本发明涉及化学领域，特别是涉及一种落葵萃取物及其用途。
背景技术：
：：皮肤的颜色，主要是由表皮内的黑色素(Melanin)、真皮内的胡萝卜素以及真皮微血管中的血液所造成。黑色素细胞(Melanocytes)位于皮肤基底层内，为单细胞的分泌器官，其细胞呈圆形，黑色素细胞由长而分支的管状突，这些突起在表皮细胞中穿梭。黑色素由黑色素细胞分泌，并向皮肤的表面移动，但黑色素细胞本体并不会跟着移动，而是由角质细胞负责黑色素转移的工作，角质细胞将这些黑色素转至皮肤的表面，以形成天然的保护屏障。黑色素只由黑色素细胞制造，这些细胞散置于表皮的基底细胞之间，黑色素细胞可合成黑色素颗粒，分泌黑色素，使人体呈现不同肤色。黑色素颗粒由黑色素细胞合成后，经由两种主要的途径进行移转，一是向上转移至角质细胞，进入表皮层，最后随着皮肤剥落，另一种为向下转移到真皮内而被黑色素吞噬细胞所吞噬。关于皮肤的斑点等的发生机制上存在部分不明确，一般认为，常晒太阳会促进黑色素细胞内酪胺酸酶活性，而增加黑色素产生，皮肤经由黑色素的合成路径(Raper-Masonpathway)，产生自发性化学反应与酵素催化作用而形成黑色素，黑色素为一种高分子的复合体，当皮肤被紫外线照射时，黑色素细胞内的酪胺酸酶(tyrosinase)会被活化，加速催化细胞内酪胺酸(tyrosine)氧化为二羟基苯基丙胺酸(dihydroxyphenylalanine，DOPA)，而二羟基苯基丙胺酸(DOPA)再由酪胺酸酶催化为多巴醌(dopachrome)，黑色素的生合成路径牵涉到藉由酪胺酸酶的酪胺酸催化羟基化为L-3,4-二羟基苯基丙胺酸 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)及L-DOPA转变为多巴醌(dopachrome)；而多巴醌是经由氧化反应转变为黑色素，透过一系列的氧化反应，由多巴醌形成真黑色素(eumelanin)。酪胺酸酶(tyrosinase)为一种含铜离子的多酚氧化酶，由黑色素细胞合成，其活性会因为来源不同而有所不同，酪胺酸酶与酪胺酸(tyrosine)的活性键结位置有三处铜离子结合活性中心，现今研究有关抑制酪胺酸酶活性的机转上，主要有两种方式：(1)酪胺酸酶的去活化此反应机制主要是因为酵素分子结构上带有铜离子，抑制物藉以利用类似铜螯合剂(copper-chelatingagents)的方式来螯合铜离子或与铜离子相互竞争，藉以减少铜离子的结合力，进而降低酪胺酸酶的活性，以阻断黑色素生成机制，此抑制类型最具代表的成分为曲酸(kojicacid)。(2)竞争性取代酪胺酸酶受质此反应机制为抑制物与酪胺酸或多巴等受质相互竞争和酪胺酸酶进行反应，导致与酪胺酸酶作用的受质减少，而减少黑色素形成，此竞争性取代受质类型最具代表的成分包括对苯二酚(hydroquinone)、熊果素(arbutin)。其中，作为应用于防止皮肤黑化或黑斑、雀斑，并保持原有净白肌肤的美白化妆料，已知有曲酸、熊果素、氢醌单苄醚、过氧化氢等。然而，若调配此等美白剂，虽具有使色黑肌肤淡色化的效果，但作为美白化妆成分时仍无法得到充分满足的效果，再者，其并无抑制因紫外线所造成之发炎的效果，于安全面方面大多亦残存着问题。又，作为抑制因紫外线所造成的发炎的美白剂，已知有维生素C及其衍生物。然而，此等在美白效果的程度、及制剂中的稳定性方面尚无法获得满足。造成皮肤老化的成因除内在自然生理机制外，皮肤长期暴露于紫外线下也是一大主因。不论是自然的生理机制或由紫外线造成的皮肤老化现象，都会促进基质金属蛋白酵素(MMPs)的生成及活化，尤其是MMP1，造成皮肤真皮 层中胶原蛋白、弹力蛋白的流失，导致皮肤网状结构组织的瓦解，形成细纹、皱纹，甚至出现斑块等皮肤老化现象。因此，如何寻找除了上述的美白、抗老化、抗紫外线有效成分以外的天然物萃取成分，就成为了主要追寻的目标。