一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，即通过筛选获得新型的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，并以该结构蛋白VP1作为抗原来制备鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。本发明中鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明利用原核表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了28kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭，免疫后可以使孵化的雏鸭获得免疫保护。
【专利说明】一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品【技术领域】，具体涉及一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫 苗。
【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肝炎是由鸭甲肝病毒（Duck h印atitis A viral，DHAV)和鸭星状病毒 (Duck astrovirus)引起的一种高度致病、传播迅速的病毒性疾病，该疾病主要出现在1-3 周龄的雏鸭上，死亡率高达90%以上。而且鸭甲肝病毒呈世界范围分布，给养鸭业带来极大 的损失。
[0003] 鸭甲肝病毒是小RNA病毒科禽肝病毒属的唯一成员，主要分为3个基因型：A型、B 型和C型，对应于三个血清型DHAV-I、DHAV-2和DHAV-3。其中DHAV-I最早是在1950年从美 国分离得到的，是经典毒株，目前分布于世界各地，也是中国目前流行的主要毒株。DHAV-2 是分离自台湾的新型毒株，主要在台湾地区流行。DHAV-3为最早分离自韩国的新型毒株，现 在在中国大陆也有越来越多的该血清型毒株被分离得到，其与DHAV-I的混和感染往往造 成鸭肝炎疫苗的免疫失败。研究表明这三种血清型之间无交叉保护或者仅有有限的交叉保 护。
[0004] DHAV的VPl基因由714个碱基组成，编码VPl蛋白大小为26. 4kD，含有多个DHAV 抗原表位，是鸭肝炎病毒主要的保护性抗原，可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫 保护，是设计DHAV新型疫苗的首选目标基因。付玉志等（2012)通过将鸭肝炎病毒VPl基因 插入甲病毒复制子PSCAl载体中，获得重组表达质粒pSCAl/VPl，构建I型鸭肝炎病毒VPl 基因的自杀性DNA疫苗，并对其在细胞中的表达和对雏鸭的免疫保护效果进行研究，结果 表明，pSCAl/VPl不仅可以明显诱导雏鸭淋巴细胞增殖，而且可以诱导雏鸭产生较高滴度的 DHAV特异性抗体，并对雏鸭有良好的免疫保护作用。张婧等将已建立的鸭瘟病毒TK基因 缺失转移载体进行改造，在其绿色荧光表达盒内插入I型鸭肝炎病毒VPl基因，构建含有I 型鸭肝炎病毒VPl基因的重组鸭瘟病毒，并初步证实该重组病毒能够在真核细胞中正确表 达VPl基因和绿色荧光蛋白的融合蛋白，为构建鸭瘟和鸭病毒性肝炎二价基因工程疫苗的 研究奠定了基础。
[0005] 但近年来我国DHAV-3导致的鸭病毒性肝炎频繁爆发，且在一些地区与DHAV-I的 共流行，表明已有的疫苗已起不到有效的保护作用。而目前国内已经批准上市的鸭病毒性 肝炎疫苗（鸭病毒性肝炎弱毒株A66株、CH60株）均为DHAV-I株，还未见DHAV-3疫苗株 出现。因此开发DHAV-3的新型疫苗株对养鸭业的健康发展无疑具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，即通过筛选获得新型 的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，并以该结构蛋白VPl作为抗原来制备鸭甲肝病毒基因工程亚 单位疫苗。
[0007] 本发明首先提供一种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ；
[0008] 上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2 ;
[0009] 本发明还提供一种鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗，其中的抗原为上述的鸭 甲肝病毒结构蛋白VP1，其浓度为0. 1-lmg/ml之间；
[0010] 本发明的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下：
[0011] 1)将VPl基因表达载体中，构建成表达重组质粒；
[0012] 2)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VPl的 重组基因工程菌；用该重组基因工程菌表达出鸭甲肝病毒结构蛋白VPl ;
[0013] 3)对重组表达的VPl蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
[0014] 本发明利用pET28a(+)表达性载体构建了能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VPl的大肠 杆菌BL21(DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了 28kD重组目的蛋白。将重组蛋白纯 化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫4月龄麻鸭（产蛋种），免疫后可以使孵化的雏鸭获 得免疫保护。
【具体实施方式】
