纤维化疾病的治疗的制作方法

本申请要求2014年9月16日提交的美国临时申请第62/051,026号的优先权权益，本文通过援引并入其整体内容。

技术领域

本发明的领域大致涉及RSPO和LGR拮抗剂，包括但不限于结合RSPO(特别是人RSPO1、RSPO2及RSPO3)的抗体和其它试剂，以及使用所述RSPO和/或LGR拮抗剂以治疗纤维化疾病的方法。

背景技术：

据估计在发达国家中，纤维化(fibrosis)直接或间接造成将近45％的死亡。纤维化疾病(fibrotic disease)的特征在于细胞外基质成分的过度累积，该过度累积扰乱生理组织结构，导致受影响器官的功能失调。在一些情况中，纤维化被认为是慢性组织刺激或慢性发炎的结果。在一些情况中，纤维化被认为是体内自体免疫反应的结果。在纤维化疾病诸如硬皮症、肺纤维化及肝硬化中，观察到实质组织逐渐被细胞外基质成分取代。然而，维持纤维化级联的细胞因素及分子因素仍不明。

Wnt信号传导与数种人纤维化疾病有关。在一些类型的纤维化疾病中，经活化的Wnt信号传导可通过β-连环蛋白的累积、Wnt途径配体诸如Wnt1及Wnt10B的上调、及Wnt途径负调节子诸如Dkk1的下调加以识别(Akhmetshina等，2012,Nature Communications,3：735；Guo等，2012,Physiol.Res.,61：337-346)。Wnt信号传导途径是胚胎模式形成、后胚胎组织维持及干细胞生物学的重要调节因子之一。不受调节的Wnt途径活化与多种人类疾病有关，其中致病机制通过篡夺控制正常发育和/或组织修复的稳态机制进行。

据显示，Wnt配体及R-脊椎蛋白(RSPO)协同作用以活化典型Wnt途径。已知RSPO蛋白活化与Wnt信号传导类似的β-连环蛋白信号传导，然而RSPO蛋白与Wnt信号传导之间的关系仍在研究当中。据报告RSPO蛋白对Wnt配体具有正调节活性(Nam等，2006,JBC 281：13247-57)。此研究亦指出RSPO蛋白可充当Frizzled8及LRP6受体配体并诱导β-连环蛋白信号传导(Nam等，2006,JBC 281：13247-57)。最近研究已鉴定出RSPO蛋白与LGR(含有富亮氨酸重复的G蛋白偶合受体)蛋白如LGR5之间的相互作用(美国专利公开号2009/0074782及2009/0191205)，这些数据呈现活化β-连环蛋白信号传导的替代途径。

R-脊椎蛋白(RSPO)家族的蛋白在脊椎动物之间具保守性，包含四个成员RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4。这些蛋白有许多不同的名称，包括顶板特异性脊椎蛋白(roof plate-specific spondin)、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin 1-4及Futrin1-4。RSPO为小型分泌蛋白，所有RSPO共享大约40％至60％的序列同源性及结构域组织形式。所有RSPO蛋白包含在N端的两个furin样的富半胱氨酸结构域以及其后的血小板反应素结构域及碱性带电C端尾部(Kim等，2006,Cell Cycle,5：23-26)。

研究显示，RSPO蛋白在脊椎动物发育期间(Kamata等，2004,Biochim.Biophys Acta,1676：51-62)与爪蟾(Xenopus)的肌肉发育(Kazanskaya等，2004,Dev.Cell,7：525-534)方面具有功能。研究也显示RSPO1为胃肠上皮细胞的强效丝裂原(Kim等，2005,Science,309：1256-1259)。报告指出RSPO3主要表达于爪蟾及小鼠的内皮细胞及其细胞内前体之中或附近。另外，研究指出RSPO3可能在胚胎发生时充当血管生成因子(Kazanskaya等，2008,Development,135：3655-3664)。

经诊断罹患纤维化疾病的患者的药物治疗选择非常有限。需要针对纤维化以及纤维化中涉及的信号传导途径的新颖药剂。因此，扰乱纤维化中涉及的信号传导途径的生物分子诸如RSPO结合剂是新型治疗剂的潜在来源。

技术实现要素：

本发明提供了治疗或预防受试者中的纤维化疾病的方法，其中该方法包括对受试者施用治疗有效量的RSPO和/或LGR拮抗剂，例如，抗RSPO抗体、抗LGR抗体或可溶性LGR受体。

在一些实施方式中，RSPO和LGR拮抗剂包括但不限于与至少一种RSPO或LGR蛋白结合的抗体和其它多肽、结合至少一种RSPO或LGR蛋白的小分子以及可溶性LGR蛋白。RSPO蛋白(例如，人蛋白)可以为RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4之一。LGR蛋白可以为LGR4、LGR5或LGR6。

在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是RSPO结合剂。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是LGR结合剂。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是抗体。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是抗RSPO抗体。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是抗LGR抗体。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是可溶性受体。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是LGR-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是LGR5-Fc可溶性受体。

在一些实施方式中，RSPO或LGR拮抗剂是与至少一种RSPO蛋白或其一部分特异性结合的抗体。在一些实施方式中，与至少一种人RSPO蛋白特异性结合的抗体选自由以下组成的组：RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。

本发明提供了治疗或预防受试者中的纤维化疾病的方法，其中该方法包括对受试者施用治疗有效量的RSPO结合剂，包括本文所述的那些中的任一种。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人RSPO蛋白的抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人RSPO1的抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人RSPO2的抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人RSPO3的抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人RSPO4的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人RSPO1的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人RSPO2的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人RSPO3的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的与人RSPO1特异性结合的抗体以及治疗有效量的特异性结合人RSPO1的抗体和治疗有效量的特异性结合人RSPO2特异性结合的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人RSPO1的抗体以及治疗有效量的特异性结合人RSPO3的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人RSPO2的抗体以及治疗有效量的特异性结合人RSPO3的抗体。

在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是特异性结合人RSPO蛋白的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是特异性结合人RSPO1的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是特异性结合人RSPO2的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是特异性结合人RSPO3的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是包含LGR4、LGR5或LGR6的胞外结构域或其片段的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是包含LGR5的胞外结构域或其片段的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是包含LGR5的22-564位氨基酸的可溶性受体。在一些实施方式中，所述RSPO结合剂是包含LGR5的22-564位氨基酸的片段的可溶性受体。在一些实施方式中，所述可溶性受体包括非LGR多肽。在一些实施方式中，所述非LGR多肽与LGR蛋白的胞外结构域直接相连。在一些实施方式中，所述非LGR多肽与LGR蛋白的胞外结构域通过连接子相连。在一些实施方式中，所述非LGR多肽是人Fc区。在一些实施方式中，所述非LGR多肽是选自由SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80组成的组的人Fc区。

本发明还提供了治疗或预防受试者中的纤维化疾病的方法，其中该方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR结合剂，包括本文所述的那些中的任一种。在一些实施方式中，该LGR结合剂是特异性结合人LGR蛋白的抗体。在一些实施方式中，该LGR结合剂是特异性结合人LGR4的抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人LGR5的抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是特异性结合人LGR6的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人LGR4的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人LGR5的抗体。在一些实施方式中，治疗或预防受试者的纤维化疾病的方法包括对该受试者施用治疗有效量的特异性结合人LGR6的抗体。

在所述方法的一些实施方式中，纤维化疾病是选自由以下组成的组：肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、心纤维化及粘连(adhesion)形成。在一些实施方式中，该纤维化疾病是皮肤纤维化。在一些实施方式中，该皮肤纤维化包括但不限于硬皮症、全身性硬化症、硬皮症样疾病、无皮肤硬化的硬皮症(sine scleroderma)、瘢痕疙瘩形成及肥厚性瘢痕形成。在一些实施方式中，该纤维化疾病是肾纤维化。在一些实施方式中，该肾纤维化包括但不限于慢性肾疾病。在一些实施方式中，该纤维化疾病是肺纤维化。在一些实施方式中，该肺纤维化包括但不限于特发性肺纤维化、间质肺纤维化、肺部纤维化、纵膈纤维化及胸膜纤维化。在一些实施方式中，该肺纤维化是原发性肺纤维化。在一些实施方式中，该肺纤维化是继发性肺纤维化。在一些实施方式中，该纤维化疾病是肝纤维化。在一些实施方式中，该肝纤维化包括但不限于肝硬化。在一些实施方式中，该纤维化疾病是心纤维化。在一些实施方式中，该心脏纤维化包括但不限于心肌纤维化、心瓣膜纤维化、心内膜心肌纤维化及动脉粥样硬化。在一些实施方式中，该纤维化疾病不是肺纤维化。在一些实施方式中，该纤维化疾病不是肝纤维化。在一些实施方式中，该心纤维化不是动脉粥样硬化。

在一些实施方式中，该方法包括施用至少一种额外治疗剂。在一些实施方式中，该额外治疗剂是第二抗体。在一些实施方式中，该额外治疗剂是抗炎剂。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂(例如抗体)包含抗体89M5的一、二、三、四、五和/或六个CDR(参见本文表1)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：(a)重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含TGYTMH(SEQ ID NO:5)，该重链CDR2包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:6)且该重链CDR3包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:7)；以及(b)轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)，该轻链CDR2包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)且该轻链CDR3包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:56具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:57具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:11的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:56的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:57的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:14的重链和/或包含SEQ ID NO:16的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:14的重链和包含SEQ ID NO:16的轻链。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是h89M5-H8L5。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59具有至少90％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:59的重链和/或包含SEQ ID NO:61的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:59的重链和包含SEQ ID NO:61的轻链。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是h89M5-H2L2。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂(例如抗体)包含抗体130M23的一、二、三、四、五和/或六个CDR(参见本文表1)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：(a)重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含SSYAMS(SEQ ID NO:21)，该重链CDR2包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)且该重链CDR3包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:23)；以及(b)轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)，该轻链CDR2包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)且该轻链CDR3包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含与SEQ ID NO:27具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:66的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少95％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链和/或包含SEQ ID NO:32的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链和包含SEQ ID NO:32的轻链。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是h130M23-H1L6。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少95％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链和/或包含SEQ ID NO:68的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链和包含SEQ ID NO:68的轻链。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是h130M23-H1L2。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO3结合剂(例如抗体)包含抗体131R011的一、二、三、四、五和/或六个CDR(参见本文表1)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO3结合剂包含：(a)重链CDR1、重链CDR2及重链CDR3，该重链CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO:37)，该重链CDR2包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:38)且该重链CDR3包含TYFANNFD(SEQ ID NO:39)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO:40)；以及(b)轻链CDR1、轻链CDR2及轻链CDR3，该轻链CDR1包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)，该轻链CDR2包含AASNLES(SEQ ID NO:42)或AAS(SEQ ID NO:43)且该轻链CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:45)。

在某些实施方式中，本发明提供与RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:46具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含与SEQ ID NO:47具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含SEQ ID NO:46的重链可变区，和/或包含SEQ ID NO:47的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供与RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含：与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49具有至少90％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含SEQ ID NO:49的重链和/或包含SEQ ID NO:51的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含SEQ ID NO:49的重链和包含SEQ ID NO:51的轻链。在一些实施方式中，抗RSPO3抗体是131R010。

在一些实施方式中，该RSPO结合剂是单克隆抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是重组抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是嵌合抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是人源化抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是人抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是IgG1抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是IgG2抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是双特异性抗体。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是单价抗体。

在本文所述的方法的一些实施方式中，一种方法包括与本发明的抗RSPO1抗体竞争与人RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂与下述抗体竞争与人RSPO1的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:11的重链可变区和包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在一些实施方式中，RSPO1结合剂与下述抗体竞争与人RSPO1的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:56的重链可变区和包含SEQ ID NO:57的轻链可变区。在一些实施方式中，与RSPO1结合剂竞争的抗体是包含抗体89M5的CDR的抗体。在一些实施方式中，所述RSPO1结合剂与本发明的抗RSPO1抗体在体外竞争性结合测定中竞争与RSPO1的特异性结合。

在某些实施方式中，所述RSPO1结合剂是与本发明的抗RSPO1抗体(例如89M5、h89M5-H8L5、或h89M5-H2L2)结合位于RSPO1上的相同表位或基本相同的表位的抗体。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂是与RSPO1上的表位结合的抗体，该抗体所结合的RSPO1上的表位与本发明的抗RSPO1抗体(例如89M5、h89M5-H8L5、或h89M5-H2L2)所结合的RSPO1上的表位重叠。

在本文所述的方法的一些实施方式中，一种方法包括与本发明的抗RSPO2抗体竞争与人RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂与下述抗体竞争与人RSPO2的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区和包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂与下述抗体竞争与人RSPO2的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区和包含SEQ ID NO:66的轻链可变区。在一些实施方式中，与该RSPO2结合剂竞争的抗体是包含抗体130M23的CDR的抗体。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂与本发明的抗RSPO2抗体在体外竞争性结合测定中竞争与RSPO2的特异性结合。

在某些实施方式中，所述RSPO2结合剂是与本发明的抗RSPO2抗体(例如130M23、h130M23-H1L6、或h130M23-H1L2)结合位于RSPO2上的相同表位或基本相同的表位的抗体。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂是与RSPO2上的表位结合的抗体，该抗体所结合的RSPO2上的表位与本发明的抗RSPO2抗体(例如130M23、h130M23-H1L6、h130M23-H1L2)所结合的RSPO2上表位重叠。

在本文所述的方法的一些实施方式中，一种方法包括与本发明的抗RSPO3抗体竞争与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂与下述抗体竞争与人RSPO3的特异性结合，该抗体包含：包含SEQ ID NO:46的重链可变区和包含SEQ ID NO:47的轻链可变区。在一些实施方式中，与该RSPO3结合剂竞争的所述抗体是包含抗体131R010的CDR的抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂与本发明的抗RSPO3抗体在体外竞争性结合测定中竞争与RSPO3的特异性结合。

在某些实施方式中，所述RSPO3结合剂是与本发明的抗RSPO3抗体(例如131R010)结合位于RSPO3上的相同表位或基本相同表位的抗体。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂是与RSPO3上的表位结合的抗体，该抗体所结合的RSPO3上的表位与本发明的抗RSPO3抗体(例如131R010)所结合的RSPO3表位重叠。

在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该RSPO结合剂或抗体是分离的。在一些实施方式中，该RSPO结合剂或抗体是基本纯的。

在一些实施方式中，所述RSPO或LGR拮抗剂是与至少一种人LGR蛋白或其一部分特异性结合的抗体。在一些实施方式中，所述抗体特异性结合选自由LGR4、LGR5和LGR6组成的组的至少一种人LGR蛋白的。在一些实施方式中，所述抗体与人LGR5特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体包含：(a)由ATCC保藏号为PTA-9342的88M1杂交瘤所产生的单克隆抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和(b)由ATCC保藏号为PTA-9342的88M1杂交瘤所产生的单克隆抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方式中，所述抗体包含由ATCC保藏号为PTA-9342的88M1杂交瘤所产生的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。

在一些实施方式中，所述RSPO或LGR拮抗剂是包括人LGR蛋白(例如，LGR5)的胞外结构域或其片段的可溶性受体，其中所述胞外结构域能与人RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，人LGR蛋白的所述胞外结构域包括人LGR5的22-564位氨基酸(SEQ ID NO:74)。在一些实施方式中，可溶性受体包括非LGR多肽。在一些实施方式中，所述非LGR多肽与所述人LGR蛋白的胞外结构域直接相连，或者通过连接子与所述人LGR蛋白的胞外结构域相连。在一些实施方式中，所述非LGR多肽包含人FC区(例如，包括SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80，或者与SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列)。

在某些实施方式中，本发明提供一种抑制细胞中Wnt信号传导的方法，该方法包括使该细胞与有效量的RSPO结合剂或LGR结合剂(包括本文所述的那些的每一种)接触。在一些实施方式中，该细胞表达升高水平的至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，该细胞表达升高水平的RSPO1。在一些实施方式中，该细胞表达升高水平的RSPO2。在一些实施方式中，该细胞表达升高水平的RSPO3。在一些实施方式中，该细胞表达高水平的至少一种RSPO蛋白。在一些实施方式中，该细胞表达高水平的RSPO1。在一些实施方式中，该细胞表达高水平的RSPO2。在一些实施方式中，该细胞表达高水平的RSPO3。在某些实施方式中，所述RSPO结合剂抑制纤维化组织的形成。在某些实施方式中，所述LGR结合剂抑制纤维化组织的形成。

在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该方法还包含确定至少一种RSPO蛋白在细胞中的表达水平的步骤。在一些实施方式中，该细胞是来自纤维化组织。

在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该方法包括对该受试者施用RSPO结合剂及至少一种额外治疗剂。在本文所述的任何方法的某些实施方式中，该方法包括对该受试者施用LGR结合剂及至少一种额外治疗剂。

提供了包含本文所述的RSPO结合剂(例如，抗体或可溶性受体)或LGR结合剂的组合物。提供了包含本文所述的RSPO结合剂(例如，抗体或可溶性受体)或LGR结合剂及药学可接受载剂的药物组合物。还提供了治疗受试者(例如人)中的纤维化疾病的方法，该方法包括对该受试者施用有效量的包含RSPO结合剂或LGR结合剂的药物组合物。还提供了RSPO结合剂和/或LGR结合剂用于治疗纤维化疾病的用途。

虽然本发明的各方面或实施方式以马库什群组或其他替代性分组方式进行描述，但本发明不仅包含以整体列出的整个群组，而且还包含该群组的每个成员以及主要群组中所有可能的亚群，并且还包含缺失了一个或多个群组成员的主要群组。本发明亦设想明确排除所要求的发明中的任何群组成员的一个或多个。

附图说明

图1：在博来霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化模型中的RSPO表达。

图2：在博来霉素诱导的皮肤纤维化模型中的RSPO表达。

图3：由RSPO抗体抑制博来霉素诱导的皮肤损伤。

图4：在来自博来霉素诱导的皮肤损伤的组织中的基因表达。组织样品取自第12天。

图5：来自博来霉素诱导的皮肤损伤的干扰素γ的基因表达。组织样品在施用单剂量的博来霉素及单剂量的抗RSPO抗体后24小时取得。

具体实施方式

本发明提供来自治疗纤维化疾病及用于减少因伤口愈合所导致的瘢痕形成的新颖方法。本发明提供了治疗或预防受试者中的纤维化疾病的方法，其包括对该受试者施用治疗有效量的人RSPO或LGR拮抗剂。所述方法包括对有需要的受试者施用RSPO结合剂和/或LGR结合剂，特别是抗RSPO1抗体、抗RSPO2抗体、抗RSPO3抗体、抗LGR5抗体或LGR5-Fc可溶性受体。所述RSPO结合剂和LGR结合剂包括但不限于RSPO和LGR蛋白相互作用的抑制剂。

I.定义

为了促进对本发明的理解，以下定义一些术语及短语。

本文所使用的术语“纤维化疾病(fibrotic diseases)”包括但不限于结缔组织疾病。本领域技术人员通常认为纤维化(fibrosis)是过多纤维化结缔组织在器官或组织中的形成或发展。在一些实施方式中，纤维化作为修复性(reparative)或反应性(reactive)过程发生。在一些实施方式中，纤维化响应于损伤或伤害而发生。术语“纤维化”应被理解为过多纤维化结缔组织在器官或组织中作为修复性或反应性过程的形成或发展，并非纤维组织作为器官或组织的正常组成部分的形成。

本文所使用的术语“拮抗剂”及“拮抗性”，是指部分或完全阻断、抑制、减少、或中和靶标和/或信号传导途径的生物活性的任何分子。本文所使用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制、减少或中和蛋白(例如RSPO蛋白或LGR蛋白)的活性的任何分子。适当的拮抗剂分子特别包括但不限于拮抗抗体或抗体片段。

本文所使用的术语“调节”是指生物活性的改变或变化。调节包括但不限于刺激或抑制活性。调节可为增加或减少活性、改变结合特性，或任何其他与蛋白、途径、或其他生物性关注点的活性相关的生物性、功能性或免疫性特性的改变。