技术实现要素：本发明实施例提供一种落葵萃取物及其用途，用以作为美白、抗老化、抗紫外线有效成分以外的天然物萃取成分。本发明实施例提供的具体技术方案如下：一种落葵萃取物，由下列步骤所制备而得，包括：将落葵直接磨碎至稠状，加入水或醇类加热50℃～150℃、1～6小时；以滤纸过滤，取得滤液以乙醇沉淀1～48小时，滤液比乙醇为1:2；去除上清液后即为落葵水萃取物或落葵醇类萃取物。可选的，将落葵直接磨碎至稠状，加入水或醇类加热50℃～150℃、1～6小时，其中，所述醇类为乙醇、丙三醇、1,3-丁二醇、丙二醇、异丁醇、丙醇、异戊醇、丁醇、己醇、辛醇、十二醇、1-十六醇、苯甲醇、香叶醇、芳樟醇、薄荷醇、3-苯丙醇、1-苯丙醇、橙花醇、紫苏醇。可选的，将落葵直接磨碎至稠状，加入水或醇类加热50℃～150℃、1～6小时，其中，所述加热时间为3小时。可选的，以滤纸过滤，取得滤液以乙醇沉淀1～48小时，滤液比乙醇为1:2，其中，所述乙醇为无水酒精。一种落葵萃取物用于制备美白剂的用途，所述萃取物为所述落葵萃取物。可选的，进一步包括：添加物选自以下所组成的群组：维生素C磷酸镁盐、维生素C醣苷、维生素C磷酸钠盐、曲酸、熊果素、鞣花酸、洋甘菊萃取物、传明酸、甲氧基水杨酸钾盐及乙基维生素C、烟碱酸。一种落葵萃取物用于制备抗紫外线剂、抗老化的用途，所述萃取物为所述落葵萃取物。一种落葵萃取物用于制备抗发炎剂的用途，所述萃取物为所述落葵萃取物。一种医药组合物，包含所述落葵萃取物。一种食品组合物，包含所述落葵萃取物。附图说明图1为本发明实施例中落葵水萃取物、酒精萃取物抑制黑色素生成量；图2为本发明实施例中落葵水萃取物、酒精萃取物抑制酪胺酸酶活性试验；图3为本发明实施例中落葵水萃取物抗UV试验；图4为本发明实施例中本发明实施例中落葵酒精萃取物抗UV试验；图5为本发明实施例中落葵水萃取物、酒精萃取物抑制IL-6表现量；图6为本发明实施例中落葵水萃取物、酒精萃取物抑制TNF-α表现量；图7为本发明实施例中落葵水萃取物、酒精萃取物具有抗老化、抑制MMP1活性的效果与其定量表。具体实施方式本说明书中所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。术语“药学上可接受”意谓物质或组合物必须与调配物的其他成份兼容，且对患者无害。另外，于本发明皮肤外用剂组合物中，除上述落葵萃取物以外，基剂可依需要适宜添加用于一般化妆品及医药品等皮肤外用剂所用的成分，例如保湿剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、界面活性剂、增黏剂、醇类、粉末成分、色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。亦可适宜地添加其他依地酸 二钠、依地酸三钠、柠檬酸钠、聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属阻断剂；咖啡因、丹宁酸、维拉帊米(verapamil)、胺甲环酸及其衍生物、甘草萃取物、甘草素、火棘果实的热水萃取物、各种生药、乙酸生育酚酯、甘草酸及其衍生物或其盐等的药剂；维生素C及其衍生物、熊果素、曲酸等的其他美白剂；葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖类等。本发明的皮肤外用剂组合物包括，例如软膏、乳霜、乳液、药水、面膜(pack)、浴用剂等，只要是用于习知皮肤外用剂组合物者均可而不特别规定其剂型。本发明的落葵萃取物可包含，但不限于：食品、饮品、健康食品、动物用及人类用医疗组合物、食品添加物、饮料添加物等适用本发明的应用形式。上述落葵萃取物中，亦可视需要适宜地添加一或多种以上制剂领域内通常使用的溶解补助剂、缓冲剂、保存剂、着色剂、香料、风味剂等。