链可变结构域。
11. 权利要求9的抗体，包含SEQ ID N0:29的轻链可变结构域序列。
12. 多特异性抗体，其包含SEQ ID NO: 28的重链可变结构域序列和SEQ ID NO: 29的轻 链可变结构域序列，其中所述抗体特异性结合EGFR和HER3。
13. 权利要求8或12的抗体，其中所述抗体是全长IgGl抗体。
14. 权利要求13的抗体，其中所述抗体显示ADCC活性。
15. 核酸，其编码权利要求1、5、8或12的抗体。
16. 宿主细胞，其包含权利要求15的核酸。
17. 产生抗体的方法，其包括培养权利要求16的宿主细胞从而产生所述抗体。
18. 免疫缀合物，其包含权利要求1、5、8或12的抗体和细胞毒性剂。
19. 药物制剂，其包含权利要求1、5、8或12的抗体和药用载体。
20. 有效量的权利要求1、5、8或12的抗体在制备用于治疗患有癌症的个体的药物中的 应用，其中所述有效量的所述抗体用于向所述个体施用，其中所述癌症选自由乳腺癌，结肠 直肠癌，胰腺癌，头和颈癌，黑素瘤，卵巢癌，前列腺癌和非小细胞肺癌组成的组。
21. 权利要求20的应用，其中所述癌症包含表达EGFR和HER3的细胞。
22. 有效量的权利要求1、5、8或12的抗体在制备用于抑制个体中EGFR和HER3的生物 学活性的药物中的应用，其中所述有效量的所述抗体用于向所述个体施用以抑制EGFR和 HER3的生物学活性。
【文档编号】A61P35/00GK104447995SQ201410566834
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2010年3月19日 优先权日:2009年3月20日
【发明者】吉曼·福, 加布里埃莱·谢弗, 劳里奇·哈贝, 马克·X·斯利沃克斯基 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司