本文所使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原结合位点，识别靶标(例如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)并与其特异性结合。如本文所使用，该术语包含完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体诸如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，及任何其他包含抗原识别位点(即抗原结合位点)的经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体展现所需的生物活性即可。抗体可为下列五种主要免疫球蛋白类型中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，基于其重链恒定结构域的属性而分别称为α、δ、ε、γ、及μ。不同类型的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构及三维构象。抗体可为裸(naked)抗体或与包括但不限于毒素及放射性同位素的其他分子缀合。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分且是指完整抗体的抗原性决定可变区。抗原片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、线性抗体、单链抗体及由抗体片段形成的多特异性抗体。本文所使用的“抗体片段”包含抗原结合位点或表位结合位点。

抗体的“可变区”这一术语是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区(不论单独或组合)。各重链及轻链的可变区是由四个框架区(FR)及连接这四个框架区的三个互补决定区(CDR)组成，所述三个CDR又名“超变区”。各链中的CDR被框架区拉近，并与来自另一链中的CDR一起负责形成该抗体的抗原结合位点。至少有两种技术用于测定CDR：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,National Institutes of Health,Bethesda,MD)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-Lazikani等，1997,J.Mol.Biol.,273：927-948)。此外，本领域中可使用这两种方法的组合以测定CDR。

本文所使用的术语“单克隆抗体”是指同源性抗体群，其涉及高度特异性识别并结合单一抗原性决定簇或表位。这与多克隆抗体相反，后者通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物。术语“单克隆抗体”包含完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)抗体、双特异性抗体、包含抗体部分的融合蛋白、及任何其他包含抗原识别位点(抗原结合位点)的经修饰的免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指由任意数量的技术制备的上述抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤制备、噬菌体选择、重组表达及转基因动物。

本文所使用的术语“人源化抗体”是指包含最少非人序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合性免疫球蛋白或其片段的抗体形式。通常，人源化抗体是其中CDR的氨基酸残基被源自具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的氨基酸残基取代的人免疫球蛋白。在一些情况中，人免疫球蛋白的框架区氨基酸残基由来自非人物种的抗体中的对应氨基酸残基取代。人源化抗体可进一步通过额外取代框架区和/或经取代的非人氨基酸残基内的氨基酸残基加以修饰，以精细化和优化抗体特异性、亲和性、结构和/或结合能力。通常，人源化抗体将包含基本所有的对应于非人免疫球蛋白的至少一个、通常两个或三个CDR，而所有或基本所有的框架区是具有人免疫球蛋白序列的架构区。人源化抗体也可包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该部分。

如本文所使用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体可利用任何本领域已知的技术制备。

本文所使用的术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列是源自两个或更多个物种的抗体。通常，轻链及重链的可变区皆对应源自一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的抗体的可变区，然而恒定区对应源自另一个物种(通常是人)的抗体中的序列。

本文所使用的短语“亲和性成熟抗体”是指在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，所述一个或多个改变导致该抗体相较于不具有这些改变的亲代抗体对抗原的亲和性增加。该定义也包括与CDR氨基酸残基改变一起发生的非CDR氨基酸残基的改变。优选的亲和性成熟抗体通常具有纳摩尔或甚至皮摩尔程度的对靶抗原的亲和性。亲和性成熟抗体是由该领域已知的程序制备，包括但不限于重链及轻链可变结构域改组、CDR和/或框架氨基酸残基的随机诱变、或CDR和/或框架氨基酸残基的定点诱变。

术语“表位”及“抗原决定簇”在本文可交换使用，是指可被特定抗体识别且特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可由连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠并列安置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(又称为线性表位)通常在蛋白变性时仍被保留，然而通过三级折叠形成的表位(又称为构象表位)通常在蛋白变性时丧失。表位通常包括至少3个及更通常至少5或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。

术语“选择性结合”或“特异性结合”是指结合剂或抗体相较于替代性物质(包括非相关或相关蛋白)更频繁、更快速、更长期间地、以更高亲和性或上述条件的某些组合与表位、蛋白或靶分子反应或结合。在某些实施方式中，“特异性结合”是指例如抗体以大约0.1mM或更低、但通常低于大约1μM的K_D与蛋白结合。在某些实施方式中，“特异性结合”是指抗体有时以至少约0.1μM或更低，有时以至少约0.01μM或更低，且有时以至少约1nM或更低的K_D与靶标结合。由于不同物种的同源性蛋白之间具有序列同一性，因此特异性结合可包括识别超过一个物种中的蛋白(例如人RSPO3和小鼠RSPO3)的抗体。同样地，由于不同蛋白的多肽序列的某些区域内具有同源性，因此特异性结合可包括识别超过一种蛋白(例如人RSPO3和人RSPO1)的抗体(或其他多肽或结合剂)。应了解的是，在某些实施方式中，与第一靶标特异性结合的抗体或结合基团可能或可能不与第二靶标特异性结合。因此，“特异性结合”不一定需要(虽然可包括)排他性结合(即与单一靶标结合)。因此，在某些实施方式中，抗体与一种以上的靶标特异性结合。在某些实施方式中，多重靶标可能被抗体上的相同的抗原结合位点结合。举例来说，在某些情况下，抗体可能包含两个相同的抗原结合位点，所述两个抗原结合位点各自与两种以上的蛋白(例如RSPO3及RSPO1)上的相同表位特异性结合。在某些替代性实施方式中，抗体可能为多特异性且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合位点。以非限制性实例而言，双特异性抗体可包含识别一种蛋白(例如人RSPO3)上的表位的一个抗原结合位点，并且还包含识别第二蛋白上的不同表位的第二个不同的抗原结合位点。一般来说(但不必然)，提及结合是指特异性结合。

术语“多肽”和“肽”以及“蛋白”在本文可交换使用，这些术语是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为线性或支化的，其可能包含经修饰的氨基酸，且其可能间插以非氨基酸。所述术语还包含经天然或人为干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记成份缀合。该定义还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及包含本领域已知的其他修饰。应了解的是，由于本发明的多肽可能基于抗体，因此在某些实施方式中，所述多肽可能以单链或相连的链出现。

术语“多核苷酸”及“核酸”在本文可交换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或任何可通过DNA或RNA聚合酶被纳入聚合物中的底物。

“高严谨度的条件”可由下列条件鉴别：(1)采用低离子强度和高温清洗，例如在50℃的15mM NaCl/1.5mM柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如在42℃的具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液的于pH 6.5的5x SSC(0.75M NaCl，75mM柠檬酸钠)中的50％(体积/体积)甲酰胺；或(3)于杂交期间采用在42℃于5x SSC中的50％甲酰胺、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、经超声化的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，于42℃以0.2x SSC和50％甲酰胺清洗，其后于55℃以含有EDTA的0.1x SSC进行高严谨度清洗。

在两种或多种核酸或多肽的上下文时，术语“同一(identical)”或百分比“同一性(identity)”是指当两个或更多个序列或子序列经比较及比对(需要时引入空位(gap))以达最高对应性并且不把任何保守性氨基酸取代当作序列同一性的一部分时，所述两个或多个序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。百分比同一性可利用序列比较软件或算法测量，或通过目视检查测量。多种可被用于取得氨基酸或核苷酸序列比对的算法及软件是本领域所公知的。所述算法及软件包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin软件包及其变体。在一些实施方式中，本发明的两个核酸或多肽是基本同一性的，是指当两者经比较或比对以达最高对应性时，利用序列比较算法或目视检查得知其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％且在一些实施方式中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方式中，同一性存在于至少约10个、至少约20个、至少约40至60个残基、至少约60至80个残基长度或介于其间的任何整数长度的序列区域。在一些实施方式中，同一性存在于60至80个残基以上的更长区域，诸如至少约80至100个残基，且在一些实施方式中所述序列是与所比较的全长序列(诸如核苷酸序列的编码区)基本同一性的。

“保守性氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基取代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的类如领域中所定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例来说，以苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。优选地，本发明的多肽及抗体的序列中的保守性取代不会废止含有该氨基酸序列的多肽或抗体与该多肽或抗体原本所结合的抗原(即所述一种或多种RSPO蛋白)的结合。识别不消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守性取代的方法是本领域公知的。

本文所使用的术语“载体(vector)”是指构建体，该构建体能在宿主细胞中递送及通常表达一种或多种感兴趣的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒载体、粘粒载体、或噬菌体载体、与阳离子缩合剂有关的DNA或RNA表达载体，及包封于脂质体中的DNA或RNA表达载体。

经“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于未见于天然中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。经分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些经纯化至一定程度而使其不再以见于天然中的形式存在者。在一些实施方式中，经纯化的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本纯的。

本文所使用的术语“基本纯的”是指其为至少50％纯的(即不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的物质。

术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类、犬科动物、猫科动物、啮齿类等，其将成为特定治疗的接受者。通常，提及人受试者时，术语“受试者”及“患者”在本文可交换使用。

术语“药学可接受”是指经美国联邦政府的管理机关或州政府核准(或可核准)或经明列于美国药典或其他普遍公认的药典中以用于动物(包括人)的产品或化合物。

术语“药学可接受的赋形剂、载剂或佐剂”或“可接受的医药载剂”是指可与本发明的至少一种结合剂(例如抗体)一起施用至受试者的赋形剂、载剂或佐剂，且该赋形剂、载剂或佐剂不破坏该结合剂的活性。该赋形剂、载剂或佐剂应当在与足以实现治疗效果的剂量的结合剂一起施用时不具毒性。一般来说，本领域技术人员及美国FDA认为药学可接受的赋形剂、载剂或佐剂是任何调制剂的非活性成分。

术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或疾患的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、小型有机分子或其他药物的量。以纤维化疾病为例，试剂(例如抗体)的治疗有效量具有治疗效果，且因此可预防纤维化疾病的发展；减缓纤维化疾病的发展；减缓纤维化疾病的进展；减少疾病中纤维化的量；减少纤维化材料在器官中的病理性沉积；减少结缔组织或细胞外基质在器官中的病理性沉积；在某种程度上缓解与纤维化疾病相关的一种或多种症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；或上述效果的组合。

术语“治疗”或“缓和”是指1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状和/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展以及2)预防性或防范性措施，该措施预防或减缓标靶向的病理状况或疾患的发展。因此那些需要治疗者包括那些已罹患该疾患者、那些易于罹患该疾患者，以及那些期望预防该疾患者。在一些实施方式中，如果患者显示出以下中的一项则受试者被本发明的方法成功“治疗”：预防纤维化疾病的发展；减缓纤维化疾病的发展；减缓纤维化疾病的进展；减少疾病中纤维化的量；减少纤维化材料在器官中的病理性沉积；减少结缔组织或细胞外基质在器官中的病理性沉积；在某种程度上缓解与纤维化疾病相关的一种或多种症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；或上述效果上述效果的组合。

如本公开和权利要求中所用，单数形式的“一”(a,an)及“所述(该)”(the)包含复数形式，除非上下文另外明确说明。

应当理解，只要本文的实施方式是以术语“包含”描述，其也提供了其他的以“由...组成”和/或“基本由...组成”的术语所描述的类似实施方式。还应理解，只要本文的实施方式是以术语“基本上由...组成”描述，其亦提供其他以“由...组成”的术语所描述的类似实施方式。

当使用于本文诸如“A和/或B”的用词中，术语“和/或”是意图包括A及B两者、A或B、A(单独)及B(单独)。同样地，当使用于本文诸如“A、B和/或C”的用词中，术语“和/或”是意图包含下列实施方式的各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(单独)；B(单独)；及C(单独)。

II.使用方法及药物组合物

本发明提供用于预防和/或治疗纤维化疾病的方法。在一些实施方式中，方法包括使用本文所述的RSPO结合剂和/或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)。在一些实施方式中，RSPO结合剂是人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的拮抗剂。在一些实施方式中，LGR结合剂是人LGR4、LGR5和/或LGR6的结合剂。所述方法可为体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)方法。本发明还提供了本文所述的RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)在制造用于治疗纤维化疾病的药物中的用途。

本发明提供使用本文所述的RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)治疗或预防纤维化疾病的方法。在某些实施方式中，治疗纤维化疾病的方法包括在体外使细胞或组织与RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)接触。例如，成纤维细胞(来自所关注器官的细胞系或初代细胞)与所关注的试剂(例如RSPO结合剂或LGR结合剂)接触。所关注的试剂的效应可通过评估肌成纤维细胞/间充质分化来观察，包括但不限于：α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1、和/或纤维粘连蛋白(fibronectin)的上调；细胞外基质沉积；和胶原蛋白/羟基脯氨酸含量。

在某些实施方式中，治疗纤维化疾病的方法包括在体内使细胞或组织与RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)接触。在某些实施方式中，使细胞或组织接触RSPO结合剂或LGR结合剂于动物模型中进行。例如，RSPO结合剂可被施用至具有纤维化疾病的小鼠。在一些实施方式中，RSPO结合剂可被施用至转基因小鼠。在一些实施方式中，RSPO结合剂被施用于动物。在一些实施方式中，在施用纤维化诱导剂至动物的同时或施用后短时间内施用RSPO结合剂以预防纤维化的发展(“预防模型”)。在一些实施方式中，在已经诱导纤维化后施用RSPO结合剂作为治疗剂(“治疗模型”)。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗RSPO1抗体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗RSPO2抗体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是可溶性受体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是LGR5可溶性受体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是LGR5-Fc融合蛋白。

在动物中诱导纤维化的模型是本领域技术人员已知的。例如，肺纤维化可通过在小鼠腹膜内注射博来霉素来诱导。肺纤维化也可通过气管内滴注博来霉素、荧光素异硫氰酸酯或颗粒物(诸如二氧化硅和石绵)来诱导。肝纤维化可通过在小鼠腹膜内注射四氯化碳来诱导。皮肤纤维化可通过在小鼠局部注射博来霉素来诱导。

在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的RSPO结合剂。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO抗体。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR可溶性受体。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR结合剂。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗LGR抗体。

在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO1抗体。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO1抗体，其中该抗RSPO1抗体包含：包含TGYTMH(SEQ ID NO:5)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:6)的重链CDR2、及包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:7)的重链CDR3；以及包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)的轻链CDR3。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO1抗体，其中该抗RSPO1抗体包含：与SEQ ID NO:11具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO1抗体，其中该抗RSPO1抗体包含：与SEQ ID NO:56具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO1抗体，其中该抗RSPO1抗体包含：SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO1抗体，其中该抗RSPO1抗体包含：SEQ ID NO:56的重链可变区和SEQ ID NO:57的轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是人源化版本的抗体89M5。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是抗体h89M5-H8L5。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是抗体h89M5-H2L2。

在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO2抗体。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO2抗体，其中该抗RSPO2抗体包含：包含SSYAMS(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)的重链CDR2、及包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3；以及包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)的轻链CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)的轻链CDR3。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO2抗体，其中该抗RSPO2抗体包含：与SEQ ID NO:27具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO2抗体，其中该抗RSPO2抗体包含：SEQ ID NO:27的重链可变区及SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66的轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是人源化版本的抗体130M23。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是抗体h130M23-H1L2。

在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO3抗体。在某些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO3抗体，其中该抗RSPO3抗体包含：包含DYSIH(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SQ ID NO:38)的重链CDR2、及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:39)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO:40)的重链CDR3；以及包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:42)或AAS(SEQ ID NO:43)的轻链CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:45)的轻链CDR3。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO3抗体，其中该抗RSPO3抗体包含：与SEQ ID NO:46具有至少约90％序列同一性的重链可变区及与SEQ ID NO:47具有至少90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗RSPO3抗体，其中该抗RSPO3抗体包含：SEQ ID NO:46的重链可变区及SEQ ID NO:47的轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO3抗体是抗体131R010。

在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗LGR抗体。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗LGR5抗体，其中所述抗LGR5抗体包含：由ATCC保藏号为PTA-9342的88M1杂交瘤所产生的单克隆抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和由ATCC保藏号为PTA-9342的88M1杂交瘤所产生的单克隆抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的抗LGR5抗体，其中所述抗LGR5抗体包含：由ATCC保藏号为PTA-9342的88M1杂交瘤所产生的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。

在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR可溶性受体。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR5可溶性受体，其中所述LGR5可溶性受体包含LGR5的胞外结构域或其片段。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR5可溶性受体，其中所述LGR5可溶性受体包含人LGR5的22-564位氨基酸。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR5可溶性受体，其中所述LGR5可溶性受体包含SEQ ID NO:74。在一些实施方式中，治疗或预防纤维化疾病的方法包括对受试者施用治疗有效量的LGR5可溶性受体，其中所述LGR5可溶性受体包含SEQ ID NO:75。

在本文所述的方法的一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1且预防纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1且减缓纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1且减缓纤维化疾病的进展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1且减少疾病中纤维化的量。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1且减少纤维化材料在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1且减少结缔组织和/或细胞外基质在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗RSPO1抗体。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是抗体89M5的人源化版本。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是h89M5-H8L5。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是h89M5-H2L2。

在本文所述的方法的一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO2且预防纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO2且减缓纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO2且减缓纤维化疾病的进展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO2且减少疾病中纤维化的量。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO2且减少纤维化材料在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO2且减少结缔组织和/或细胞外基质在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗RSPO2抗体。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是抗体130M23的人源化版本。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是h130M23-H1L6。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是h130M23-H1L2。

在本文所述的方法的一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO3且预防纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO3且减缓纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO3且减缓纤维化疾病的进展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO3且减少疾病中纤维化的量。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO3且减少纤维化材料在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO3且减少结缔组织和/或细胞外基质于器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，抗RSPO3抗体是131R010。

在本文所述的方法的一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4且预防纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4且减缓纤维化疾病的发展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4且减缓纤维化疾病的进展。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4且减少疾病中纤维化的量。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4且减少纤维化材料在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂结合RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4且减少结缔组织和/或细胞外基质在器官中的病理性沉积。在一些实施方式中，RSPO结合剂是LGR可溶性受体。在一些实施方式中，该LGR可溶性受体是LGR5可溶性受体。在一些实施方式中，该LGR5可溶性受体包含Fc区。在一些实施方式中，该LGR可溶性受体是包含SEQ ID NO:72的LGR5-Fc融合蛋白。

在所述方法的一些实施方式中，该纤维化疾病是选自：肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、心纤维化及粘连形成。在一些实施方式中，该纤维化疾病是皮肤纤维化。在一些实施方式中，该皮肤纤维化包括但不限于硬皮症、全身性硬化症、硬皮症样疾病、无皮肤硬化的硬皮症、瘢痕疙瘩形成及肥厚性瘢痕形成。在一些实施方式中，该纤维化疾病是肾纤维化。在一些实施方式中，该肾纤维化包括但不限于慢性肾疾病。在一些实施方式中，该纤维化疾病是肺纤维化。在一些实施方式中，该肺纤维化包括但不限于特发性肺纤维化、间质肺纤维化、肺部纤维化、纵膈纤维化及胸膜纤维化。在一些实施方式中，该肺纤维化是原发性肺纤维化。在一些实施方式中，该肺纤维化是继发性肺纤维化。在一些实施方式中，该纤维化疾病是肝纤维化。在一些实施方式中，该肝纤维化包括但不限于肝硬化。在一些实施方式中，该纤维化疾病是心纤维化。在一些实施方式中，该心脏纤维化包括但不限于心肌纤维化、心瓣膜纤维化、心内膜心肌纤维化及动脉粥样硬化。在一些实施方式中，该纤维化疾病不是肺纤维化。在一些实施方式中，该纤维化疾病不是肝纤维化。在一些实施方式中，该心纤维化不是动脉粥样硬化。

在某些实施方式中，方法还包含确定组织中至少一种RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平的步骤。在一些实施方式中，确定组织中RSPO的表达水平的步骤包含确定RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平。在一些实施方式中，将组织样品(例如纤维化组织)中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平与参考样品中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平比较。在一些实施方式中，将组织样品中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平与正常组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平比较。在一些实施方式中，将组织样品中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平与的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4表达的预定水平比较。在一些实施方式中，将组织样品中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平与的正常组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4表达的预定水平比较。在一些实施方式中，该组织具有高表达水平的RSPO1。在一些实施方式中，该组织具有高表达水平的RSPO2。在一些实施方式中，该组织具有高表达水平的RSPO3。通常，将组织样品中RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平与该相同组织类型的正常组织中的RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平比较。然而在一些实施方式中，RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平是与一群组织类型内的RSPO(即蛋白或核酸)的平均表达水平比较。在一些实施方式中，组织样品中RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平是与组织类型相同或组织类型不同的其他组织样品中的RSPO(即蛋白或核酸)的表达水平比较。