另一较佳实施例中，本发明所提供的前述落葵萃取物，可进一步添加一可食性材料，以制备为一种食品产品或保健产品。其中该可食性材料包含，但不限于：水(water)、流体乳品(fluidmilkproducts)、牛奶(milk)、浓缩牛奶(concentratedmilk)；发酵乳品(fermentedmilk)，诸如酸奶(yogurt)、酸乳(sourmilk)、冷冻优格(frozenyogurt)、乳杆菌发酵饮料(lacticacidbacteria-fermentedbeverages)；奶粉(milkpowder)；冰淇淋(icecream)；奶酪(creamcheeses)；干酪(drycheeses)；豆奶(soybeanmilk)；发酵豆奶(fermentedsoybeanmilk)；蔬果汁(vegetable-fruitjuices)；果汁(juices)；运动饮料(sportsdrinks)；甜点(confectionery)；果冻(jellys)；糖果(candies)；婴儿食品(infantformulas)；健康食品(healthfoods)；动物饲料(animalfeeds)；中草药材(Chineseherbals)；膳食补充品(dietarysupplements)等。本发明所提供的落葵萃取物及其用于美白或抗紫外线的方法，其给予路径，可视需求适宜调整，并未特别限定，可经由皮肤外用、或经口投予适用剂型。本发明的另一实施例，落葵萃取物可另外添加添加物选自以下所组成的群组：维生素C磷酸镁盐(MagnesiumAscorbylPhosphate)、维生素C醣苷(AscorbylGlucoside)、维生素C磷酸钠盐(SodiumAscorbylPhosphate)、曲酸(KojicAcid)、熊果素(Arbutin)、鞣花酸(EllagicAcid)、洋甘菊萃取物(ChamomileET)、传明酸(Tranexamicacid)、甲氧基水杨酸钾盐(PotassiumMethoxysalicylate)、3-氧乙基维生素C(3-O-EthylAscorbicAcid)、烟碱酸(Niacinamide)。本发明的落葵水萃取物、落葵酒精萃取物就该领域具有通常知识者，皆了解其萃取物含量可能包含多种有机物。实施例中所萃取出的物质皆属本发明所欲保护的物质。本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所用的药物、生物材料皆市售易于取得，下列仅为示例可取得的管道。实施例一本发明所使用的原料为落葵(BasellaalbaL.)，别名为皇宫菜、木耳菜、潺菜、豆腐菜(云南)等。落葵水萃取物样品的制备：1.利用果汁机以不添加水方式将落葵磨碎至稠状，磨碎后落葵样品装在50ml离心管。2.取磨碎的落葵样品300克于烧杯中，加入二次水500ml，于水浴锅中90℃隔水加热3小时。3.放置室温冷却后，以125mm滤纸过滤，取得的滤液用99.5％无水酒精以1:2比例沉淀一天。4.离心15～20分钟8000rpm，去除上清液，取得胚类-80℃存放一天后，进行冷冻干燥取得粉末落葵样品。5.用二次水1mL溶解粉末落葵样品0.01克测量吸光值。落葵酒精萃取物样品的制备：1.利用果汁机以不添加水方式将落葵磨碎，磨碎后落葵样品装在50ml离心管，于-80℃冷冻保存。2.取磨碎之落葵样品300克于烧杯中，加入80％酒精500ml，于水浴锅中90℃隔水加热3小时。3.放置室温冷却后，以125mm滤纸过滤，取得滤液用99.5％无水酒精以1:2比例沉淀一天。4.离心15～20分钟8000rpm，去除上清液，取得胚类-80℃存放一天后，进行冷冻干燥取得粉末落葵样品。实施例二实验方法细胞培养小鼠黑色素瘤细胞株/B16-F0，取自于财团法人生物资源保存及研究中心(BCRC)/60029，作为测定黑色素含量的细胞。