[0015] 申请人:在获得一个具有自身免疫特性的新的鸭甲肝病毒基因的基础上，通过 pET28a(+)原核表达载体构建出能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VPl的大肠杆菌BL21(DE3)重 组基因工程菌，通过对工程菌的诱导、超声破碎、蛋白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产 方法制备出了鸭甲肝病毒基因工程重组亚单位疫苗。
[0016] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0017] 实施例1DHAV-3的VPl基因的筛选
[0018] 1、2012年5月青岛某养鸭场爆发了鸭病毒性肝炎，导致鸭场很多鸭子死亡。但爆 发鸭病毒性肝炎的鸭群已经注射过市售的鸭病毒性肝炎疫苗，因此推测致病的病原发生了 遗传上的变异，因此，选用上述的发病鸭作为样品进行致病基因的分离。
[0019] 首先将发病鸭的肝脏病料用无菌生理盐水研磨，反复冻融3次，加入双抗（青链霉 素，1000U/ml)，尿囊腔接种11-13日龄的SPF鸭胚，0.2ml/枚。照蛋观察，24h内死亡者弃 去。分别取24-96小时死亡高峰期死亡的鸭胚的尿囊液、胚体，-20°C冻存，并观察死亡胚体 及肝脏有无特征性鸭肝炎症状。连传3代，分离获得毒株命名为VF-3。
[0020] 2、取病变明显的毒株VF-3的尿囊液，按Trizol试剂盒的方法提取总RNA，并进行 反转录合成cDNA，以合成的cDNA作为模板进行PCR扩增DHAV-3的VPl基因，引物序列如 下：
[0021] Pl:5' -cgcggatcctccaatcagcttggt-3 '
[0022] P2 :5' -aagctttta ttcaatctccagatg-3'
[0023] 扩增的条件如下：94°C 5min 变性，94°C 30S，65°C 30S，72°C lmin，30 个循环，72DC 延伸lOmin。
[0024] 扩增产物大小约714bp，进行测序后将VPl基因序列在NCBI上Blast比对，结果 发现与DHAV-3FX株（登录号：KF826745)的同源性最高，为95%，推导的蛋白序列同源性最 高为92%，表明毒株VF-3为发生变异的DHAV-3病毒株。其VPl基因翻译的氨基酸序列为 SEQ ID NO : 1。
[0025] 实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得
[0026] 1、上述扩增得到的VPl基因蛋白基因 BamH I和Hind III双酶切后连入pET28a 载体相应的酶切位点，构建pET28a/VPl表达载体。
[0027] 2、用CaCl2法将pET28a/VP 1表达载体转化入大肠杆菌BL21 (DE3)，涂布于含 50 μ g/ml卡那霉素的琼脂平板，37°C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵 培养至〇. 6?0. 8时加入0. 3mMIPTG诱导4?5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同 时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在28kD处多出一条蛋白条带， 与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为35%以上。经DHAV-3抗体免疫印迹检定,显示阳 性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌，命名为YG株。
[0028] 实施例3发酵、纯化与鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备
[0029] 1、发酵工艺
[0030] DLB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 · 7H20的LB培养基 作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L、 MgSO4 · 7H20 5g/L。
[0031] 2)发酵过程
[0032] 挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50 μ g/ml的LB培养基，37°C振 荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2%接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37°C， 200转，溶氧控制在20%以上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0. 3mmol/L IPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。
[0033] 3)镍柱纯化、脱盐
[0034] 4)亲和层析
[0035] 采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脱液洗下 来，纯度达到90%以上
[0036] 5)脱盐
[0037] 收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐后用甲醛灭活 后测蛋白浓度，用PBS液稀释至0. 5mg/ml，0. 22 μ m过滤除菌，即得重组蛋白液。
[0038] 2、鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗的制备