在一些实施方式中，确定RSPO的表达水平于治疗前进行。在一些实施方式中，若组织样品的RSPO的表达水平与参考样品(例如正常组织)中相同RSPO的表达水平或预定水平相比升高，则对受试者施用本文所述的RSPO结合剂或抗体。举例而言，在一些实施方式中，若组织样品的RSPO3(即蛋白或核酸)的表达水平与正常或对照组织中RSPO3的表达水平相比升高，则对受试者施用RSPO3结合剂(例如抗RSPO3抗体)。

此外，本发明提供鉴定人受试者以用于以RSPO结合剂或LGR结合剂治疗的方法，该方法包括确定该受试者是否具有与正常组织、参考样品中该相同RSPO(即蛋白或核酸)的表达或该RSPO蛋白的预定水平相比升高的RSPO(即蛋白或核酸)表达水平的组织样品(纤维化组织)。

在一些实施方式中，鉴定人受试者以用于RSPO1结合剂治疗的方法包括：确定该受试者是否具有与参考样品或RSPO1的预定水平相比升高的RSPO1表达水平的纤维化组织。在一些实施方式中，鉴定人受试者以用于RSPO1结合剂治疗的方法包括：自该受试者获得纤维化组织的样品，并确定该纤维化组织是否具有与参考样品或RSPO1的预定水平相比升高的RSPO1表达水平。在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高的RSPO1表达水平，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO1的抗体治疗。在一些实施方式中，若经选择用于治疗，则对该受试者施用本文所述的抗RSPO1抗体。在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高的RSPO1表达水平，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO1的LGR可溶性受体治疗。在一些实施方式中，若经选择用于治疗，则对该受试者施用本文所述的LGR可溶性受体。

在一些实施方式中，鉴定人受试者以用于RSPO2结合剂治疗的方法包括：确定该受试者是否具有与参考样品或预定的RSPO2水平相比升高的RSPO2表达水平的纤维化组织。在一些实施方式中，鉴定人受试者以用于RSPO2结合剂治疗的方法包括：自该受试者获得纤维化组织的样品，并确定该纤维化组织是否具有与参考样品或预定的RSPO2水平相比升高的RSPO2表达水平。在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高的RSPO2表达水平，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO2的抗体治疗。在一些实施方式中，若经选择用于治疗，则对该受试者施用本文所述的抗RSPO2抗体。在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高的RSPO2表达水平，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO2的LGR可溶性受体治疗。在一些实施方式中，若经选择用于治疗，则对该受试者施用本文所述的LGR可溶性受体。

在一些实施方式中，鉴定人受试者以用于RSPO3结合剂治疗的方法包括：确定该受试者是否具有与参考样品或预定的RSPO3水平相比升高的RSPO3表达水平的纤维化组织。在一些实施方式中，鉴定人受试者以用于RSPO3结合剂治疗的方法包括：自该受试者获得纤维化组织的样品，并确定该纤维化组织是否具有与参考样品或预定的RSPO3水平相比升高的RSPO3表达水平。在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高的RSPO3表达水平，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO3的抗体治疗。在一些实施方式中，若经选择用于治疗，则对该受试者施用本文所述的抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高的RSPO3表达水平，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO3的LGR可溶性受体治疗。在一些实施方式中，若经选择用于治疗，则对该受试者施用本文所述的LGR可溶性受体。

在一些实施方式中，若该纤维化组织具有升高表达水平的超过一种RSPO(即蛋白或核酸)，则对该受试者施用与最高表达水平的RSPO结合的RSPO结合剂。在一些实施方式中，确定纤维化组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平，若该纤维化组织的RSPO1表达水平与正常组织中RSPO1的水平相比升高，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO1的抗体治疗。若经选择用于治疗，则对该受试者施用如本文所述的抗RSPO1抗体。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体89M5的人源化版本。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体h89M5-H8L5。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体h89M5-H2L3。在一些实施方式中，确定纤维化组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平，若该纤维化组织的RSPO2表达水平与正常组织中RSPO2的水平相比升高，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO2的抗体治疗。若经选择用于治疗，则对该受试者施用如本文所述的抗RSPO2抗体。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体130M23的人源化版本。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，确定纤维化组织中RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表达水平，若该纤维化组织的RSPO3表达水平与正常组织中RSPO3的水平相比升高，则选择该受试者用于以特异性结合RSPO3的抗体治疗。若经选择用于治疗，则对该受试者施用如本文所述的抗RSPO3抗体。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是抗体131R011。

本发明还提供了治疗人受试者的纤维化疾病的方法，该方法包括：(a)选择用于治疗的受试者，该选择(至少部分地)基于该受试者具有升高水平的RSPO1的组织样品，及(b)对该受试者施用如本文所述的治疗有效量的RSPO1结合剂。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体89M5的人源化版本。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体h89M5-H8L5。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体h89M5-H2L2。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是LGR可溶性受体。

本发明还提供了治疗人受试者的纤维化疾病的方法，该方法包括：(a)选择用于治疗的受试者，该选择(至少部分地)基于该受试者具有升高水平的RSPO2的组织样品，及(b)对该受试者施用如本文所述的治疗有效量的RSPO2结合剂。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体130M23的人源化版本。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体h130M23-H1L6。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体h130M23-H1L2。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是LGR可溶性受体。

本发明还提供了治疗人受试者的纤维化疾病的方法，该方法包括：(a)选择用于治疗的受试者，该选择(至少部分地)基于该受试者具有升高水平的RSPO3的组织样品，及(b)对该受试者施用如本文所述的治疗有效量的RSPO3结合剂。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是抗体131R010。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是LGR可溶性受体。

用于确定细胞或组织中的RSPO表达水平的方法是本领域技术人员所已知的。对核酸表达而言，所述方法包括但不限于PCR类检测、微阵列分析及核苷酸测序(例如NextGen测序)。对蛋白表达而言，所述方法包括但不限于Western印迹分析、蛋白阵列、ELISA、免疫组织化学(IHC)检测和FACS。

确定纤维化组织是否具有升高的RSPO表达水平的方法可使用多种样品。在一些实施方式中，该样品是取自具有纤维化疾病的受试者。在一些实施方式中，该样品是新鲜样品。在一些实施方式中，该样品是冷冻样品。在一些实施方式中，该样品是经福尔马林固定的石蜡包埋样品。在一些实施方式中，该样品被处理成细胞裂解物。在一些实施方式中，该样品被处理成DNA或RNA。

本发明还提供包含本文所述的RSPO结合剂的组合物。在某些实施方式中，组合物是包含药学可接受载剂的药物组合物。在一些实施方式中，该药物组合物具有治疗或预防受试者(例如人患者)中的纤维化疾病的用途。

通过组合本发明的经纯化的抗体或试剂与药学可接受的载体(例如载剂或赋形剂)来制备用于储存及使用的制剂。本领域技术人员通常认为药学可接受的载剂、赋形剂、和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。

适当的药学可接受的载剂包括但不限于：非毒性缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯酚、丁醇或苄醇、烷基对羟基苯甲酸酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚；低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，诸如单糖、双糖、葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐形成反离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白质络合物)；以及非离子型表面活性剂，诸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)(Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22^nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London)。

本发明的药物组合物可以任意种方式经局部或系统施用。施用可为通过表皮贴片、经皮贴片、软膏、乳液、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液体剂及粉末剂的外用(topical)施用；通过吸入或喷入粉末剂或气雾剂的经肺施用，包括通过喷雾器、气管内或鼻内施用；口服；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或心室内)施用。在本文所述的方法的一些实施方式中，RSPO结合剂是经局部施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是经皮下施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是经肌内施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是经外用施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是经静脉内施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是经吸入施用。

治疗制剂可呈单位剂型。所述制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、水或非水性介质中的溶液或悬浮液、或者栓剂。在固态组合物诸如片剂中，主要活性成分与药物载剂混合。常用的制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶以及稀释剂(例如水)。这些可用来形成含有本发明的化合物或其无毒性药学可接受盐的均质混合物的固体预配制组合物。固体预配制组合物接着被细分成上述种类的单位剂型。片剂、丸剂等制剂或组合物可经包覆或经其他方式复合以提供具有长效优点的剂型。举例而言，片剂或丸剂可包含由外部成份包覆的内部组合物。另外，这两种成份可以由肠溶层分开，该肠溶层用来抵抗崩解，并允许所述内部成份完整通过胃或被延迟释放。多种物质可用于该肠溶层或包覆层，这些物质包括多种聚合酸及聚合酸与诸如虫胶、鲸腊醇及醋酸纤维素等材料的混合物。

本文所述的RSPO结合剂或抗体亦可被包封于微胶囊中。所述微胶囊是通过例如凝集技术或通过界面聚合而制备，例如分别处于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳化液、纳米微粒及纳米微囊)或处于巨乳液(macroemulsion)中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22^nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。

在某些实施方式中，药物制剂包括与脂质体复合的本发明的RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)。制备脂质体的方法是本领域技术人员已知的。举例来说，有些脂质体可通过逆相蒸发含有磷脂酰胆碱、胆固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来制备。脂质体可被挤压通过规定孔径的滤膜以产生具有所需直径的脂质体。

在某些实施方式中，可制备包含本文所述的RSPO结合剂或LGR结合剂的持续释放制剂。持续释放制剂的适当实例包括含有RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)的固相疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是呈成型品的形式(例如膜或微胶囊)。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸与7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)所组成的注射型微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

在某些实施方式中，除了施用RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)以外，所述方法或治疗还包含施用至少一种额外的治疗剂。额外的治疗剂可于施用RSPO结合剂或LGR结合剂之前、同时和/或之后施用。本发明还提供了包含额外治疗剂的药物组合物。在一些实施方式中，至少一种额外治疗剂包含1、2、3或更多种额外的治疗剂。

利用两种或更多种治疗剂的组合疗法通常使用具有不同作用机制的试剂，但并非必须如此。使用不同作用机制的试剂的组合疗法可能导致加成或协同效应。组合疗法可允许相较于单一疗法使用较低剂量的各试剂，由此减少所述试剂的毒性副作用和/或增加治疗指数。

在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂与至少一种额外治疗剂的组合导致加成或协同性结果。在一些实施方式中，组合疗法导致RSPO结合剂或LGR结合剂的治疗指数增加。在一些实施方式中，组合疗法导致所述额外试剂的治疗指数增加。在一些实施方式中，组合疗法导致RSPO结合剂或LGR结合剂的毒性和/或副作用减少。在一些实施方式中，组合疗法导致所述额外试剂的毒性和/或副作用减少。

在一些实施方式中，额外治疗剂是抗炎剂。在一些实施方式中，抗炎剂是类固醇、糖皮质类固醇或皮质类固醇。类固醇可包括但不限于倍氯米松(beclometasone)、布地奈德(budesonide)、氟尼缩松(flunisolide)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、及强的松(prednisone)。

在一些实施方式中，抗炎剂是非类固醇抗炎剂(NSAID)。NSAID可包括但不限于萘普生钠(naproxen sodium)、塞来昔布(celecoxib)、舒林达酸(sulindac)、奥沙普秦(oxaprozin)、双水杨酸酯(salsalate)、二氟尼柳(diflunisal)、匹洛西卡(piroxicam)、吲哚美洒辛(indomethacin)、伊托多雷(etodolac)、美洛昔康(meloxicam)、萘普生、萘丁美酮(nabumetone)、酮咯酸氨基丁三醇(ketorolac tromethamine)、萘普生/埃索美拉唑(exomeprazole)、双氯芬酸(diclofenac)和阿司匹林(aspirin)。

在一些实施方式中，抗炎剂是小分子。在一些实施方式中，抗炎剂是酪氨酸激酶抑制剂，诸如伊马替尼(imatinib)(GLEEVEC)。

在一些实施方式中，抗炎剂是促炎性细胞因子、白介素、淋巴因子、和/或趋化因子的抑制剂。在一些实施方式中，抗炎剂是抑制促炎性细胞因子的活性的抗体。在一些实施方式中，抗炎剂是结合和/或抑制下列的抗体：IL-1、IL-18、IL-33、IL36、IL-37、IL-6、IL-11、IL-31、IL-17、IL-25、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素α、干扰素γ和/或干扰素β。

在一些实施方式中，额外治疗剂是Wnt途径抑制剂。在一些实施方式中，Wnt途径抑制剂为卷曲(FZD)蛋白结合剂(FZD结合剂)。FZD结合剂的非限制性实例可见于美国专利第7,982,013号。FZD结合剂可包括但不限于抗FZD抗体。在一些实施方式中，方法包括施用RSPO结合剂与抗FZD抗体的组合。在一些实施方式中，方法包括施用RSPO结合剂与抗FZD抗体18R5的组合。在一些实施方式中，Wnt途径抑制剂为Wnt蛋白结合剂(Wnt结合剂)。Wnt结合剂的非限制性实例可见于美国专利第7,723,477及7,947,277号以及国际专利公开号WO 2011/088127及WO 2011/088123。Wnt结合剂可包括但不限于抗Wnt抗体及FZD-Fc可溶性受体。在一些实施方式中，方法包括施用RSPO结合剂或LGR结合剂与FZD-Fc可溶性受体的组合。在一些实施方式中，方法包括施用RSPO结合剂或LGR结合剂与FZD8-Fc可溶性受体的组合。在一些实施方式中，方法包括施用RSPO结合剂或LGR结合剂与抗FZD抗体的组合。

在一些实施方式中，本文所述的所述方法包括施用治疗有效量的RSPO结合剂或LGR结合剂与多于一种的额外治疗剂的组合。

组合施用可包括以单一药物制剂共施用或以分开的制剂共施用，或以任何顺序连续施用但通常在一段期间内以使所有活性剂可同时发挥其生物活性。

应该理解，RSPO结合剂或LGR结合剂与至少一种额外治疗剂的组合可以任何顺序施用或同时施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂将被施用至之前接受第二治疗剂治疗的患者。在某些其他实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂与第二治疗剂将被基本同时或同期施用。举例来说，受试者可能在接受第二治疗剂(例如化学治疗)的疗程的同时被给予RSPO结合剂(例如抗体)。在某些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂将于接受第二治疗剂治疗的1年内施用。在某些替代性实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂将于接受任何第二治疗剂治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在某些其他实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂将于接受第二治疗剂治疗的4、3、2或1周内施用。在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂将于接受第二治疗剂治疗的5、4、3、2或1天内施用。还应该理解，所述两种(或更多种)试剂或治疗可在数小时或数分钟内(即基本同步)施用至受试者。

对疾病的治疗而言，本发明的RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)的适当剂量取决于所需治疗的疾病类型、该疾病的严重性及病程、该疾病的响应性、该RSPO结合剂或LGR结合剂是否经施用以达到治疗或预防目的、先前治疗、该患者的临床病史等，所有皆由主治医师斟酌。RSPO结合剂或抗体可经施用一次或以持续数天至数月的治疗系列施用，或持续施用直到达成疗效或达到减少的疾病状态。最佳给药方案可自药物累积于患者体内的测量值加以计算，且将视个别抗体或试剂的相对强度而异。主治医师可容易地决定最佳剂量、给药方法及重复频率。在某些实施方式中，剂量是0.01μg至100mg/kg体重、0.1μg至100mg/kg体重、1μg至100mg/kg体重、1mg至100mg/kg体重、1mg至80mg/kg体重、10mg至100mg/kg体重、10mg至75mg/kg体重、或10mg至50mg/kg体重。在某些实施方式中，RSPO结合剂的剂量是约0.1mg至约20mg/kg体重。在某些实施方式中，剂量可于每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在某些实施方式中，RSPO结合剂是每周给予一次、每二周给予一次或每三周给予一次。

如本领域技术人员所知，施用任何治疗剂可能导致副作用和/或毒性。在一些情况中，副作用和/或毒性非常严重以至于无法施用治疗有效剂量的特定试剂。在一些情况中，药物治疗必须中断，并尝试其他试剂。然而，许多相同治疗类别的试剂通常展现类似的副作用和/或毒性，这意味着患者必须停止治疗或者可能的话忍受与该治疗剂有关的不适副作用。

因此，本发明提供治疗受试者的纤维化疾病的方法，所述方法包括使用间歇性给药策略来施用一种或多种试剂，如此可减少与施用RSPO结合剂、LGR结合剂、第二试剂等相关的副作用和/或毒性。

III.RSPO和LGR拮抗剂

本发明提供包含与人RSPO蛋白或人LGR蛋白特异性结合的试剂的方法。所述剂在本文分别被称为“RSPO结合剂”和“LGR结合剂”。RSPO结合剂和LGR结合剂的非限制性实例可见于美国专利公开号2006/0275870、2009/0074782、2009/0191205、2009/0220495、2010/0071078、2012/0039912、2012/0263730、2013/0095116、2013/0336885、2013/0337533、2014/0017253、2014/0302054、2015/0147333以及国际专利公开号WO2010/016766、WO 2014/012007、WO 2014/192974。在一些实施方式中，RSPO结合剂是抗体。在一些实施方式中，RSPO结合剂是多肽。在某些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO1结合(“RSPO1结合剂”)。在某些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO2结合(“RSPO2结合剂”)。在某些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO3结合(“RSPO3结合剂”)。在某些实施方式中，RSPO结合剂与一种或多种人RSPO蛋白特异性结合。人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4的全长氨基酸(aa)序列是本领域已知的，在本文中提供为SEQ ID NO:1(RSPO1)、SEQ ID NO:2(RSPO2)、SEQ ID NO:3(RSPO3)及SEQ ID NO:4(RSPO4)。在某些实施方式中，RSPO结合剂是包含人LGR蛋白的胞外结构域或其片段的可溶性受体。在某些实施方式中，所述人LGR蛋白是LGR4、LGR5或LGR6。人LGR4、LGR5和LGR6的全长氨基酸(aa)序列是本领域已知的，在本文中提供为SEQ ID NO:71(LGR4)、SEQ ID NO:72(LGR5)和SEQ ID NO:73(LGR6)。

在某些实施方式中，LGR结合剂是抗体。在一些实施方式中，LGR结合剂是多肽。在某些实施方式中，LGR结合剂与LGR4结合(“LGR4结合剂”)。在某些实施方式中，LGR结合剂与LGR5结合(“LGR5结合剂”)。在某些实施方式中，LGR结合剂与LGR6结合(“LGR6结合剂”)。在一些实施方式中，LGR结合剂与一种或多种人LGR蛋白特异性结合。

在某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的抗原结合位点能结合(或结合)一、二、三或四种RSPO。在某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的抗原结合位点能结合(或结合)第一RSPO蛋白(例如RSPO1)以及一、二或三种其他RSPO(例如RSPO2、RSPO3和/或RSPO4)。在一些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体)与人RSPO及小鼠RSPO两者特异性结合。

在本文所述的方法的某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO1(SEQ ID NO:1)的21至263位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO1(SEQ ID NO:1)的31至263位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO1(SEQ ID NO:1)的34至135位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO1(SEQ ID NO:1)的34至85位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO1(SEQ ID NO:1)的91至135位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO1(SEQ ID NO:1)的147至207位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO1的furin样富半胱氨酸结构域结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO1的furin样富半胱氨酸区内的至少一个氨基酸结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO1的血小板反应素结构域结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO1的血小板反应素结构域内的至少一个氨基酸结合。

在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO2(SEQ ID NO:2)的位氨基酸22至243内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO2(SEQ ID NO:2)的22至205位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO2(SEQ ID NO:2)的35至134位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO2(SEQ ID NO:2)的34至84位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO2(SEQ ID NO:2)的90至134位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO2的furin样富半胱氨酸结构域结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO2的furin样富半胱氨酸结构域内的至少一个氨基酸结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO2的血小板反应素结构域结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO2的血小板反应素结构域内的至少一个氨基酸结合。