黑色素(melanin)含量测定：实验结果本实验以市售乙基维生素C作为实验的正对照组(positivecontrol)，结果显示低剂量(10μg/ml)落葵水萃取物及50μg/ml落葵酒精萃取物具良好抑制黑色素细胞生成的能力，且其效果优于1％的市售乙基维生素C(图1)。另外实验结果显示落葵水萃取物与维生素C具有美白协同作用(synergisticeffect)。实施例三实验方法细胞培养小鼠黑色素瘤细胞株/B16-F0，取自于财团法人生物资源保存及研究中心(BCRC)/60029，作为测定酪胺酸酶抑制率的细胞。酪胺酸酶(tyrosinase)抑制率测定：(1)配置磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(1/15MpH6.8)。(2)配置酪胺酸酶溶液。(3)配置0.03％L-DOPA。(4)将待测样品50μL和酪胺酸酶50μL均匀混合在96孔盘中并放置15分钟。(5)加入0.03％L-DOPA50μL并放置15分钟。(6)测OD475nm。实验组别分别为(1)1％维生素C、(2)0.25％维生素C、(3)10μg/ml落葵水萃取物(H10)、(4)0.25％维生素C+10μg/ml落葵水萃取物(0.25VitC+H10)、(5)50μg/ml落葵水萃取物(H50)、(6)0.25％维生素C+50μg/ml落葵水萃取物(0.25VitC+H50)、(7)10μg/ml落葵酒精萃取物(E10)、(8)0.25％维生素C+10μg/ml落葵酒精萃取物(0.25VitC+E10)、(9)50μg/ml落葵酒精萃取物(E50)、(10)0.25％维生素C+50μg/ml落葵酒精萃取物(0.25VitC+E50)。实验结果黑色素的生成路径是经由酪胺酸酶的催化，本实验进一步证实落葵翠取物抑制黑色素生成功效是藉由抑制酪胺酸酶的活性，实验证实10μg/ml落葵水萃取物抑制酪胺酸酶活性的能力就优于1％的维生素C衍生物，且随着剂量增加抑制效果增加，再者，落葵水萃取物与维生素C衍生物有抑制酪胺酸酶活性协同作用；落葵酒精萃取物于低剂量10μg/ml的抑制能力亦优于1％的维生素C衍生物，于较高剂量50μg/ml的抑制率反而降低，但与维生素C衍生物抑制酪胺酸酶活性的协同作用，会随着剂量增加而的提高(图2)。实施例四实验方法细胞培养人类纤维母细胞株WI38(ATCC：CCL-75)作为测定UV生物活 性分析的细胞。抗UV生物活性分析：将细胞经UV300mJ/cm2照射3、6、9、12、24小时，控制组不照射UV紫外光。再以细胞存活率分析(MTTAssay)方法评估细胞的存活比例。以细胞存活率分析：(1)将细胞培养于96孔盘(5000细胞/100μl/well)放置隔天。(2)再依照实验需求给予落葵水/酒精萃取物不同剂量(5-50μg/ml)处理。(3)不同实验组别6-12小时后，移除培养液，加入100μl含500μg/mlMTT培养液，于37℃下作用1小时。(4)除去MTT的培养液吸除，加入100μlDMSO将结晶溶解，使用ELISAreader读取570nm的吸光值。注：以对照组(不添加萃取物处理)的吸光值当做100％，由3次独立实验来计算细胞在经过萃取物处理后的存活率。实验结果本实验以300mJ/cm2UV光照作为实验的UV伤害处理，找寻合适作为伤害处理的时间点，结果显示人类纤维母细胞株WI38细胞株在UV照射3-9小时都会有生长抑制的情形，但9小时过后(如12小时，24小时与12小时结果类似)细胞生长抑制的情况消失。以300mJ/cm2UV光照6小时来作为评估WI38细胞株的抗紫外线能力，实验结果显示，添加落葵水萃取物无保护细胞抗紫外线能力(图3)；落葵酒精萃取物有显著保护细胞抗紫外线功效(图4)。实施例五实验方法细胞培养人类纤维母细胞株WI38(ATCC：CCL-75)作为测定细胞发炎激素IL-6分析的细胞。