[0039] 将制备的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分搅拌混合作为水相。同时注 射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相 和油相1:3比例混合乳化即可制备鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗。将制备的疫苗按兽用 生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验，检测结果表明疫苗各项指标均合 格。
[0040] 具体操作如下：
[0041] 1菌毒种
[0042] I. 1制造用菌种为鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗生产菌株YG株；检测用的强毒 株为DHAV-3强毒株VF-3。
[0043] I. 2生产用菌种标准
[0044] I. 2. 1形态和生化特性
[0045] 含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、 乳白色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均 为葡萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验+，VP-，枸橼酸利用试验_。
[0046] 1. 2. 2培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。
[0047] 1. 2. 3鉴别检验
[0048] 1. 2. 3. IPCR检测将本菌的LB液体培养物3 μ 1做模板，用以下PCR引物进行PCR 扩增，应能扩增出714bp左右的片段。
[0049] Pl:5' -cgcggatcctccaatcagcttggt-3'
[0050] P2 :5' -aagctttta ttcaatctccagatg-3'
[0051] 扩增的条件如下：94°C 5min 变性，94°C 30S，65°C 30S，72°C lmin，30 个循环，72°C 延伸lOmin。
[0052] I. 2. 3. 2Western_blot检测将LB固体培养平板上的重组菌单菌落接种于5ml含 有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至0D_值在0. 6?I. O之间时加入0. 8mM的IPTG诱 导，持续培养4小时，收集菌体，用PBS重悬后高压匀质破碎，8000r/min离心去沉淀，上清液 与抗鸭甲肝病毒3型阳性血清进行Western-blot试验，应出现特异性条带。
[0053] 1.2. 4纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。
[0054] 1.2. 6基础种子代次F4?FlO代。
[0055] L 2. 7保存冻干菌种，-20°C，保存期为2年。
[0056] 2疫苗制造及半成品检验
[0057] 2. 1生产用种子制备
[0058] 2. I. 1 -级种子繁殖和鉴定将冻干菌种分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基 中，37°C振荡培养8?10小时，然后划线接种于含卡那霉素的LB固体培养基上37°C培养 16?18小时，作为一级种子。在2?8°C保存，不超过14天；在培养基上传代，应不超过2 代。
[0059] 2. 1. 2二级种子繁殖在一级种子中选取符合1. 2. 1项标准的典型菌落10个混合 于少量LB培养液中，接种于含卡那霉素的LB培养液中，37°C培养8?10小时，进行纯粹检 验，应纯粹。置2?8°C保存，应不超过3天。
[0060] 2. 2制苗用培养基为改良LB培养基，每IOOOml培养基中含胰蛋白胨10g，酵母浸 粉 5g，氯化钠 10g，葡萄糖 5g，MgSO4 · 7H20 5g。
[0061] 2. 3制苗用抗原液制备
[0062] 2. 3. 1菌液培养用培养罐通气培养，按培养罐容积装入适量培养基（70 %左右）及 消泡剂，灭菌后按培养基量的2%接种二级种子菌液，37°C通气培养，待菌液的0D_值达到 7.0时，加入8g/L的α-乳糖诱导，再继续培养6?8小时。使用20% NaOH调节pH在7.0， 通过转速关联控制溶氧在20%以上。当溶氧迅速上升时，流加补料。
[0063] 2. 3. 2破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS清洗2次，将收集的菌 体用PBS制成10%的悬液，在4°C下用高压匀浆机破碎细菌。破碎后的菌液，8000r/min，离 心15分钟，收集上清液。
[0064] 2. 3. 3镍柱层析纯化收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透 析脱盐后即得重组蛋白液。
[0065] 2. 3. 4灭活将纯化的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度 为0.2%，37°C灭活12小时，以灭活残存的大肠杆菌。取少量样品进行半成品检验。2? 8°C保存，不超过7天；-15°C以下保存，不超过60天。
[0066] 2. 4半成品检验
[0067] 2. 4. IVPl含量检测用BCA法检测上清液蛋白浓度，稀释至终浓度0. 5mg/ml，无菌 过滤，待用。
[0068] 2. 4. 2无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。
[0069] 2. 4. 3内毒素含量检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于 1000EU/ml者方可用于制苗。
[0070] 2. 5疫苗制备
[0071] 2.5. 1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，力口 热融化至半透明状，再加司本-806份，至温度达到125?130°C时维持30分钟，冷却至室温 备用。