在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO3(SEQ ID NO:3)的22至272位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO3(SEQ ID NO:3)的22至207位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO3(SEQ ID NO:3)的35至135位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO3(SEQ ID NO:3)的35至86位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂是特异性结合在人RSPO3(SEQ ID NO:3)的92至135位氨基酸内的抗体。在某些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO3的furin样富半胱氨酸结构域结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO3的furin样富半胱氨酸结构域内的至少一个氨基酸结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO3的血小板反应素结构域结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂与RSPO3的血小板反应素结构域内的至少一个氨基酸结合。

在某些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(K_D)与至少一种RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(K_D)与至少一种RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约20nM或更低的K_D与至少一种RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约10nM或更低的K_D与至少一种RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约1nM或更低的K_D与至少一种RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约0.5nM或更低的K_D与至少一种RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约0.1nM或更低的K_D与至少一种RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)与至少两种RSPO蛋白结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂以大约10nM或更低的K_D与人RSPO及小鼠RSPO两者结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂以大约1nM或更低的K_D与人RSPO及小鼠RSPO两者结合。在一些实施方式中，RSPO结合剂以大约0.1nM或更低的K_D与人RSPO及小鼠RSPO两者结合。在一些实施方式中，结合剂(例如抗体或可溶性受体)对RSPO蛋白的解离常数是利用固定于Biacore芯片上的包含至少一部分所述RSPO蛋白的RSPO融合蛋白所确定的解离常数。在一些实施方式中，结合剂(例如抗体或可溶性受体)对RSPO蛋白的解离常数是利用被Biacore芯片上的抗人IgG抗体所捕获的结合剂及RSPO蛋白所确定的解离常数。

在某些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC₅₀)与至少一种人RSPO蛋白结合。在某些实施方式中，RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC₅₀)与至少一种人RSPO结合。

在某些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(K_D)与至少一种LGR蛋白结合。在某些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的解离常数(K_D)与至少一种LGR蛋白结合。在一些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约20nM或更低的K_D与至少一种LGR蛋白结合。在一些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约10nM或更低的K_D与至少一种LGR蛋白结合。在一些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约1nM或更低的K_D与至少一种LGR蛋白结合。在一些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约0.5nM或更低的K_D与至少一种LGR蛋白结合。在一些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约0.1nM或更低的K_D与至少一种LGR蛋白结合。在某些实施方式中，本文所述的LGR结合剂(例如抗体)与至少两种LGR蛋白结合。在一些实施方式中，结合剂(例如抗体)对LGR蛋白的解离常数是利用固定于Biacore芯片上的包含至少一部分所述LGR蛋白的LGR融合蛋白所确定的解离常数。在一些实施方式中，结合剂(例如抗体)对LGR蛋白的解离常数是利用被Biacore芯片上的抗人IgG抗体所捕获的结合剂及LGR蛋白所确定的解离常数。

在某些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC₅₀)与至少一种人LGR蛋白结合。在某些实施方式中，LGR结合剂(例如抗体)以大约1μM或更低、大约100nM或更低、大约40nM或更低、大约20nM或更低、大约10nM或更低、大约1nM或更低、或大约0.1nM或更低的半数最高有效浓度(EC₅₀)与至少一种人LGR结合。

在某些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是抗体。在一些实施方式中，该抗体是重组抗体。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是嵌合抗体。在一些实施方式中，该抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，该抗体是人抗体。在一些实施方式中，该抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在某些实施方式中，该抗体是IgG1抗体。在某些实施方式中，该抗体是IgG2抗体。在某些实施方式中，该抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，该抗体是包含抗原结合位点的抗体片段。在一些实施方式中，该抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体是单价抗体。在一些实施方式中，该抗体是单特异性抗体。在一些实施方式中，该抗体是双价抗体。在一些实施方式中，该抗体与细胞毒性部分缀合。在一些实施方式中，该抗体是分离的。在一些实施方式中，该抗体是基本纯的。

本发明的RSPO结合剂(例如抗体)的特异性结合可使用该领域已知的任何方法检测。可使用的免疫检测包括但不限于竞争性及非竞争性检测系统，所述系统利用诸如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹分析、放射性免疫检测、ELISA、“夹心式”免疫检测、免疫沉淀检测、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散检测、凝集检测、补体固定检测、免疫放射检测、荧光免疫检测及蛋白质A免疫检测等技术。所述检测是例行性检测且是本领域公知的(参见例如Ausubel等，Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。

例如，试剂与人RSPO蛋白的特异性结合可利用ELISA确定。ELISA检测包含：准备抗原，以抗原包覆96孔微滴定板的板孔，添加与可检测的化合物诸如酶底物(例如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)缀合的RSPO结合剂至板孔，温育一段时间，并且检测与该抗原结合的试剂的存在。在一些实施方式中，RSPO结合剂不与可检测的化合物缀合，而是将识别该RSPO结合剂且与可检测化合物缀合的第二抗体(例如抗Fc抗体)加入板孔中。在一些实施方式中，不以抗原包覆板孔，反而以RSPO结合剂包覆板孔，并于添加抗原至该经包覆的板孔后加入与可检测化合物缀合的第二抗体。本领域技术人员将了解可经修改以增加检测到的信号的参数以及本领域所知的ELISA的其他变量。

在另一实例中，试剂与人RSPO蛋白的特异性结合可利用FACS测定。FACS筛选测定可包含：制备cDNA构建体以将抗原表达为融合蛋白(例如RSPO-CD4TM)，将该构建体转染至细胞中，使该抗原表达在细胞表面上，使该RSPO结合剂与经转染的细胞混合，并且培养一段时间。经RSPO结合剂结合的细胞可利用与可检测的化合物缀合的二抗(例如与PE缀合的抗Fc抗体)及流式细胞分析识别。本领域技术人员将了解可经修改以优化检测到的信号的参数以及其他可增进筛选(例如筛选阻断抗体)的FACS变量。

试剂对抗原的结合亲和性及试剂-抗原相互作用的解离速率(off-rate)可通过竞争性结合检测确定。竞争性结合检测的一个实例是放射性免疫检测，其包含在渐增量的未经标记的抗原存在下，将经标记的抗原(例如以³H或¹²⁵I标记)或其片段或变体与感兴趣的抗体温育，随后检测与经标记的抗原结合的试剂。试剂与抗原的亲和性及结合解离速率可由Scatchard图分析的数据确定。在一些实施方式中，Biacore动力学分析是用于测定与抗原结合的试剂的结合及解离速率。在一些实施方式中，Biacore动力学分析包括分析抗体与芯片表面上经固定的抗原的结合及解离。在一些实施方式中，Biacore动力学分析包括分析抗原与芯片表面上经固定的结合剂的结合及解离。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂(例如抗体)包含抗体89M5的一、二、三、四、五和/或六个CDR(见表1)。

表1

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：包含TGYTMH(SEQ ID NO:5)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:6)的重链CDR2、及包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:7)的重链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂还包含：包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:5)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:6)的重链CDR2、及包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:7)的重链CDR3；以及(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR2、及包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：(a)重链CDR1，其包含TGYTMH(SEQ ID NO:5)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(b)重链CDR2，其包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:6)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(c)重链CDR3，其包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:7)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(d)轻链CDR1，其包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(e)轻链CDR2，其包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；及(f)轻链CDR3，其包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在一些实施方式中，所述取代作为种系人源化过程的一部分进行。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约80％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:12具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:12具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:11具有至少约95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:12具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:11的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:11的重链可变区及包含SEQ ID NO:12的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由SEQ ID NO:11组成的重链可变区及由SEQ ID NO:12组成的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:56具有至少约80％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:57具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:56具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:57具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：与SEQ ID NO:56具有至少约95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:57具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:56的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:57的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:56的重链可变区及包含SEQ ID NO:57的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由SEQ ID NO:11组成的重链可变区及由SEQ ID NO:57组成的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少90％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:14的重链和/或包含SEQ ID NO:16的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:14的重链及包含SEQ ID NO:16的轻链。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO1特异性结合的RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO1结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59具有至少90％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:59的重链和/或包含SEQ ID NO:61的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：包含SEQ ID NO:59的重链及包含SEQ ID NO:61的轻链。

在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体h89M5-H8L5的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含(具有或不具有前导序列的)抗体h89M5-H8L5的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体h89M5-H8L5。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含呈嵌合抗体形式的抗体h89M5-H8L5的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是h89M5-H8L5。

在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体h89M5-H2L2的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含(具有或不具有前导序列的)抗体h89M5-H2L2的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO1结合剂是抗体h89M5-H2L2。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含呈嵌合抗体形式的抗体h89M5-H2L2的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO1抗体是h89M5-H2L2。

在本文所述的方法的某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体89M5的重链CDR和/或轻链CDR。制备89M5抗体的杂交瘤细胞系依照布达佩斯条约的规定，于2011年6月30日以指定的ATCC保藏编号PTA-11970保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)。

编码抗体h89M5-H8L5的重链及轻链的质粒依照布达佩斯条约的规定，于2014年8月15日以指定的ATCC保藏编号PTA-121494和PTA-121495保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-121494所编码的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-121495所编码的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-121494所编码的重链可变区及由保藏于ATCC的质粒PTA-121495所编码的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-121494所编码的重链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-121495所编码的轻链。在一些实施方式中，该RSPO1结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-121494所编码的重链及由保藏于ATCC的质粒PTA-121495所编码的轻链。

在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体h89M5-H8L5、基本由抗体h89M5-H8L5组成、或由抗体h89M5-H8L5组成。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体89M5的变异体、基本由抗体89M5的变异体组成、或由抗体89M5的变异体组成。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体h89M5-H8L5的变异体、基本由抗体h89M5-H8L5的变异体组成、或由抗体h89M5-H8L5的变异体组成。

在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体h89M5-H2L2、基本由抗体h89M5-H2L2组成、或由抗体h89M5-H2L2组成。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体89M5的变异体、基本由抗体89M5的变异体组成、或由抗体89M5的变异体组成。在某些实施方式中，RSPO1结合剂包含抗体h89M5-H2L2的变异体、基本由抗体h89M5-H2L2的变异体组成、或由抗体h89M5-H2L2的变异体组成。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂(例如抗体)包含抗体130M23的一、二、三、四、五和/或六个CDR(参见表1)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：包含SSYAMS(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)的重链CDR2、及包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂还包含：包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)的轻链CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)的轻链CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)的重链CDR2、及包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3；以及(b)包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)的轻链CDR2、及包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：(a)重链CDR1，其包含SSYAMS(SEQ ID NO:21)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(b)重链CDR2，其包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(c)重链CDR3，其包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:23)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(d)轻链CDR1，其包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(e)轻链CDR2，其包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；及(f)轻链CDR3，其包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在一些实施方式中，所述取代作为人源化过程的一部分进行。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:27具有至少约80％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:27具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:28具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:66具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：与SEQ ID NO:27具有至少约95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区及包含SEQ ID NO:28的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:27的重链可变区及包含SEQ ID NO:66的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：由SEQ ID NO:27组成的重链可变区及由SEQ ID NO:28组成的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：由SEQ ID NO:27组成的重链可变区及由SEQ ID NO:66组成的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少95％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链和/或包含SEQ ID NO:32的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链及包含SEQ ID NO:32的轻链。

在某些实施方式中，本发明提供包含与RSPO2特异性结合的RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO2结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少90％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少95％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:68具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链和/或包含SEQ ID NO:68的轻链。在一些实施方式中，该RSPO2结合剂包含：包含SEQ ID NO:30的重链及包含SEQ ID NO:68的轻链。

在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体h130M23-H1L6的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含(具有或不具有前导序列的)抗体h130M23-H1L6的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体h130M23-H1L6。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含呈嵌合抗体形式的抗体h130M23-H1L6的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是h130M23-H1L6。

在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体h130M23-H1L2的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含(具有或不具有前导序列的)抗体h130M23-H1L2的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO2结合剂是抗体h130M23-H1L2。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含呈嵌合抗体形式的抗体h130M23-H1L2的重链可变区和/或轻链可变区。在一些实施方式中，抗RSPO2抗体是h130M23-H1L2。

在本文所述的方法的某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体130M23的重链CDR和/或轻链CDR。制备130M23抗体的杂交瘤细胞系依照布达佩斯条约的规定，于2011年8月10日以指定的ATCC保藏号PTA-12021保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)。

在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体h130M23-H1L6、基本由抗体h130M23-H1L6组成、或由抗体h130M23-H1L6组成。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体130M23的变异体、基本由抗体130M23的变异体组成、或由抗体130M23的变异体组成。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体h130M23-H1L6的变异体、基本由抗体h130M23-H1L6的变异体组成、或由抗体h130M23-H1L6的变异体组成。

在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体h130M23-H1L2、基本由抗体h130M23-H1L2组成、或由抗体h130M23-H1L2组成。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体130M23的变异体、基本由抗体130M23的变异体组成、或由抗体130M23的变异体组成。在某些实施方式中，RSPO2结合剂包含抗体h130M23-H1L2的变异体、基本由抗体h130M23-H1L2的变异体组成、或由抗体h130M23-H1L2的变异体组成。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO3结合剂(例如抗体)包含抗体131R011的一、二、三、四、五和/或六个CDR(参见本文的表1)。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，其中该RSPO3结合剂包含：包含DYSIH(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:38)的重链CDR2、及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:39)或ATYFANNFDY(SEQ ID NO:40)的重链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂还包含：包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:42)或AAS(SEQ ID NO:43)的轻链CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:45)的轻链CDR3。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:42)或AAS(SEQ ID NO:43)的轻链CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:45)的轻链CDR3。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)包含DYSIH(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:38)的重链CDR2、及包含TYFANNFD(SEQ ID NO:39)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:42)的轻链CDR2、及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)的轻链CDR3。

在某些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体或双特异性抗体)的方法，其中该RSPO3结合剂包含：(a)重链CDR1，其包含DYSIH(SEQ ID NO:37)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(b)重链CDR2，其包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:38)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(c)重链CDR3，其包含TYFANNFD(SEQ ID NO:39)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO:40)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(d)轻链CDR1，其包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；(e)轻链CDR2，其包含AASNLES(SEQ ID NO:42)、AAS(SEQ ID NO:43)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体；及(f)轻链CDR3，其包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)、QQSNEDPLTF(SEQ ID NO:45)或其包含1、2、3、或4个氨基酸取代的变异体。在某些实施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在一些实施方式中，所述取代作为种系人源化过程的一部分进行。

在某些实施方式中，本发明提供与RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含：与SEQ ID NO:46具有至少约80％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:47具有至少80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：与SEQ ID NO:46具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的重链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：与SEQ ID NO:47具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：与SEQ ID NO:46具有至少约95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:47具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含SEQ ID NO:46的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:47的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含含有SEQ ID NO:46的重链可变区及含有SEQ ID NO:47的轻链可变区。在某些实施方式中，该RSPO3结合剂包含由SEQ ID NO:46组成的重链可变区及由SEQ ID NO:47组成的轻链可变区。

在某些实施方式中，本发明提供与RSPO3特异性结合的RSPO3结合剂(例如抗体)，其中该RSPO3结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49具有至少90％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51具有至少90％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：(a)与SEQ ID NO:48或SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的重链；和/或(b)与SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含SEQ ID NO:49的重链和/或包含SEQ ID NO:51的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：包含SEQ ID NO:49的重链及包含SEQ ID NO:51的轻链。

在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R010的重链可变区及轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含(具有或不具有前导序列的)抗体131R010的重链及轻链。在某些实施方式中，RSPO3结合剂是抗体131R010。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含呈嵌合抗体形式的抗体131R010的重链可变区和/或轻链可变区。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R010的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方式中，抗RSPO3抗体是131R010。

编码抗体131R010的重链及轻链的质粒依照布达佩斯条约的规定，于2013年6月18日以指定的ATCC保藏号PTA-120420和PTA-120421保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Boulevard,Manassas,VA,美国)。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链可变区及由保藏于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链可变区。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链。在一些实施方式中，该RSPO3结合剂包含：由保藏于ATCC的质粒PTA-120420所编码的重链及由保藏于ATCC的质粒PTA-120421所编码的轻链。

在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体131R010、基本由抗体131R010组成、或由抗体131R010组成。在某些实施方式中，RSPO3结合剂包含抗体130R010的变异体、基本由抗体130R010的变异体组成、或由抗体130R010的变异体组成。

本发明提供包含包括但不限于抗体的多肽的方法，所述多肽与至少一种人RSPO蛋白特异性结合或与至少一种人LGR蛋白特异性结合。在一些实施方式中，多肽与人RSPO1结合。在一些实施方式中，多肽与人RSPO2结合。在一些实施方式中，多肽与人RSPO3结合。在一些实施方式中，多肽与人LGR4结合。在一些实施方式中，多肽与人LGR5结合。在一些实施方式中，多肽与人LGR6结合。本发明还提供了包含多肽的方法，其中所述多肽包含与至少一种人RSPO蛋白特异性结合的可溶性受体。

在某些实施方式中，该多肽包含抗体89M5的一、二、三、四、五、和/或六个CDR(参见本文表1)。在某些实施方式中，该多肽包含抗体130M23的一、二、三、四、五、和/或六个CDR(参见本文表1)。在某些实施方式中，该多肽包含抗体131R010的一、二、三、四、五、和/或六个CDR(参见本文表1)。在一些实施方式中，该多肽包含每个CDR最多有四个(即0、1、2、3或4个)氨基酸取代的CDR。在某些实施方式中，该重链CDR包含于重链可变区内。在某些实施方式中，该轻链CDR包含于轻链可变区内。

在一些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的多肽的方法，其中该多肽包含：与SEQ ID NO:11和/或与SEQ ID NO:12具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:13具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:15具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:14具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:16具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:11具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:12具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:13具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:15具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:14具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:16具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:14的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO1特异性结合的多肽的方法，其中该多肽包含：与SEQ ID NO:56和/或与SEQ ID NO:57具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:58具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:60具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:59具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:61具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、或SEQ ID NO:61具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:56具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:57具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:58具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:60具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:59具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:61具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:56的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:58的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:59的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:61的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的多肽的方法，其中该多肽包含：与SEQ ID NO:27和/或与SEQ ID NO:28具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO2特异性结合的多肽的方法，其中该多肽包含：与SEQ ID NO:27和/或与SEQ ID NO:66具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:29具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:67具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:30具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:68具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、或SEQ ID NO:68具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:27具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:29具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:67具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:30具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:68具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:27的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:27的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:29的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:29的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:30的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:30的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:68的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本发明提供包含与人RSPO3特异性结合的多肽的方法，其中该多肽包含：与SEQ ID NO:46和/或与SEQ ID NO:47具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:48具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:50具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:49具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:51具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、或SEQ ID NO:51具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:46具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:47具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:48具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:50具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：与SEQ ID NO:49具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:51具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:46的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:48的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在某些实施方式中，该多肽包含：SEQ ID NO:49的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

许多蛋白(包括抗体)包含引导该蛋白运输至各处的信号序列。信号序列(又称信号肽或前导序列)位于新生多肽的N端。它们将多肽靶向内质网且所述蛋白被分类至其目的地，例如细胞器的内部空间、内部膜、细胞的外膜或经分泌至细胞外部。大部分信号序列在蛋白被运送至内质网后，通过信号肽酶从该蛋白切下。信号序列从多肽的切割通常发生于氨基酸序列的特定位点，且取决于该信号序列内的氨基酸残基。虽然通常存在一个特定的切割位点，但信号肽酶可能识别和/或使用一个以上的切割位点，产生该多肽的非同源N端。举例而言，使用信号序列内的不同的切割位点可导致具有不同N端氨基酸的多肽的表达。因此，在一些实施方式中，本文所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些实施方式中，该N端的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，多肽是基本同源的，即多肽具有相同的N端。在一些实施方式中，多肽的信号序列相较于“天然”或“亲代”信号序列包含1个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代和/或删除。在一些实施方式中，多肽的信号序列包含使得一个切割位点变成主要切割位点的氨基酸取代和/或删除，由此产生具有一种N端的基本同源的多肽。在一些实施方式中，该多肽的信号序列影响该多肽的表达程度，例如增加表达或减少表达。