细胞发炎激素IL-6测试：(1)在96孔盘中分别加入100μl在4℃放置约16～18小时。(2)利用Washbuffer清洗三次，每次300μl并拍干。(3)每孔加入200μl1Xassaybuffer放置一小时。(4)利用Washbuffer清洗三次，每次300μl并拍干。(5)准备标准曲线和样品，并每孔加入100μl，放置两小时。(6)利用Washbuffer清洗三次，每次300μl并拍干。(7)每孔加入100μl二抗，放置一小时。(8)利用Washbuffer清洗三次，每次300μl并拍干。(9)每孔加入100μlHRP放置30分钟。(10)利用Washbuffer清洗四次，每次300μl并拍干。(11)每孔加入100μlTMB混合物，避光放置15分钟。(12)每孔加入100μl终止液(2NH2SO4)放置30分钟。(13)测OD450。实验结果细胞发炎激素的增加是造成皮肤过敏的原因之一，其表现量增加的因素除内在环境外，外在环境如紫外线的照射也深具影响。本实验观察在无紫外线及有紫外线的照射下，落葵萃取物抑制细胞发炎激素IL-6表现量的能力。实验结果证实10μg/ml落葵水萃取物在无紫外线照射下能降低细胞发炎激素IL-6的表现量60％以上；在紫外线照射下能降低细胞发炎激素IL-6的表现量30％以上。而5μg/ml落葵酒精萃取物在无紫外线照射下就能降低细胞发炎激素IL-6的表现量70％以上；在紫外线照射下亦能降低细胞发炎激素IL-6的表现量40％以上(图5)。由实验结果得知落葵水及酒精萃取物抑制细胞发炎激素IL-6的能力极佳。实施例六实验方法细胞培养人类纤维母细胞株WI38(ATCC：CCL-75)作为测定细胞发炎 激素TNF-α分析的细胞。细胞发炎激素TNF-α测试：实验方法同实施例四，仅更换为辨认TNF-α之抗体。实验结果细胞发炎激素的增加是造成皮肤过敏的原因之一，其表现量增加的因素除内在环境外，外在环境如紫外线的照射也深具影响。本实验观察在无紫外线及有紫外线的照射下，落葵萃取物抑制细胞发炎激素TNF-α表现量的能力。实验结果证实5μg/ml蒸馏水落葵萃取物在无紫外线照射下能降低细胞发炎激素TNF-α的表现量达70％以上；在紫外线照射下能降低细胞发炎激素TNF-α的表现量30％以上。而10μg/ml酒精落葵萃取物在无紫外线照射下就能降低细胞发炎激素TNF-α的表现量50％以上；但在紫外线照射下无降低细胞发炎激素TNF-α的表现能力(图6)。由实验结果得知蒸馏水及酒精落葵萃取物在无紫外线照射下皆有显著抑制细胞发炎激素TNF-α的能力。实施例七为了解落葵萃取物于皮肤细胞抗老化的效能，拟定观察水萃及酒精萃落葵萃取物对皮肤纤维母细胞是否对MMP1具抑制能力。实验方法抑制MMP1活性测验1.进行细胞培养(纤维母细胞株Balb/3T3)，以10公分培养盘继代后，隔天加入测试浓度，此为Control、水萃取洛葵5、10、50μg/ml，酒精萃取洛葵5、10、50μg/ml。2.24小时后将细胞全数收起，加入lysisbuffer约10μl混匀，冰上静置30分钟，以13000rpm/5min./4℃离心，取其上清液。3.以西方墨渍法(westernblotting)测定其MMP1含量。对于抑制MMP1活性的实验结果(图7)显示，不论是水萃或酒精萃落葵萃取物皆对抑制MMP1的活性有良好的效力，且水萃落葵萃取物于10μg/ml 具极佳的抑制MMP1活性能力。落葵萃取物藉由抑制瓦解皮肤网状结构组织的金属蛋白酵素活性(MMP1)，来达到皮肤抗老化功能，因此，结论落葵萃取物是具有潜力之皮肤抗老化活性成份。上述多项功效，实属充分符合新颖性及进步性之法定发明专利要件，爰依法提出申请，恳请贵局核准本件发明专利申请案，以励发明。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3