[0072] 2. 5. 2水相制备取灭菌的吐温-804份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐 温-80完全溶解。
[0073] 2. 5. 3乳化取油相3份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相 1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1 %硫柳汞溶液，终浓度达到0. 01 %。 乳化后，取样IOml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相应不超过0. 5ml。
[0074] 2. 5. 4分装定量分装，密封瓶口。
[0075] 3成品检验
[0076] 3. 1物理性状
[0077] 外观为乳白色乳剂。
[0078] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不 扩散。
[0079] 稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底析出的水相 应不超过0. 5ml。
[0080] 黏度按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
[0081] 装量检查按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
[0082] 3. 2无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
[0083] 3. 3安全检验取1日龄雏鸭10只，肌肉或颈部皮下注射疫苗0. 5ml/只，观察14 天，不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。
[0084] 3. 4效力检验下列方法任择其一。
[0085] 3. 4. 1抗体检测将4月龄麻鸭（产蛋种）10只平均分为两组，第一组为免疫组，用 制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫（第一次免疫21天后进行第二次免 疫，每次每只〇. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第 二组为对照组，注射同等体积的无菌生理盐水。免疫组的血清中和抗体效价均应> 1:152， 而对照组中和抗体效价均应< 1:4。
[0086] 3. 4. 2攻毒保护将4月龄麻鸭（产蛋种）10只平均分为二组，每组5只。第一组 为免疫组，用本发明制备的鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫（第一次免疫21 天后进行第二次免疫，每次每只〇. 5ml，皮下注射），第二组为生理盐水对照组，注射同等体 积的无菌生理盐水。第二次免疫后21-28天收集各组鸭所产的鸭蛋进行孵化，分别与雏鸭 出壳后的14天各随机取10只，用DHAV-3强毒株VF-3 (IOOLD5tl)注射攻毒，攻毒14天后统 计攻毒保护率（未死亡的只数占总只数的百分率）。免疫组应至少保护8只，对照组全部死 亡。
[0087] 3. 5甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。
[0088] 实施例4鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价
[0089] 将4月龄麻鸭（产蛋种）10只平均分为两组，第一组为免疫组，用制备的鸭甲肝 病毒基因工程亚单位疫苗进行二次免疫（第一次免疫21天后进行第二次免疫,每次每只 〇. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天后测对DHAV-3的血清中和抗体效价。第二组为对照 组，注射同等体积的无菌生理盐水。结果表明免疫组的血清中和抗体效价均> 1:128,而对 照组中和抗体效价均为阴性。
[0090] 表1 :鸭甲肝病毒基因工程亚单位疫苗免疫后的抗体效价
[0091]
【权利要求】
1. 一种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白的氨基酸 序列为 SEQ ID N0:1。
2. 如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
3. -种鸭甲肝病毒结构蛋白VP1蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
4. 权利要求1所述的鸭甲肝病毒结构蛋白VP1基因在制备疫苗中的应用。
5. -种鸭甲肝病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求3所述的 鸭甲肝病毒结构蛋白VP1蛋白。
6. 如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鸭甲肝病毒结构蛋白VP1蛋白 的浓度为〇? l-lmg/ml。
7. 权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括有如下的步 骤： 1) 将VP1基因连接入表达载体中，构建成表达重组质粒； 2) 将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建能表达鸭甲肝病毒结构蛋白VP1的重组基 因工程菌；用该重组基因工程菌表达出鸭甲肝病毒结构蛋白VP1 ; 3) 对重组表达的VP1蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK104372013SQ201410668062
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】王宏华 申请人:青岛宏昊生物科技有限公司