在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO1结合剂(例如抗体)与包含抗体89M5的CDR的抗体竞争对RSPO1的特异性结合。在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO2结合剂(例如抗体)与包含抗体130M23的CDR的抗体竞争对RSPO2的特异性结合。在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO3结合剂(例如抗体)与包含抗体131R010的CDR的抗体竞争对RSPO3的特异性结合。

在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO1结合剂(例如抗体)所结合的RSPO1上的表位与包含抗体89M5的CDR的抗体所结合的表位相同或基本相同。在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO2结合剂(例如抗体)所结合的RSPO2上的表位与包含抗体89M5的CDR的抗体所结合的表位相同或基本相同。在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO3结合剂(例如抗体)所结合的RSPO3上的表位与包含抗体131R010的CDR的抗体所结合的表位相同或基本相同。

在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO1结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO1结合剂(例如抗体)所结合的RSPO1上的表位与包含抗体89M5的CDR的抗体所结合的RSPO1上的表位重叠。在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO2结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO2结合剂(例如抗体)所结合的RSPO2上的表位与包含抗体130M23的CDR的抗体所结合的RSPO2上的表位重叠。在某些实施方式中，本发明提供包含RSPO3结合剂(例如抗体)的方法，该RSPO3结合剂(例如抗体)所结合的RSPO3上的表位与包含抗体131R010的CDR的抗体所结合的RSPO3上的表位重叠。

在本文所述的方法的某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)与至少一种人RSPO蛋白结合且调节RSPO活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO拮抗剂且降低RSPO活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是RSPO拮抗剂且降低β-连环蛋白活性。

在某些实施方式中，本文所述的RSPO1结合剂(例如抗体或可溶性受体)与人RSPO1结合且调节RSPO1活性。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是RSPO1拮抗剂且降低RSPO1活性。在一些实施方式中，RSPO1结合剂是RSPO1拮抗剂且降低β-连环蛋白活性。在某些实施方式中，本文所述的RSPO2结合剂(例如抗体或可溶性受体)与人RSPO2结合且调节RSPO2活性。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是RSPO2拮抗剂且降低RSPO2活性。在一些实施方式中，RSPO2结合剂是RSPO2拮抗剂且降低β-连环蛋白活性。在某些实施方式中，本文所述的RSPO3结合剂(例如抗体或可溶性受体)与人RSPO3结合且调节RSPO3活性。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是RSPO3拮抗剂且降低RSPO3活性。在一些实施方式中，RSPO3结合剂是RSPO3拮抗剂且降低β-连环蛋白活性。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)是至少一种人RSPO蛋白的拮抗剂。在一些实施方式中，该RSPO结合剂是至少一种RSPO的拮抗剂且抑制RSPO活性。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、或约100％的RSPO活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制一、二、三、或四种RSPO蛋白的活性。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3、和/或RSPO4的活性。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)是至少一种人RSPO蛋白的拮抗剂。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、或约100％的RSPO信号传导。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制一、二、三、或四种RSPO蛋白的信号传导。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3、和/或RSPO4的信号传导。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)是β-连环蛋白信号传导的拮抗剂。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、或约100％的β-连环蛋白信号传导。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)抑制至少一种RSPO蛋白与受体的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂抑制人RSPO蛋白与其一种或多种受体的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制RSPO蛋白与至少一种LGR蛋白的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂抑制RSPO蛋白与LGR4、LGR5、和/或LGR6的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂与至少一种LGR蛋白的结合被抑制至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、或至少约95％。在某些实施方式中，抑制至少一种RSPO与至少一种LGR蛋白结合的RSPO结合剂进一步抑制β-连环蛋白信号传导。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)阻断至少一种RSPO与受体的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂阻断人RSPO蛋白与其一种或多种受体的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂阻断RSPO与至少一种LGR蛋白的结合。在一些实施方式中，该RSPO结合剂阻断至少一种RSPO蛋白与LGR4、LGR5、和/或LGR6的结合。在某些实施方式中，该RSPO结合剂与至少一种LGR蛋白的结合被阻断至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、或至少约95％。在某些实施方式中，阻断至少一种RSPO蛋白与至少一种LGR蛋白结合的RSPO结合剂进一步抑制β-连环蛋白信号传导。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)抑制β-连环蛋白信号传导。应该理解，抑制β-连环蛋白信号传导的RSPO结合剂在某些实施方式中可能抑制β-连环蛋白信号传导途径中一种或多种受体的信号传导，但不一定抑制所有受体的信号传导。在某些替代性实施方式中，所有人受体的β-连环蛋白信号传导可能均被抑制。在某些实施方式中，选自LGR4、LGR5、及LGR6的一种或多种受体的β-连环蛋白信号传导被抑制。在某些实施方式中，该RSPO结合剂对β-连环蛋白信号传导的抑制是指使β-连环蛋白信号传导水平减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。

在某些实施方式中，该RSPO结合剂(例如抗体或可溶性受体)抑制β-连环蛋白的活化。应当理解，抑制β-连环蛋白的活化的RSPO结合剂在某些实施方式中可能抑制β-连环蛋白被一种或多种受体的活化，但不一定抑制β-连环蛋白被所有受体的的活化。在某些替代性实施方式中，β-连环蛋白被所有人受体的活化可能均被抑制。在某些实施方式中，抑制β-连环蛋白被选自LGR4、LGR5及LGR6的一种或多种受体的活化。在某些实施方式中，该RSPO结合剂对β-连环蛋白活化的抑制是指使β-连环蛋白活化水平减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％、或至少约95％。

用于确定RSPO结合剂或LGR结合剂(或候选结合剂)是否抑制β-连环蛋白信号传导的体内和体外检测是本领域已知的。举例而言，可使用基于细胞的荧光素酶报告子检测来测量体外β-连环蛋白信号传导水平，其利用含有多份拷贝的TCF结合结构域与其下游萤火虫荧光素酶报告子基因的TCF/Luc报告子载体进行(Gazit等，1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在一种或多种Wnt(例如由转染细胞表达或由Wnt条件培养基提供的Wnt)存在时，并且在存在或不存在RSPO蛋白或RSPO条件培养基的情况下，将RSPO结合剂存在时的β-连环蛋白信号传导水平与没有RSPO结合剂存在时的信号传导水平比较。除了TCF/Luc报告子检测外，RSPO结合剂或LGR结合剂(或候选剂)对β-连环蛋白信号传导的影响可于体外或体内通过测量该试剂对β-连环蛋白调节基因的表达水平的影响来测定，如c-myc(He等，1998,Science,281：1509-12)、细胞周期素D1(Tetsu等，1999,Nature,398：422-6)和/或纤维粘连蛋白(Gradl et al.1999,Mol.Cell Biol.,19：5576-87)。在某些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂对β-连环蛋白信号传导的影响也可能通过测量该试剂对Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-连环蛋白的磷酸化状态的影响检测。

在某些实施方式中，本文所述的RSPO结合剂或LGR结合剂在小鼠、食蟹猴(cynomolgus monkey)或人体内具有至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期。在某些实施方式中，该RSPO结合剂或LGR结合剂是在小鼠、食蟹猴或人体内具有至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周、或至少约2周的循环半衰期的IgG(例如IgG1或IgG2)抗体。增加(或减少)诸如多肽及抗体等试剂的半衰期的方法是本领域已知的。例如，增加IgG抗体循环半衰期的已知方法包括导入突变至Fc区，这会增加pH 6.0时抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合。增加缺乏Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括如PEG化等技术。

在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是多克隆抗体。多克隆抗体可利用任何已知的方法制备。在一些实施方式中，多克隆抗体是通过以感兴趣的抗原(例如经纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白)通过多重皮下或腹膜内注射的方式免疫动物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驴)制备。该抗原可任选地与载剂缀合，诸如钥孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白。该抗原(不论有无载剂蛋白质)经无菌盐水稀释，且通常与佐剂(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐剂)组合以形成稳定乳液。在经过足够时间后，从经免疫的动物(通常是血液或腹水中)回收多克隆抗体。多克隆抗体可根据该领域的标准方法自血清或腹水纯化，所述方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳及透析。

在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是单克隆抗体。单克隆抗体可利用本领域技术人员已知的杂交瘤方法制备。在一些实施方式中，使用杂交瘤方法是将小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物经上述方法免疫，以诱发产生与该免疫抗原特异性结合的抗体的淋巴细胞。在一些实施方式中，淋巴细胞可在体外免疫。在一些实施方式中，该免疫抗原可为人蛋白质或其部分。在一些实施方式中，该免疫抗原可为小鼠蛋白质或其部分。

在免疫后，将淋巴细胞分离，然后利用例如聚乙二醇与适当的骨髓瘤细胞系融合。杂交瘤细胞利用本领域已知的特殊培养基筛选，未融合的淋巴细胞及骨髓瘤细胞在筛选后不会存活。产生特异性地针对选定的抗原的单克隆抗体的杂交瘤可利用多种方法鉴定，所述方法包括但不限于免疫沉淀、免疫印迹和体外结合检测(例如流式细胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫检测)。杂交瘤可利用标准方法在体外培养物中增殖或作为动物腹水肿瘤在体内增殖。单克隆抗体可根据本领域的标准方法从培养基或腹水液体纯化，所述方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳及透析。

在某些实施方式中，单克隆抗体可利用本领域技术人员已知的重组DNA技术制备。编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离，例如通过使用寡核苷酸引物的RT-PCR以特异性扩增编码该抗体的重链及轻链的基因，所述多核苷酸的序列利用标准技术测定。经分离的编码重链及轻链的多核苷酸接着被克隆至适当表达载体，所述载体在转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)、人COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞后产生单克隆抗体。

在某些其他实施方式中，重组单克隆抗体或其片段可以从表达所需物种的可变结构域或CDR的噬菌体展示文库分离。

编码单克隆抗体的多核苷酸可通过例如使用重组DNA技术修饰以产生替代性抗体。在一些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链及重链的恒定结构域可被例如人抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或以非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施方式中，所述恒定区是经截短或移除以产生所需的单克隆抗体的抗体片段。可以利用可变区的定点或高密度诱变来优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。

在本文所述的方法的一些实施方式中，针对人RSPO蛋白的单克隆抗体是人源化抗体。通常，人源化抗体是其中源自CDR的残基被源自具有所需特异性、亲和性和/或结合能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的CDR的残基取代的人免疫球蛋白，所述取代利用本领域技术人员已知的方法进行。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人物种的抗体中的对应残基取代。在一些实施方式中，人源化抗体可进一步通过Fv框架区和/或经取代的非人残基内的额外残基取代加以修饰，以精细优化抗体特异性、亲和性和/或能力。通常，人源化抗体将包含可变结构域区，所述可变结构域区包含所有或基本所有的对应非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或基本所有的框架区是那些具有人免疫球蛋白序列的框架区。在一些实施方式中，人源化抗体亦可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或恒定结构域(Fc)，通常为人免疫球蛋白的该部分。在某些实施方式中，所述人源化抗体用于治疗用途，因为当施用至人受试者时其可能减少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗体)响应。

在本文所述的方法的某些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是人抗体。人抗体可利用该领域已知的各种技术直接制备。在一些实施方式中，人抗体可从体外经免疫的永生化人B淋巴细胞产生或自经免疫的个体分离的淋巴细胞产生。在任一情况中，可以产生并分离生产针对靶抗原的抗体的细胞。在一些实施方式中，人抗体可选自噬菌体库，其中该噬菌体文库表达人抗体。作为另外的选择，噬菌体展示技术可被用来从未经免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因贮库以体外生产人抗体及抗体片段。用于制备及使用抗体噬菌体库的技术是公知的且噬菌体文库可商购。一旦抗体得到鉴定，可以使用包括但不限于链改组(chain shuffling)、结构域改组和定点诱变在内的本领域已知的亲和性成熟策略来制备高亲和性人抗体。

在一些实施方式中，人抗体可在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备。经免疫后，这些小鼠可产生整套人抗体而不产生内源性免疫球蛋白。

本发明还包含特异性识别至少一种人RSPO蛋白和/或至少一种人LGR蛋白的双特异性抗体。双特异性抗体可特异性识别及结合至少两种不同抗原或表位。所述不同表位可位于相同分子内(例如在人RSPO1上的两个表位)或位于不同分子上(例如在RSPO1上的一个表位及在LGR5上的一个表位)。在一些实施方式中，双特异性抗体相较于个别抗体或多于一种抗体的组合具有增强的效力。在一些实施方式中，双特异性抗体相较于个别抗体或多于一种抗体的组合具有减少的毒性。本领域技术人员已知的是任何结合剂(例如抗体)可能具有独特的药代动力学(PK)(例如，循环半衰期)。在一些实施方式中，双特异性抗体具有同步两种活性结合剂的PK的能力，其中所述两种个别结合剂具有不同PK特性。在一些实施方式中，双特异性抗体具有将两种结合剂(例如抗体)的作用集中于共同区域(例如特定组织)的能力。在一些实施方式中，双特异性抗体具有将两种结合剂(例如抗体)的作用集中于共同靶标(例如特定组织)的能力。在一些实施方式中，双特异性抗体具有使两种结合剂(例如抗体)的作用以靶向多于一种生物途径或功能的能力。

在一些实施方式中，双特异性抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体是人抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体是IgG1抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体是IgG2抗体。在一些实施方式中，双特异性抗体具有降低的毒性和/或副作用。在一些实施方式中，双特异性抗体相较于两种个体抗体的混合物或作为单一试剂的这些抗体具有降低的毒性和/或副作用。在一些实施方式中，双特异性抗体具有增加的治疗指数。在一些实施方式中，双特异性抗体相较于两种个体抗体的混合物或作为单一试剂的这些抗体具有增加的治疗指数。

在一些实施方式中，抗体可特异性识别及结合第一抗原靶(例如RSPO2)及第二抗原靶诸如在淋巴细胞上的效应分子(例如CD2、CD3、CD28、CTLA-4、CD80、或CD86)或Fc受体(例如CD64、CD32、或CD16)，以使细胞性防御机制集中于表达和/或产生第一抗原靶的细胞。在一些实施方式中，抗体可被用于将细胞毒性剂引导至表达特定靶抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂以及与细胞毒性剂或放射性核种螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA结合的臂。

用于制造双特异性抗体的技术是本领域技术人员已知的。在一些实施方式中，双特异性抗体包含在两个重链之间的接口部分具有氨基酸修饰的重链恒定区。在一些实施方式中，双特异性抗体可利用“突点对应孔洞(knob-into-holes)”策略产生。有时候，术语“突点(knob)”和“孔洞(hole)”由“隆突(protuberance)”和“空腔(cavity)”替代。在一些实施方式中，双特异性抗体可能包含无法在重链之间形成二硫键的变体绞链区。在一些实施方式中，修饰可能包含导致改变的静电相互作用的氨基酸变化。在一些实施方式中，修饰可能包含导致改变的疏水性/亲水性相互作用的氨基酸变化。

双特异性抗体可为完整抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。本发明也考虑高于两价的抗体。因此，在某些实施方式中，针对RSPO蛋白的抗体是多特异性的。

在某些实施方式中，本文描述的抗体(或其他多肽)可为单特异性。在某些实施方式中，抗体所包含的一个或多个抗原结合位点的每一个能够结合(或结合)RSPO蛋白上的同源性表位或LGR蛋白上的同源性表位。在某些实施方式中，本文所述的单特异性抗体的抗原结合位点能够结合(或结合)例如RSPO2及RSPO3(即发现于RSPO2及RSPO3两种蛋白上的相同表位)。

在本文所述的方法的某些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力，例如抗体片段可具有增加的组织穿透。已知用于产生抗体片段的各种技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。在一些实施方式中，抗体片段包括由胃蛋白酶消化抗体分子所产生的F(ab')2片段。在一些实施方式中，抗体片段包括通过还原F(ab')2片段的二硫键所产生的Fab片段。在其他实施方式中，抗体片段包括通过以木瓜酶及还原剂处理抗体分子所产生的Fab片段。在某些实施方式中，抗体片段经重组产生。在一些实施方式中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗体片段可在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达及分泌，从而允许大量制备这些片段。在一些实施方式中，抗体片段是自如本文讨论的抗体噬菌体分子文库分离。举例而言，可利用方法建构Fab表达文库，以允许快速有效地鉴定对RSPO蛋白或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方式中，抗体片段是线性抗体片段。在某些实施方式中，抗体片段是单特异性或双特异性的。在某些实施方式中，RSPO结合剂是scFv。多种技术可被用于制备对一种或多种人RSPO蛋白或一种或多种人LGR蛋白具有特异性的单链抗体。

另外尤其以抗体片段而言期望的是，修饰抗体以改变(例如增加或减少)其血清半衰期。这可通过例如使抗体片段中的适当区域发生突变以将补救受体(salvage receptor)结合表位纳入该抗体片段内来实现，或通过将该表位纳入肽标签内然后使该肽标签与抗体片段的任一末端或中间融合(例如通过DNA或肽合成)来实现。

异源缀合抗体也属于本发明的范围内。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。所述抗体已经被提议例如用于将免疫细胞靶向非所需的细胞。还考虑了所述异源缀合抗体可利用已知的合成蛋白质化学方法(包括那些涉及交联剂的方法)于体外制备。例如，免疫毒素可利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建。出于该目的的适当试剂的实例包括亚氨基硫醇盐及甲基-4-巯基丁亚氨酸酯。

就本发明的目的而言，应了解的是经修饰的抗体可包含任何类型的提供该抗体与靶标(即人RSPO)联结的可变区。在这方面，该可变区可包含或衍生自任何种类的可被诱导以启动体液性响应并产生针对所需抗原的免疫球蛋白的哺乳动物。因此，该经修饰的抗体的可变区可为例如人、小鼠、非人灵长动物(例如食蟹猴、猕猴等)或兔来源。在一些实施方式中，经修饰的免疫球蛋白的可变区及恒定区皆为人来源。在其他实施方式中，相容性抗体的可变区(通常源自非人来源)可经工程化或特别定制以改善该分子的结合特性或减少免疫原性。在这方面，可用于本发明的可变区可经人源化或者通过包括进引入氨基酸序列以改变。

在某些实施方式中，重链及轻链的可变结构域是通过至少部分取代一个或多个CDR和必要时部分取代框架区及序列修饰和/或改变加以改变。虽然CDR可能源自与框架区来源的抗体相同类型或甚至相同亚型的抗体，经设想CDR可能源自不同类型的抗体且通常源自不同物种的抗体。要将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一可变结构域不一定需要将所有CDR取代成供体可变区的所有CDR。相反地，可能只需要转移那些维持抗原结合位点的活性所需的残基即可。

尽管对可变区进行改变，本领域技术人员将了解，本发明的经修饰的抗体将包含其中一个或多个恒定结构域的至少一部分已被删除或以其他方式改变的抗体(例如全长抗体或其免疫反应性片段)以提供所需的生化特征，例如相较于包含原始或未经改变的恒定区的大致相同免疫原性的抗体具有增加的组织定位或增加的血清半衰期。在一些实施方式中，经修饰的抗体的恒定区将包含人恒定区。与本发明兼容的恒定区修饰包含添加、删除或取代一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸。本文所公开的经修饰的抗体可能包含对三个重链恒定结构域中的一个或多个(CH1、CH2或CH3)和/或对轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施方式中，一个或多个结构域从经修饰的抗体的恒定区被部分或全部删除。在一些实施方式中，经修饰的抗体将包含其中整个CH2结构域被移除的结构域删除构建体或变异体(ΔCH2构建体)。在一些实施方式中，该缺少的恒定区结构域由短氨基酸间隔子(例如，10个氨基酸残基)取代，以提供通常由该缺少恒定区赋予的一定分子柔性。

在一些实施方式中，经修饰的抗体经工程化以使CH3结构域与该抗体的绞链区直接融合。在其他实施方式中，肽间隔子被插入绞链区与经修饰的CH2和/或CH3结构域之间。例如，可表达其中CH2结构域被删除且剩余的CH3结构域(经修饰或未经修饰)以5至20个氨基酸间隔子与绞链区连接的构建体。添加该间隔子是为确保恒定区的调节组件维持自由及可接近，或该绞链区维持柔性。然而，应注意氨基酸间隔子在一些情况中可能证实具有免疫原性，且会引发针对该构建体的不希望的免疫响应。因此，在某些实施方式中，任何添加至构建体的间隔子将为相对非免疫原性，以维持该经修饰的抗体的所需生物性质。

在一些实施方式中，经修饰的抗体可能仅具有恒定结构域的部分缺失或者少数或甚至单个氨基酸的取代。例如，在CH2结构域的选择区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上减少Fc结合，因此增加细胞定位和/或组织穿透。类似地，可能希望的是单纯删除一个或多个恒定区结构域中控制所需调节的特定效应子功能(例如补体C1q结合)的部分。该恒定区的部分删除可增进该抗体的选定特性(血清半衰期)，同时保留其他与该目标恒定区结构域完整性有关的所需功能。另外，如上所述，所公开的抗体的恒定区可经由一个或多个氨基酸的突变或取代修饰以增强所得构建体的特性。在这方面，可能扰乱由保守性结合位点所提供的活性(例如Fc结合)，同时基本维持经修饰的抗体的构造及免疫原性特性。在某些实施方式中，经修饰的抗体包含添加一个或多个氨基酸至恒定区以增进所需特征(例如，减少或增加效应子功能)或提供更多细胞毒素或碳水化合物连接位点。

该领域已知的是恒定区介导数种效应子功能。例如，补体的C1成分与(结合至抗原的)IgG或IgM抗体的Fc区结合活化该补体系统。补体活化对于细胞病原体的调理作用和裂解很重要。补体活化还刺激炎性响应，并且与自体免疫超敏性有关。此外，抗体的Fc区可与表达Fc受体(FcR)的细胞结合。有一些Fc受体对不同类型的抗体具有特异性，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体结合引发多种重要且多变的生物响应，包括吞噬及破坏抗体包覆颗粒、清空免疫复合物、通过杀伤细胞溶解经抗体包覆的靶细胞(称为抗体依赖性细胞性细胞毒性或ADCC)、释放炎性介质、胎盘转移及控制免疫球蛋白的制备。

在某些实施方式中，经修饰的抗体具有经改变的效应子功能，所述经改变的效应子功能反过来影响所施用抗体的生物特性。例如，在一些实施方式中，恒定区结构域的删除或失活(经由点突变或其他方式)可能减少循环中经修饰的抗体与Fc受体的结合，因此增加细胞定位和/或组织穿透。在其他实施方式中，恒定区修饰增加抗体的血清半衰期。在其他实施方式中，恒定区修饰减少抗体的血清半衰期。在一些实施方式中，恒定区经修饰以消除二硫键或寡糖基团。根据本发明的恒定区修饰可利用公知的生化或分子工程技术容易地进行。

在某些实施方式中，作为抗体的RSPO结合剂或LGR结合剂不具有一种或多种效应子功能。例如在一些实施方式中，抗体不具ADCC活性和/或不具补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方式中，该抗体不与Fc受体和/或补体因子结合。在某些实施方式中，该抗体不具效应子功能。

本发明还包含与本文前述的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其抗体片段基本同源的变异体及等同物。这些可包含例如保守性取代突变，即以类似氨基酸取代一或多个氨基酸。

在某些实施方式中，本文所述的抗体是分离的。在某些实施方式中，本文所述的抗体是基本纯的。

在本发明的一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂是多肽。多肽可为包含与至少一种RSPO蛋白或至少一种LGR蛋白结合的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。在本领域中可认识到，本发明的一些氨基酸序列可以在不会对该蛋白质的结构或功能造成显著影响的情况下变化。因此，本发明还包括多肽的变异体，所述变异体显示针对人RSPO蛋白或人LGR蛋白的抗体或其片段的实质活性或包括该抗体或其片段的区域。在一些实施方式中，RSPO结合多肽或LGR结合多肽的氨基酸序列变异体包括缺失、插入、倒位(inversion)、重复和/或其他类型的取代。

在某些实施方式中，本文所述的多肽是分离的。在某些实施方式中，本文所述的多肽是基本纯的。

多肽、类似物及彼等的变异体可另经修饰以包含正常并非该多肽的一部分的额外化学部分。衍生化部分可增进或以其他方式调节该多肽的溶解性、生物半衰期和/或吸收。所述部分还可减少或消除该多肽及变异体的不希望的副作用。有关化学部分的介绍可见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22^nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London。

本文所述的多肽可通过该领域已知的任何适当方法制备。所述方法从直接蛋白质合成方法至构建编码多肽序列的DNA序列及在适当宿主中表达所述序列皆可。在一些实施方式中，DNA序列利用重组技术通过分离或合成编码感兴趣的野生型蛋白质的DNA序列来构建。任选地，该序列可通过定点诱变来诱变以提供其功能性类似物。

在一些实施方式中，编码感兴趣的多肽的DNA序列可通过化学合成利用寡核苷酸合成仪构建。寡核苷酸可根据该所需多肽的氨基酸序列设计，并选择那些将制备感兴趣重组多肽的宿主细胞所偏好的密码子。可应用标准方法来合成编码经分离的感兴趣多肽的多核苷酸序列。例如，完全氨基酸序列可被用于构建逆翻译基因。另外，可合成包含编码经分离的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，多个编码该所需多肽的部分的小型寡核苷酸可被合成然后连接。个别寡核苷酸通常包含5'或3'悬挂部分以用于互补组装。

一经组装(通过合成、定点诱变或其他方法)，该编码感兴趣的特定多肽的多核苷酸序列可被插入表达载体并可操作性连接适合将该蛋白质表达于所需宿主内的表达控制序列。适当组装可通过核苷酸测序、限制酶定位(mapping)和/或于适当宿主内表达生物活性多肽来验证。如本领域所公知，为了在宿主内获得高表达水平的经转染的基因，该基因必须与在选定的表达宿主内具功能性的转录和翻译表达控制序列可操作性连接。

在某些实施方式中，重组表达载体被用于扩增及表达针对人RSPO蛋白或人LGR蛋白的DNA编码抗体或其片段。例如，重组表达载体可为可复制的DNA构建体，其具有与适当转录和/或翻译调节组件可操作性连接的编码RSPO结合剂(诸如抗RSPO抗体或其片段)的多肽链的合成性或cDNA衍生性DNA片段，该调节组件源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。转录单位通常包含下列的组合：(1)在基因表达中具有调节作用的基因组件，例如转录启动子或增强子，(2)经转录成mRNA然后翻译成蛋白质的结构或编码序列，及(3)适当的转录及翻译启动及终止序列。调节组件可包括操作子序列以控制转录。可以额外纳入通常由复制起点赋予的在宿主内复制的能力及有助于识别转化物的选择基因。当DNA区彼此之间功能性相关时，所述DNA区是“可操作性连接”的。例如，如果信号肽的DNA(分泌前导序列)表达为参与该多肽分泌的前体，则其与多肽的DNA可操作性连接；如果启动子控制编码序列的转录，则所述启动子与该序列可操作性连接；或核糖体结合位点经定位以便允许进行翻译，则是该核糖体结合位点与编码序列可操作性连接。在一些实施方式中，适用于酵母菌表达系统的结构组件包括使宿主细胞得以胞外分泌经翻译的蛋白质的前导序列。在其他实施方式中，当重组蛋白是在没有前导或转运序列存在时表达的情况中，其可包括N端甲硫氨酸残基。其后该残基可任选地从经表达的重组蛋白切下以提供最终产物。

表达控制序列及表达载体的选择取决于宿主选择。可采用各种各样的表达宿主/载体组合。可用于真核宿主的表达载体包括例如包含源自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，例如源自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)和广泛宿主范围质粒诸如M13及其他丝状单链DNA噬菌体。

本发明的RSPO结合剂或LGR结合剂(例如多肽或抗体)可由一个或多个载体表达。例如在一些实施方式中，一个重链多肽由一个载体表达，第二重链多肽由第二载体表达，且轻链多肽由第三载体表达。在一些实施方式中，第一重链多肽及轻链多肽由一个载体表达，且第二重链多肽由第二载体表达。在一些实施方式中，二条重链多肽由一个载体表达，且轻链多肽由第二载体表达。在一些实施方式中，三条多肽由一个载体表达。因此，在一些实施方式中，第一重链多肽、第二重链多肽及轻链多肽由单一载体表达。

用于表达RSPO结合剂或LGR结合剂(或用来作为抗原的RSPO蛋白或LGR蛋白)的适当宿主细胞包括原核生物、酵母菌细胞、昆虫细胞或在适当启动子控制下的高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌(Bacillus)。高级真核细胞包括如下所述的哺乳动物来源的已建立细胞系。不含细胞的翻译系统亦可被采用。用于细菌、真菌、酵母菌及哺乳动物细胞宿主的适当克隆及表达载体是本领域技术人员已知的。

多种哺乳动物细胞培养系统可被用于表达重组多肽。可能理想的是在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为这些蛋白通常经过正确折叠、适当修饰且具生物功能性。适当哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7(猴肾来源)、L-929(小鼠成纤维细胞来源)、C127(小鼠乳房肿瘤来源)、3T3(小鼠成纤维细胞来源)、CHO(中国仓鼠卵巢来源)、HeLa(人子宫颈癌来源)、BHK(仓鼠肾成纤维细胞来源)、HEK-293(人胚胎肾来源)细胞系及其变异体。哺乳动物表达载体可包含非转录组件(诸如复制起点、与所需表达的基因相连的适当启动子及增强子，及其他5'或3'侧翼非转录序列)及5'或3'非翻译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体位点及受体位点，以及转录终止序列)。

于昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白也提供了制备正确折叠且具生物功能的蛋白质的有效方法。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白质的杆状病毒系统是本领域技术人员所公知的。

由经转化的宿主产生的蛋白质可根据任何适当方法纯化。标准方法包括色谱(例如离子交换、亲和性及尺寸柱色谱)、离心、差别溶解或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。亲和性标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感衣壳序列及谷胱甘肽-S-转移酶可被连接至该蛋白质以允许容易的通过经过适当亲和色谱柱的纯化。用于纯化免疫球蛋白的亲和性色谱可包括蛋白质A、蛋白质G及蛋白质L色谱。经分离的蛋白质可进行物理表征，使用例如蛋白水解、尺寸排除色谱(SEC)、质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)、等电聚焦(IEF)、高效液相色谱(HPLC)及X射线晶体学结晶的技术。经分离的蛋白质的纯度可利用本领域技术人员已知的技术测定，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、SEC、毛细管凝胶电泳、IEF及毛细管等电聚焦(cIEF)。

在一些实施方式中，源自将重组蛋白分泌至培养基的表达系统的上清液可利用商购蛋白质浓缩过滤器先行浓缩，例如使用Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩。在浓缩步骤之后，浓缩液可被加至适当纯化基质。在一些实施方式中，可采用阴离子交换树脂，例如具有二乙基氨基乙基(DEAE)悬挂基团的基质或基材。该基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其他常用于蛋白质纯化的基质。在一些实施方式中，可采用阳离子交换步骤。适当的阳离子交换基质包括包含磺丙基或羧甲基的各种不可溶基质。在一些实施方式中，可采用羟磷灰石介质，包括但不限于陶瓷羟磷灰石(CHT)。在某些实施方式中，可以使用应用疏水性反相HPLC介质(例如具有悬挂甲基或其他脂肪族基团的硅胶)的一个或多个反相HPLC步骤以进一步纯化重组蛋白(例如RSPO结合剂)。可以使用上述的部分或所有纯化步骤的各种组合来提供同源重组蛋白。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白诸如双特异性抗体根据本文所述的任何方法纯化。在一些实施方式中，抗RSPO双特异性抗体是利用至少一种色谱步骤分离和/或纯化。在一些实施方式中，所述至少一种色谱步骤包含亲和性色谱。在一些实施方式中，所述至少一种色谱步骤还包含阴离子交换色谱。在一些实施方式中，经分离和/或纯化的抗体产物包含至少90％的异二聚抗体。在一些实施方式中，经分离和/或纯化的抗体产物包含至少95％、96％、97％、98％或99％的异二聚抗体。在一些实施方式中，分离和/或纯化的抗体产物包含大约100％的异二聚抗体。

在一些实施方式中，于细菌培养物中生产的重组蛋白可被分离，例如通过从细胞团块初步萃取，接着进行一或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排除色谱步骤。HPLC可用于最终纯化步骤。用于表达重组蛋白的微生物细胞可通过任何方便的方法破碎，包括冷冻-解冻循环、超声、机械破碎或使用细胞裂解剂。

在某些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂可以以数种缀合形式(即免疫缀合物或放射缀合物)或非缀合形式的任一者被使用。在某些实施方式中，抗体可以非缀合形式使用以控制受试者的天然防御机制，包括补体依赖性细胞毒性及抗体依赖性细胞毒性，从而消除过度增生性细胞。

在一些实施方式中，RSPO结合剂或LGR结合剂与细胞毒性剂缀合。在一些实施方式中，该细胞毒性剂是化学治疗剂，包括但不限于甲胺喋呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红菌素(daunorubicin)或其他嵌入剂。在一些实施方式中，该细胞毒性剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素(abrin)A链、莫迪素(modeccin)A链、α-次黄嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝裂胶素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些实施方式中，细胞毒性剂是产生放射缀合物或经放射缀合的抗体的放射性同位素。多种放射性核种可用于制备经放射缀合的抗体，包括但不限于⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹³¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re及²¹²Bi。本发明还可使用抗体与一种或多种小分子毒素的缀合物，所述毒素诸如卡利奇霉素(calicheamicins)、类美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothenes)、CC1065以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。抗体与细胞毒性剂的缀合物可利用各种双官能性蛋白偶联剂制备，例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亚胺环硫丁烷(IT)、亚氨酸酯的双官能基衍生物(诸如己二亚胺二甲酯HCl)、活性酯的双官能基衍生物(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛的双官能基衍生物(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲苯酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。

IV.多核苷酸

在某些实施方式中，本发明包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码与至少一种人RSPO蛋白或至少一种人LGR蛋白特异性结合的多肽(或多肽的片段)的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”包含仅包括该多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括额外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。例如，在一些实施方式中，本发明提供包含编码抗人RSPO蛋白的抗体或编码该抗体的片段(例如包含抗原结合位点的片段)的多核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可为RNA的形式或DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA及合成DNA；并且可为双链或单链，若为单链则可为编码链或非编码(反义)链。

在某些实施方式中，多核苷酸包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68。在一些实施方式中，多核苷酸包含包含选自下列的多核苷酸序列：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70。

在某些实施方式中，多核苷酸包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与包含选自下列组成的组中的序列的多核苷酸具有至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、且在一些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％同一性：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55。本发明还提供包含与下列序列杂交的多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70。本发明还提供包含与下列序列的互补物杂交的多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70。在某些实施方式中，杂交在高度严谨度条件下发生。

在某些实施方式中，所述多核苷酸包含融合至多核苷酸的相同阅读框的成熟多肽的编码序列，该编码序列有助于例如多肽自宿主细胞的表达及分泌(例如作为分泌序列以控制源自细胞的多肽的运输的前导序列)。具有前导序列的多肽是前体蛋白，该前导序列可从宿主细胞切下以形成成熟形式的多肽。所述多核苷酸亦可编码前蛋白(proprotein)，前蛋白是成熟蛋白加上额外的5'氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白质是前蛋白，其是非活化形式的蛋白。一旦原序列被切割后，剩下即为活性成熟蛋白。

在某些实施方式中，多核苷酸包含融合至标志物序列的相同阅读框的成熟多肽的编码序列，以允许例如用于纯化该所编码的多肽。例如，标志物序列在细菌宿主的情形中可为由pQE-9载体供应的六组氨酸标签以提供对与该标志物融合的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时该标志物序列可为源自流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。在一些实施方式中，标志物序列是FLAG标签，其可与其他亲和性标签搭配使用。

本发明还涉及编码例如片段、类似物和/或衍生物的上述多核苷酸的变异体。

在某些实施方式中，本发明提供多核苷酸，所述多核苷酸包含：具有与编码包含本文所述的RSPO结合剂(例如抗体)或其片段的多肽的多核苷酸具有至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、及在一些实施方式中至少约96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸。

如本文所使用的术语，具有与参考核苷酸序列至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸意在表示该多核苷酸的核苷酸序列除了可包括该参考核苷酸序列的每100个核苷酸中最多五个点突变以外，该多核苷酸序列是与该参考序列一致的。换言之，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，在参考序列中最多5％的核苷酸可缺失或以另一核苷酸取代，或参考序列中总核苷酸数量的最多5％的核苷酸可被插入该参考序列中。这些参考序列的突变可发生在该参考核苷酸序列的5'或3'端位置或这些末端位置之间的任何位置，这些位置个自分散在参考序列的核苷酸的中或在参考序列内以一或多个连续组存在。

多核苷酸变异体可包含在编码区和/或非编码区中的改变。在一些实施方式中，多核苷酸变异体包含产生沉默取代、添加或缺失的改变，但不改变所编码的多肽的性质或活性。在一些实施方式中，多核苷酸变异体包含导致该多肽的氨基酸序列无改变的静默取代(由于遗传密码简并性)。在一些实施方式中，核苷酸变异体包含在转录水平导致表达差异(例如增加或减少表达)的核苷酸序列。多核苷酸变异体可出于多种原因制备，例如为了优化密码子在特定宿主的表达(例如将人mRNA中的密码子改变成诸如大肠杆菌等细菌宿主所偏好的密码子)。在一些实施方式中，多核苷酸变异体在序列的非编码或编码区包含至少一个沉默突变。

在一些实施方式中，制备多核苷酸变异体以调节或改变所编码的多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方式中，制备多核苷酸变异体以增加所编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体经制备以减少所编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体相较于亲代多核苷酸序列增加所编码的多肽的表达。在一些实施方式中，多核苷酸变异体相较于亲代多核苷酸序列减少所编码的多肽的表达。

在一些实施方式中，制备至少一种多核苷酸变异体(不改变所编码的多肽的氨基酸序列)以增加异多聚分子的产生。在一些实施方式中，制备至少一种多核苷酸变异体(不改变所编码的多肽的氨基酸序列)以增加双特异性抗体的产生。

在某些实施方式中，多核苷酸是分离的。在某些实施方式中，多核苷酸是基本纯的。

本发明还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。本发明还提供了包含本文所述的多核苷酸的细胞。在一些实施方式中，表达载体包含多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含表达载体，该表达载体包含该多核苷酸分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含多核苷酸分子。

V.包含RSPO结合剂的试剂盒

本发明提供包含本文所述的RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)的试剂盒，其可用于实施本文所述的方法。在某些实施方式中，试剂盒包含在一个或多个容器中的至少一种经纯化的抗至少一种人RSPO蛋白的抗体。在一些实施方式中，该试剂盒包含所有实施检测试验对于实施检测试验必要且充分的成分，包括所有对照物、使用说明及任何必要软件以供分析和呈现结果。对本领域技术人员将显而易见的是，本发明所公开的RSPO结合剂可被容易纳入本领域公知的已建立的试剂盒形式之一。

本发明还提供包含RSPO结合剂或LGR结合剂(例如抗体或可溶性受体)以及至少一种额外治疗剂的试剂盒。在某些实施方式中，第二(或更多)治疗剂是抗炎剂。在某些实施方式中，第二(或更多)治疗剂是Wnt途径抑制剂。

本发明的实施方式可通过参考以下非限制性实施例进一步定义，以下实施例描述本公开的某些抗体的详细制备及使用本公开的抗体的方法。本领域技术人员将显而易见的是，可以对材料及方法进行多种调整而不背离本发明的范围。

实施例

实施例1

肺纤维化模型

小鼠模型中的肺纤维化的诱导描述于Baran等，2011,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,45：999及Marks等，2013,J.Mol.Crit.Care Med.,187：397-405，且大致遵循该模型。简言之，6至8周龄C57BL/6N小鼠经腹膜内注射0.035U/g博来霉素或载剂(盐水)。100μl的溶解于0.9％NaCl中的博来霉素(浓度7U/ml)于第1、4、9、12、15、18、22、25、29及32天施用至小鼠。在第9、16、22、29及33天，五只代表性小鼠经安乐死。采集肺组织片段以进行分析。剩余的肺组织经福尔马林灌注并经储存以供组织学分析。

经博来霉素注射的小鼠的肺组织的组织学分析于第16天显示纤维化的证据，最大纤维化于第29天观察到。来自经博来霉素注射的小鼠的肺组织中的Rspo1、Rspo2及Rspo3的基因表达经定量RT-PCR评估。对来自在给定时间点经博来霉素注射的小鼠的肺组织中的基因表达相对于来自经盐水注射的小鼠的肺组织中的基因表达进行比较。为了进行分析，使用β-葡糖醛酸酶基因(Gusb)进行标准化。

如图1所示，来自经博来霉素注射的小鼠的肺组织中的Rspo2表达在第9天及第16天上调，随后于第22、29及33天下调。相反地，Rspo1及Rspo3的基因表达于第9天下调，且维持下调直至第33天。

在第9天及第16天检测到的Rspo2基因表达上升与炎性细胞浸润肺组织中的存在及肺纤维化的开始一致，这表明RSPO蛋白、特别是RSPO2可能参与纤维化变性的过程。

实施例2

皮肤纤维化模型

使用博来霉素诱导小鼠模型皮肤纤维化描述于Distler等，2007,Arthritis&Rheumatism,56(1)：311-322，且大致遵循该模型。简言之，6至8周龄小鼠经博来霉素皮下注射至上背部限定区域。注射部位区域的大小约1cm²，位于小鼠背部的背侧区域(横向距脊柱约2cm)。每只小鼠有两个注射部位。100μl的溶解于0.9％NaCl中的博来霉素(浓度0.5mg/ml)于第1、3、5、8及10天施用。在第2、5、8及12天，四只代表性小鼠经安乐死。采集注射部位的组织片段以进行基因表达分析，并经福尔马林固定以供组织学分析。

对于来自在给定时间点经博来霉素注射的小鼠的皮肤组织中的基因表达相对于来自天然小鼠的皮肤组织中的基因表达进行比较。为了进行分析，使用β-葡糖醛酸酶进行标准化。

如图2所示，在博来霉素注射部位的皮肤组织中的Rspo3表达在第一次注射后24小时(第2天)上调，并于第5天达到峰值。Rspo3于第8天及第12天仍维持上调，但表达水平相较于第5天下降。在此模型中，Rspo1在博来霉素注射部位的表达水平似乎不受影响，而Rspo2似乎受到轻微上调。

在第一次注射博来霉素后的24小时即观察到Rspo3上升，表示RSPO蛋白可能参与纤维化的早期事件。在皮肤纤维化模型中Rspo3基因表达的强烈上调，与在肺纤维化模型中Rspo2基因表达的诱导形成对比。这些结果表明RSPO蛋白在不同类型的纤维化的开始及进展方面可能具有组织特异性作用。

实施例3

抗RSPO抗体对于博来霉素诱导的皮肤损伤的影响

如实施例2中所述在小鼠中诱导皮肤纤维化。6至8周龄小鼠经博来霉素皮下注射至两个上背部限定区域。100μl的溶解于0.9％NaCl中的博来霉素(浓度0.5mg/ml)在第1、3、5、8及10天施用。对照抗体1B7.11、抗RSPO2抗体130M23、抗RSPO3抗体131R010、或抗RSPO2抗体130M23与抗RSPO3抗体131R010的组合于第1和第8天以25mg/kg的剂量施用。四只小鼠在对照抗体组中治疗，八只小鼠在各个抗RSPO抗体组中治疗。

第12天，在各对照抗体小鼠的注射部位(共8个注射部位中的8个)显示可触知的皮肤损伤，频率为100％。在以抗RSPO2抗体130M23治疗的小鼠中，共16个注射部位中有13个可触知皮肤损伤，频率为81％。在以抗RSPO3抗体130R010治疗的小鼠中，共16个注射部位中有6个可触知损伤，频率为38％。在以抗RSPO2抗体130M23及抗RSPO3抗体131R010的组合治疗的小鼠中，共16个注射部位中只有2个可触知损伤，频率为13％。这些结果显示于图3。

在第12天收集来自注射部位区域的组织，所述组织用于基因表达分析及组织学分析。数个基因的基因表达通过定量RT-PCR检测。这些基因包括趋化因子(C-X-C基序)配体1(Cxcl1)、内皮糖蛋白(Eng)、干扰素γ(Ifng)、白介素16(Il16)、肿瘤坏死因子(Tnf)、axin2(Axin2)、含有富亮氨酸重复的G蛋白偶合受体5(Lgr5)、R-脊椎蛋白1(Rspo1)、R-脊椎蛋白3(Rspo3)以及平滑肌肌动蛋白(Acta2)。

如图4所示，抗RSPO2抗体130M23及抗RSPO3抗体131R010的组合治疗减少与炎症有关的基因(包括干扰素γ、肿瘤坏死因子及内皮糖蛋白)的表达(在第12天评估)。此治疗亦减少Wnt途径相关基因Lgr5的基因表达，且较弱程度的减少Axin2的基因表达。第12天，以抗RSPO2抗体130M23及抗RSPO3抗体131R010作为单一试剂治疗不减少这些基因的表达。令人感兴趣的是，在施用单一剂量博来霉素及单一剂量抗RSPO抗体24小时之后，干扰素γ的基因表达在抗RSPO抗体作为单一试剂以及组合治疗中皆显著减少(图5)。

这些结果显示，单独使用的抗RSPO3抗体或其与抗RSPO2抗体的组合治疗皆具有高度抑制博来霉素诱导的皮肤损伤形成的能力。施用抗RSPO2抗体130M23与抗RSPO3抗体131R010的组合对可触知皮肤损伤频率的减少以及与Wnt信号传导及炎症有关的基因的下调表明，多种RSPO蛋白可能参与纤维化的开始及发展。这些结果支持抗RSPO拮抗剂(诸如抗RSPO抗体)可能有效治疗纤维化疾病的假设。

应了解本文所描述的实施例及实施方式仅供说明性目的，其各种修饰或变化将对本领域技术人员给予启示并应包括在本申请案的主旨与范围内。

所有本文所引用的公开内容、专利、专利申请、互联网网址以及编号/数据库序列(包括多核苷酸及多肽序列)在此以参照方式整体纳入本文以用于所有目的，其程度等同于专门且独立地指出单独的公开内容、专利、专利申请、互联网网址或编号/数据库序列各自以参照方式纳入。

本申请公开的序列为：

具有信号序列的人RSPO1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)

MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA

具有信号序列的人RSPO2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTIPCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ

具有信号序列的人RSPO3氨基酸序列(SEQ ID NO:3)

MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH

具有信号序列的人RSPO4氨基酸序列(SEQ ID NO:4)

MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP

89M5重链CDR1(SEQ ID NO:5)

TGYTMH

89M5重链CDR2(SEQ ID NO:6)

GINPNNGGTTYNQNFKG

89M5重链CDR3(SEQ ID NO:7)

KEFSDGYYFFAY

89M5轻链CDR1(SEQ ID NO:8)

KASQDVIFAVA

89M5轻链CDR2(SEQ ID NO:9)

WASTRHT

89M5轻链CDR3(SEQ ID NO:10)

QQHYSTPW

h89M5-H8L5重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:11)

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTGYTMHWVRQMPGKGLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSS

h89M5-H8L5轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:12)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVIFAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK

h89M5-H8L5具有下划线的预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:13)

MDWTWRILFLVAAATGAHSEVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTGYTMHWVRQMPGKGLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

h89M5-H8L5不具有预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:14)

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTGYTMHWVRQMPGKGLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

h89M5-H8L5具有下划线的预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:15)

MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVIFAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h89M5-H8L5不具有预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:16)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVIFAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h89M5-H8L5重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:17)

GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGCAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACTGGATACACCATGCACTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGACTGGAGTGGATGGGGGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCCACGTCACCATCTCAGCTGACAAGTCCATCAGCACTGCCTACCTGCAATGGAGCAGCCTGAAGGCTTCTGACACCGCCATGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTGACCGTCAGCTCA

h89M5-H8L5轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:18)

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCTTCCCAGGACGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGCCACACTGGGGTCCCTGACCGCTTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTCCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

h89M5-H8L5重链核苷酸序列(SEQ ID NO:19)

ATGGACTGGACCTGGAGGATACTCTTTCTCGTGGCGGCAGCCACAGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTCAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGCAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACTGGATACACCATGCACTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGACTGGAGTGGATGGGGGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCCACGTCACCATCTCAGCTGACAAGTCCATCAGCACTGCCTACCTGCAATGGAGCAGCCTGAAGGCTTCTGACACCGCCATGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTGACCGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCACTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTCCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTCGTCACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACAAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCGAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCAAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATTGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGA

h89M5-H8L5轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:20)

ATGGTGCTCCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGCTCCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGGCTTCCCAGGACGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGCCACACTGGGGTCCCTGACCGCTTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTCCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAACACCCTGACACTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTATGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCTTCCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA

130M23重链CDR1(SEQ ID NO:21)

SSYAMS

130M23重链CDR2(SEQ ID NO:22)

SISSGGSTYYPDSVKG

130M23重链CDR3(SEQ ID NO:23)

RGGDPGVYNGDYEDAMDY

130M23轻链CDR1(SEQ ID NO:24)

KASQDVSSAVA

130M23轻链CDR2(SEQ ID NO:25)

WASTRHT

130M23轻链CDR3(SEQ ID NO:26)

QQHYSTP

h130M23-H1L6 重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:27)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSS

h130M23-H1L6 轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:28)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK

h130M23-H1L6具有下划线的预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:29)

MELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

h130M23-H1L6不具有预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:30)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDPGVYNGDYEDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

h130M23-H1L6具有下划线的预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:31)MGIKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h130M23-H1L6不具有预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:32)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h130M23-H1L6重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:33)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGATCTCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCTCCTCTTATGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCATCCATTTCTAGTGGAGGTAGCACATATTATCCTGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTGGAGATCCTGGGGTCTACAATGGAGATTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGAACAACAGTCACAGTCAGCTCA

h130M23-H1L6轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:34)

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

h130M23-H1L6重链核苷酸序列(SEQ ID NO:35)

ATGGAACTGGGACTCAGATGGGTTTTCCTCGTTGCTATTCTGGAAGGAGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGATCTCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCTCCTCTTATGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCATCCATTTCTAGTGGAGGTAGCACATATTATCCTGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTGGAGATCCTGGGGTCTACAATGGAGATTACGAAGATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGAACAACAGTCACAGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

h130M23-H1L6轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:36)

ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCTTCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTCAGCAACACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGAGCTCCCCCGTCACAAAATCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA

131R010重链CDR1(SEQ ID NO:37)

DYSIH

131R010重链CDR2(SEQ ID NO:38)

YIYPSNGDSGYNQKFK

131R010重链CDR3(SEQ ID NO:39)

TYFANNFD

131R010替代性重链CDR3(SEQ ID NO:40)

ATYFANNFDY

131R010轻链CDR1(SEQ ID NO:41)

KASQSVDYDGDSYMN

131R010轻链CDR2(SEQ ID NO:42)

AASNLES

131R010替代性轻链CDR2(SEQ ID NO:43)

AAS

131R010轻链CDR3(SEQ ID NO:44)

QQSNEDPLT

131R010替代性轻链CDR3(SEQ ID NO:45)

QQSNEDPLTF

131R010重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:46)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS

131R010轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:47)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR

131R010具有下划线的预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:48)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

131R010不具有预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:49)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

131R010具有下划线的预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:50)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

131R010不具有预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:51)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

131R010重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:52)

CAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTC

131R010轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:53)

GATATCCAGATGACTCAGTCGCCCTCATCGTTGAGCGCCTCGGTCGGGGATCGCGTGACTATTACTTGTAAAGCGTCCCAGAGCGTGGACTACGACGGAGATTCCTACATGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGGAAAGGCTCCTAAACTTCTCATCTACGCAGCCTCGAATCTGGAATCAGGAGTCCCGAGCCGGTTCAGCGGATCAGGCTCCGGTACTGATTTTACCCTCACGATCTCGCCAGTGCAAGCCGAGGACTTCGCGACCTACTACTGCCAACAGTCCAACGAGGACCCGCTGACCTTCGGCGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAGCGT

131R010重链核苷酸序列(SEQ ID NO:54)

ATGAAACACTTGTGGTTCTTTCTGCTCCTTGTCGCAGCACCACGGTGGGTGCTGTCGCAAGTGCAATTGGTGCAGTCCGGAGCGGAAGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCGGTCAAAGTCTCATGCAAGGCCAGCGGATACACTTTCACCGACTACTCCATCCATTGGGTGAGGCAGGCTCCGGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTACCCGTCGAACGGAGATTCGGGGTACAATCAGAAGTTCAAGAACCGCGTGACCATGACTCGGGACACCTCAACTTCCACGGCTTATATGGAACTGAGCCGCCTGAGATCCGAGGACACTGCGGTGTACTACTGTGCCACCTACTTTGCGAACAATTTCGATTACTGGGGACAAGGAACCACGCTCACTGTCAGCTCAGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCTCCAAGTCCACCTCCGGCGGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAGGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCAAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCCGCTCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCTCTGTCTCCTGGCAAGTGATAA

131R010轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:55)

ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCGATATCCAGATGACTCAGTCGCCCTCATCGTTGAGCGCCTCGGTCGGGGATCGCGTGACTATTACTTGTAAAGCGTCCCAGAGCGTGGACTACGACGGAGATTCCTACATGAACTGGTATCAGCAAAAACCGGGAAAGGCTCCTAAACTTCTCATCTACGCAGCCTCGAATCTGGAATCAGGAGTCCCGAGCCGGTTCAGCGGATCAGGCTCCGGTACTGATTTTACCCTCACGATCTCGCCAGTGCAAGCCGAGGACTTCGCGACCTACTACTGCCAACAGTCCAACGAGGACCCGCTGACCTTCGGCGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACGGTGGCCGCTCCATCCGTGTTTATCTTTCCGCCGTCCGATGAGCAGCTCAAGTCGGGCACTGCCAGCGTGGTCTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCTAGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCGCTCCAATCCGGTAACTCGCAAGAGAGCGTGACCGAACAGGACTCAAAGGACTCGACGTACAGCCTGTCATCGACCTTGACTCTCTCAAAGGCCGACTACGAAAAGCACAAGGTCTACGCGTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGTCCTCGCCTGTGACCAAGAGCTTCAATCGCGGAGAGTGCTGA

h89M5-H2L2重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:56)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSS

h89M5-H2L2轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:57)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK

h89M5-H2L2具有下划线的预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:58)

MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

h89M5-H2L2不具有预测信号序列的重链氨基酸序列(SEQ ID NO:59)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

h89M5-H2L2具有下划线的预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:60)

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h89M5-H2L2不具有预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:61)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h89M5-H2L2重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:62)

CAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACTGGATACACCATGCACTGGGTTAGACAGGCCCCCGGACAAAGGCTGGAGTGGATGGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCTGAAGACACAGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCAGCTCA

h89M5-H2L2轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:63)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

h89M5-H2L2重链核苷酸序列(SEQ ID NO:64)

ATGGACTGGACCTGGAGGATACTCTTTCTCGTGGCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCCCAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCTGTGAAGGTTTCCTGCAAGACTTCTGGATACACCTTCACTGGATACACCATGCACTGGGTTAGACAGGCCCCCGGACAAAGGCTGGAGTGGATGGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCAAGCACAGCCTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGATCTGAAGACACAGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGATACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

h89M5-H2L2轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:65)

ATGGACATGAGGGTCCCCGCACAGCTCCTGGGGCTCCTGCTCCTCTGGCTCCGGGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGATTTTTGCTGTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCCGGCACACTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGGACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAACACCCTGACACTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA

h130M23-H1L2轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:66)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK

h130M23-H1L2具有下划线的预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:67)

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h130M23-H1L2不具有下划线的预测信号序列的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:68)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDFATYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

h130M23-H1L2轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:69)

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCGTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

h130M23-H1L2轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:70)

ATGAAATACCTCCTCCCTACAGCTGCCGCTGGACTCCTCCTCCTCGCTGCCCAGCCTGCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGTCTGCTTCCGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCCTCCCAGGATGTGTCCTCTGCTGTCGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACCAGGCACACAGGAGTCCCTTCCAGGTTCTCCGGCTCTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTCCGTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCTTGGACATTCGGACAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCTTCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTCAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCTAGAGAGGCCAAAGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGTCTGTCACAGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTCAGCAACACCCTGACACTGTCTAAAGCTGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGACTGAGCTCCCCCGTCACAAAATCCTTCAACAGGGGAGAGTGCTAA

人LGR4蛋白序列(SEQ ID NO:71)

MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALDISMNNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIHPKALSGLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWLDDNSLTEVPVHPLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSIPNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLLVILTTFASCTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFLAVFSSESAIFLLMLATVERSLSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGCFPLFHRGEYSASPLCLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKLYCNLEKEDLSENSQSSMIKHVAWLIFTNCIFFCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNPVLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMYSHLQGNLTVCDCCESFLLTKPVSCKHLIKSHSCPALAVASCQRPEGYWSDCGTQSAHSDYADEEDSFVSDSSDQVQACGRACFYQSRGFPLVRYAYNLPRVKD

人LGR5蛋白序列(SEQ ID NO:72)

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIAAVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCHVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSVKYSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSKYGASPLCLPLPFGEPSTMGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILNCPVAFLSFSSLINLTFISPEVIKFILLVVVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLRKQTYVWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSSVAFVPCL

人LGR6蛋白序列(SEQ ID NO:73)

MGRPRLTLVCQVSIIISARDLSMNNLTELQPGLFHHLRFLEELRLSGNHLSHIPGQAFSGLYSLKILMLQNNQLGGIPAEALWELPSLQSLRLDANLISLVPERSFEGLSSLRHLWLDDNALTEIPVRALNNLPALQAMTLALNRISHIPDYAFQNLTSLVVLHLHNNRIQHLGTHSFEGLHNLETLDLNYNKLQEFPVAIRTLGRLQELGFHNNNIKAIPEKAFMGNPLLQTIHFYDNPIQFVGRSAFQYLPKLHTLSLNGAMDIQEFPDLKGTTSLEILTLTRAGIRLLPSGMCQQLPRLRVLELSHNQIEELPSLHRCQKLEEIGLQHNRIWEIGADTFSQLSSLQALDLSWNAIRSIHPEAFSTLHSLVKLDLTDNQLTTLPLAGLGGLMHLKLKGNLALSQAFSKDSFPKLRILEVPYAYQCCPYGMCASFFKASGQWEAEDLHLDDEESSKRPLGLLARQAENHYDQDLDELQLEMEDSKPHPSVQCSPTPGPFKPCEYLFESWGIRLAVWAIVLLSVLCNGLVLLTVFAGGPVPLPPVKFVVGAIAGANTLTGISCGLLASVDALTFGQFSEYGARWETGLGCRATGFLAVLGSEASVLLLTLAAVQCSVSVSCVRAYGKSPSLGSVRAGVLGCLALAGLAAALPLASVGEYGASPLCLPYAPPEGQPAALGFTVALVMMNSFCFLVVAGAYIKLYCDLPRGDFEAVWDCAMVRHVAWLIFADGLLYCPVAFLSFASMLGLFPVTPEAVKSVLLVVLPLPACLNPLLYLLFNPHFRDDLRRLRPRAGDSGPLAYAAAGELEKSSCDSTQALVAFSDVDLILEASEAGRPPGLETYGFPSVTLISCQQPGAPRLEGSHCVEPEGNHFGNPQPSMDGELLLRAEGSTPAGGGLSGGGGFQPSGLAFASHV

LGR5ECD 22-564位氨基酸(SEQ ID NO:74)

GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGV

LGR5-Fc蛋白序列(SEQ ID NO:75)

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG₁Fc区(SEQ ID NO:76)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG₁Fc区(SEQ ID NO:77)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG₁Fc区(SEQ ID NO:78)

KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG₁Fc区(SEQ ID NO:79)

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人IgG₂Fc区(SEQ ID NO:80)

CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

序列表

<110> 昂考梅德药品有限公司

J·A·卡隐

<120> 纤维化疾病的治疗

<130> 2293.127PC01/PAC/MIG/BMB

<140> To be assigned

<141> 2015-09-15

<150> 62/051,026

<151> 2014-09-16

<160> 80

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有信号序列的人RSPO1氨基酸序列

<400> 1

Met Arg Leu Gly Leu Cys Val Val Ala Leu Val Leu Ser Trp Thr His

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gly Ile Lys Gly Lys Arg Gln Arg Arg Ile

20 25 30

Ser Ala Glu Gly Ser Gln Ala Cys Ala Lys Gly Cys Glu Leu Cys Ser

35 40 45

Glu Val Asn Gly Cys Leu Lys Cys Ser Pro Lys Leu Phe Ile Leu Leu

50 55 60

Glu Arg Asn Asp Ile Arg Gln Val Gly Val Cys Leu Pro Ser Cys Pro

65 70 75 80

Pro Gly Tyr Phe Asp Ala Arg Asn Pro Asp Met Asn Lys Cys Ile Lys

85 90 95

Cys Lys Ile Glu His Cys Glu Ala Cys Phe Ser His Asn Phe Cys Thr

100 105 110

Lys Cys Lys Glu Gly Leu Tyr Leu His Lys Gly Arg Cys Tyr Pro Ala

115 120 125

Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ala Ala Asn Gly Thr Met Glu Cys Ser Ser

130 135 140

Pro Ala Gln Cys Glu Met Ser Glu Trp Ser Pro Trp Gly Pro Cys Ser

145 150 155 160

Lys Lys Gln Gln Leu Cys Gly Phe Arg Arg Gly Ser Glu Glu Arg Thr

165 170 175

Arg Arg Val Leu His Ala Pro Val Gly Asp His Ala Ala Cys Ser Asp

180 185 190

Thr Lys Glu Thr Arg Arg Cys Thr Val Arg Arg Val Pro Cys Pro Glu

195 200 205

Gly Gln Lys Arg Arg Lys Gly Gly Gln Gly Arg Arg Glu Asn Ala Asn

210 215 220

Arg Asn Leu Ala Arg Lys Glu Ser Lys Glu Ala Gly Ala Gly Ser Arg

225 230 235 240

Arg Arg Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Thr Val Gly Pro

245 250 255

Leu Thr Ser Ala Gly Pro Ala

260

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有信号序列的人RSPO2氨基酸序列

<400> 2

Met Gln Phe Arg Leu Phe Ser Phe Ala Leu Ile Ile Leu Asn Cys Met

1 5 10 15

Asp Tyr Ser His Cys Gln Gly Asn Arg Trp Arg Arg Ser Lys Arg Ala

20 25 30

Ser Tyr Val Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys

35 40 45

Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg

50 55 60

Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser

65 70 75 80

Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys

85 90 95

Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys

100 105 110

Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly

130 135 140

Cys Glu Val Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn

145 150 155 160

Arg Thr Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile

165 170 175

Val Lys Lys Pro Val Lys Asp Thr Ile Pro Cys Pro Thr Ile Ala Glu

180 185 190

Ser Arg Arg Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg

195 200 205

Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu

210 215 220

Ile Glu Arg Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg

225 230 235 240

Ala Asn Gln

<210> 3

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有信号序列的人RSPO3氨基酸序列

<400> 3

Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met

1 5 10 15

Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg

20 25 30

Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys

35 40 45

Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala

50 55 60

Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys

65 70 75 80

Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr

85 90 95

Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr

100 105 110

Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn

115 120 125

Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser

130 135 140

Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr

145 150 155 160

Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val

165 170 175

Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro

180 185 190

Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys

195 200 205

Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn

210 215 220

Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser

225 230 235 240

Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys

245 250 255

Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His

260 265 270

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有信号序列的人RSPO4氨基酸序列

<400> 4

Met Arg Ala Pro Leu Cys Leu Leu Leu Leu Val Ala His Ala Val Asp

1 5 10 15

Met Leu Ala Leu Asn Arg Arg Lys Lys Gln Val Gly Thr Gly Leu Gly

20 25 30

Gly Asn Cys Thr Gly Cys Ile Ile Cys Ser Glu Glu Asn Gly Cys Ser

35 40 45

Thr Cys Gln Gln Arg Leu Phe Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gly Ile Arg

50 55 60

Gln Tyr Gly Lys Cys Leu His Asp Cys Pro Pro Gly Tyr Phe Gly Ile

65 70 75 80

Arg Gly Gln Glu Val Asn Arg Cys Lys Lys Cys Gly Ala Thr Cys Glu

85 90 95

Ser Cys Phe Ser Gln Asp Phe Cys Ile Arg Cys Lys Arg Gln Phe Tyr

100 105 110

Leu Tyr Lys Gly Lys Cys Leu Pro Thr Cys Pro Pro Gly Thr Leu Ala

115 120 125

His Gln Asn Thr Arg Glu Cys Gln Gly Glu Cys Glu Leu Gly Pro Trp

130 135 140

Gly Gly Trp Ser Pro Cys Thr His Asn Gly Lys Thr Cys Gly Ser Ala

145 150 155 160

Trp Gly Leu Glu Ser Arg Val Arg Glu Ala Gly Arg Ala Gly His Glu

165 170 175

Glu Ala Ala Thr Cys Gln Val Leu Ser Glu Ser Arg Lys Cys Pro Ile

180 185 190

Gln Arg Pro Cys Pro Gly Glu Arg Ser Pro Gly Gln Lys Lys Gly Arg

195 200 205

Lys Asp Arg Arg Pro Arg Lys Asp Arg Lys Leu Asp Arg Arg Leu Asp

210 215 220

Val Arg Pro Arg Gln Pro Gly Leu Gln Pro

225 230

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 89M5重链CDR1

<400> 5

Thr Gly Tyr Thr Met His

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 89M5重链CDR2

<400> 6

Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 89M5重链CDR3

<400> 7

Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 89M5轻链CDR1

<400> 8

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Ala Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 89M5轻链CDR2

<400> 9

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 89M5轻链CDR3

<400> 10

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

1 5

<210> 11

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H8L5 重链可变区氨基酸序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H8L5 轻链可变区氨基酸序列

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h89M5-H8L5 重链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(19)

<400> 13

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Asn Phe Lys Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 14

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的h89M5-H8L5 重链氨基酸序列

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 15

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h89M5-H8L5 轻链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(20)

<400> 15

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Ile Phe Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

100 105 110

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 16

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的h89M5-H8L5 轻链氨基酸序列

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H8L5 重链可变区核苷酸序列

<400> 17

gaagtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtcaaaaagc ccggggagtc tctgaggatc 60

tcctgcaagg gttctggata cagctttact ggatacacca tgcactgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gactggagtg gatggggggt attaatccta acaatggtgg tactacttac 180

aaccagaact tcaagggcca cgtcaccatc tcagctgaca agtccatcag cactgcctac 240

ctgcaatgga gcagcctgaa ggcttctgac accgccatgt attactgtgc aagaaaggag 300

ttctctgatg gatactactt ttttgcttac tggggccaag ggaccctggt gaccgtcagc 360

tca 363

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H8L5 轻链可变区核苷酸序列

<400> 18

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca aggcttccca ggacgtgatt tttgctgttg cctggtatca gcagaaacca 120

ggacagcctc ctaagctgct catttactgg gcatctaccc gccacactgg ggtccctgac 180

cgcttcagtg gcagcgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctccaggct 240

gaagatgtgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagca ctccttggac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 19

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H8L5 重链核苷酸序列

<400> 19

atggactgga cctggaggat actctttctc gtggcggcag ccacaggagc ccactccgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtc aaaaagcccg gggagtctct gaggatctcc 120

tgcaagggtt ctggatacag ctttactgga tacaccatgc actgggtgcg ccagatgccc 180

gggaaaggac tggagtggat ggggggtatt aatcctaaca atggtggtac tacttacaac 240

cagaacttca agggccacgt caccatctca gctgacaagt ccatcagcac tgcctacctg 300

caatggagca gcctgaaggc ttctgacacc gccatgtatt actgtgcaag aaaggagttc 360

tctgatggat actacttttt tgcttactgg ggccaaggga ccctggtgac cgtcagctca 420

gccagcacaa agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt cctccaagtc cacctccggc 480

ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaag gactacttcc ctgagcctgt gaccgtgtcc 540

tggaactctg gcgcactgac ctctggcgtg cacaccttcc cagccgtgct ccagtcctcc 600

ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtcacc gtgccttcct cctccctggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacacaaagg tggacaagcg ggtggagcct 720

aagtcctgcg acaagaccca cacctgccct ccctgccctg cccctgagct gctgggcgga 780

ccttccgtgt tcctgttccc tcctaagcct aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 840

gaagtgacat gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaactgg 900

tatgtggacg gcgtggaggt gcacaacgct aagaccaagc cgagggagga gcagtacaac 960

tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 1020

gaatacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcccgctc ccatcgagaa aaccatcagc 1080

aaggcaaagg gccagcctcg cgagcctcag gtgtacaccc tgccacccag ccgggaggag 1140

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttttaccc ttccgatatt 1200

gccgtggagt gggagtctaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320

cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1380

cagaagagcc tgtctctgtc tcctggcaag tga 1413

<210> 20

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H8L5 轻链核苷酸序列

<400> 20

atggtgctcc agacccaggt cttcatttct ctgctcctct ggatctctgg tgcctacggg 60

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120

atcaactgca aggcttccca ggacgtgatt tttgctgttg cctggtatca gcagaaacca 180

ggacagcctc ctaagctgct catttactgg gcatctaccc gccacactgg ggtccctgac 240

cgcttcagtg gcagcgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctccaggct 300

gaagatgtgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagca ctccttggac tttcggcgga 360

gggaccaagg tggagatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttccctcca 420

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480

cccagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc tccaatccgg taactcccag 540

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcaa caccctgaca 600

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctatgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660

ctgtcttccc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gctaa 705

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 130M23重链CDR1

<400> 21

Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 22

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 130M23重链CDR2

<400> 22

Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 130M23重链CDR3

<400> 23

Arg Gly Gly Asp Pro Gly Val Tyr Asn Gly Asp Tyr Glu Asp Ala Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 130M23轻链CDR1

<400> 24

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala Val Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 130M23轻链CDR2

<400> 25

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 130M23轻链CDR3

<400> 26

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro

1 5

<210> 27

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L6 重链可变区氨基酸序列

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Asp Pro Gly Val Tyr Asn Gly Asp Tyr Glu Asp Ala Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L6 轻链可变区氨基酸序列

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h130M23-H1L6 重链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(19)

<400> 29

Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp

65 70 75 80

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Pro Gly Val Tyr Asn Gly Asp Tyr Glu

115 120 125

Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

145 150 155 160

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

165 170 175

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

180 185 190

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

195 200 205

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

210 215 220

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

225 230 235 240

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

305 310 315 320

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

370 375 380

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

385 390 395 400

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

405 410 415

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

435 440 445

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 30

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的 h130M23-H1L6 重链氨基酸序列

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Asp Pro Gly Val Tyr Asn Gly Asp Tyr Glu Asp Ala Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu

210 215 220

Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 31

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h130M23-H1L6 轻链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(24)

<400> 31

Met Gly Ile Lys Met Glu Ser Gln Ile Gln Ala Phe Val Phe Val Phe

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 32

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的h130M23-H1L6 轻链氨基酸序列

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 33

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L6 重链可变区核苷酸序列

<400> 33

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggaggatc tctgcggctc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttctcc tcttatgcca tgtcttgggt ccggcaggct 120

ccagggaagg ggctggaatg ggtctcatcc atttctagtg gaggtagcac atattatcct 180

gacagcgtga agggccggtt caccatctcc agagacaacg ccaagaacag cctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacaca gctgtgtatt actgtgctag aggtggagat 300

cctggggtct acaatggaga ttacgaagat gctatggact actgggggca aggaacaaca 360

gtcacagtca gctca 375

<210> 34

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L6 轻链可变区核苷酸序列

<400> 34

gacatccaga tgacccagtc cccttcctcc ctgtctgctt ccgtcggaga cagagtcacc 60

atcacttgca aggcctccca ggatgtgtcc tctgctgtcg cttggtatca gcagaaacca 120

ggaaaagctc ctaagctcct gatctattgg gcatccacca ggcacacagg agtcccttcc 180

aggttctccg gctctggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctc cctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcaa cattatagca ctccttggac attcggacaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 35

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L6 重链核苷酸序列

<400> 35

atggaactgg gactcagatg ggttttcctc gttgctattc tggaaggagt ccagtgtgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcctg gtcaagcctg gaggatctct gcggctctcc 120

tgtgcagcct ctggattcac cttctcctct tatgccatgt cttgggtccg gcaggctcca 180

gggaaggggc tggaatgggt ctcatccatt tctagtggag gtagcacata ttatcctgac 240

agcgtgaagg gccggttcac catctccaga gacaacgcca agaacagcct gtatctgcaa 300

atgaacagcc tgagagccga ggacacagct gtgtattact gtgctagagg tggagatcct 360

ggggtctaca atggagatta cgaagatgct atggactact gggggcaagg aacaacagtc 420

acagtcagct cagccagcac aaagggccct agcgtcttcc ctctggctcc ctgcagcagg 480

agcaccagcg agagcacagc cgccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 660

ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720

acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960

agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080

aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413

<210> 36

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L6 轻链核苷酸序列

<400> 36

atgggcatca agatggagtc acagattcag gcatttgtat tcgtgtttct ctggttgtct 60

ggtgttgacg gagacatcca gatgacccag tccccttcct ccctgtctgc ttccgtcgga 120

gacagagtca ccatcacttg caaggcctcc caggatgtgt cctctgctgt cgcttggtat 180

cagcagaaac caggaaaagc tcctaagctc ctgatctatt gggcatccac caggcacaca 240

ggagtccctt ccaggttctc cggctctgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 300

tccctgcaac ctgaagattt tgcaacttac tactgtcagc aacattatag cactccttgg 360

acattcggac aagggaccaa ggtggaaatc aaaagaactg tggctgcacc ttctgtcttc 420

atcttccctc catctgatga gcagctcaaa tctggaactg cctccgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcctagaga ggccaaagtc cagtggaagg tggataacgc cctccaatcc 540

ggtaactccc aggagtctgt cacagagcag gactccaagg acagcaccta ctccctcagc 600

aacaccctga cactgtctaa agctgactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gactgagctc ccccgtcaca aaatccttca acaggggaga gtgctaa 717

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010重链CDR1

<400> 37

Asp Tyr Ser Ile His

1 5

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010重链CDR2

<400> 38

Tyr Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010重链CDR3

<400> 39

Thr Tyr Phe Ala Asn Asn Phe Asp

1 5

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 Alternative重链CDR3

<400> 40

Ala Thr Tyr Phe Ala Asn Asn Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010轻链CDR1

<400> 41

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010轻链CDR2

<400> 42

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 43

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 替代性轻链CDR2

<400> 43

Ala Ala Ser

1

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010轻链CDR3

<400> 44

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 替代性轻链CDR3

<400> 45

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe

1 5 10

<210> 46

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 重链可变区氨基酸序列

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Phe Ala Asn Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 轻链可变区氨基酸序列

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

<210> 48

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的131R010 重链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(19)

<400> 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Phe Ala Asn Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 49

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的131R010 重链氨基酸序列

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Asp Ser Gly Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Phe Ala Asn Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 50

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的131R010 轻链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(19)

<400> 50

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn

145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala

165 170 175

Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys

180 185 190

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp

195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu

210 215 220

Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 51

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的131R010 轻链氨基酸序列

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 52

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 重链可变区核苷酸序列

<400> 52

caagtgcaat tggtgcagtc cggagcggaa gtgaagaagc ctggtgcctc ggtcaaagtc 60

tcatgcaagg ccagcggata cactttcacc gactactcca tccattgggt gaggcaggct 120

ccgggccagg gcctggagtg gattgggtac atctacccgt cgaacggaga ttcggggtac 180

aatcagaagt tcaagaaccg cgtgaccatg actcgggaca cctcaacttc cacggcttat 240

atggaactga gccgcctgag atccgaggac actgcggtgt actactgtgc cacctacttt 300

gcgaacaatt tcgattactg gggacaagga accacgctca ctgtcagctc 350

<210> 53

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 轻链可变区核苷酸序列

<400> 53

gatatccaga tgactcagtc gccctcatcg ttgagcgcct cggtcgggga tcgcgtgact 60

attacttgta aagcgtccca gagcgtggac tacgacggag attcctacat gaactggtat 120

cagcaaaaac cgggaaaggc tcctaaactt ctcatctacg cagcctcgaa tctggaatca 180

ggagtcccga gccggttcag cggatcaggc tccggtactg attttaccct cacgatctcg 240

ccagtgcaag ccgaggactt cgcgacctac tactgccaac agtccaacga ggacccgctg 300

accttcggcg cagggaccaa gctggaactg aagcgt 336

<210> 54

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 重链核苷酸序列

<400> 54

atgaaacact tgtggttctt tctgctcctt gtcgcagcac cacggtgggt gctgtcgcaa 60

gtgcaattgg tgcagtccgg agcggaagtg aagaagcctg gtgcctcggt caaagtctca 120

tgcaaggcca gcggatacac tttcaccgac tactccatcc attgggtgag gcaggctccg 180

ggccagggcc tggagtggat tgggtacatc tacccgtcga acggagattc ggggtacaat 240

cagaagttca agaaccgcgt gaccatgact cgggacacct caacttccac ggcttatatg 300

gaactgagcc gcctgagatc cgaggacact gcggtgtact actgtgccac ctactttgcg 360

aacaatttcg attactgggg acaaggaacc acgctcactg tcagctcagc cagcaccaag 420

ggcccctccg tgttccctct ggccccttcc tccaagtcca cctccggcgg caccgccgct 480

ctgggctgcc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 540

gccctgacct ctggcgtgca caccttccca gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 600

ctgtcctccg tggtgaccgt gccttcctcc tccctgggca cccagaccta catctgcaac 660

gtgaaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagcggg tggagcctaa gtcctgcgac 720

aagacccaca cctgccctcc ctgccctgcc cctgagctgc tgggcggacc ttccgtgttc 780

ctgttccctc ctaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggacccctga ggtgacctgc 840

gtggtggtgg acgtgtccca cgaggatcct gaggtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc acaacgctaa gaccaagcca agggaggagc agtacaactc cacctaccgg 960

gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga atacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaggccct gcccgctccc atcgagaaaa ccatctccaa ggccaagggc 1080

cagcctcgcg agcctcaggt gtacaccctg ccacccagcc gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctaccctt ccgatatcgc cgtggagtgg 1200

gagtctaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcctgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctgtactc caagctgacc gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1320

gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1380

tctctgtctc ctggcaagtg ataa 1404

<210> 55

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 131R010 轻链核苷酸序列

<400> 55

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtccgat 60

atccagatga ctcagtcgcc ctcatcgttg agcgcctcgg tcggggatcg cgtgactatt 120

acttgtaaag cgtcccagag cgtggactac gacggagatt cctacatgaa ctggtatcag 180

caaaaaccgg gaaaggctcc taaacttctc atctacgcag cctcgaatct ggaatcagga 240

gtcccgagcc ggttcagcgg atcaggctcc ggtactgatt ttaccctcac gatctcgcca 300

gtgcaagccg aggacttcgc gacctactac tgccaacagt ccaacgagga cccgctgacc 360

ttcggcgcag ggaccaagct ggaactgaag cgtacggtgg ccgctccatc cgtgtttatc 420

tttccgccgt ccgatgagca gctcaagtcg ggcactgcca gcgtggtctg cctgcttaac 480

aatttctacc ctagggaagc caaggtgcag tggaaggtgg ataacgcgct ccaatccggt 540

aactcgcaag agagcgtgac cgaacaggac tcaaaggact cgacgtacag cctgtcatcg 600

accttgactc tctcaaaggc cgactacgaa aagcacaagg tctacgcgtg cgaagtcacc 660

catcagggac tgtcctcgcc tgtgaccaag agcttcaatc gcggagagtg ctga 714

<210> 56

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H2L2 重链可变区氨基酸序列

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 57

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H2L2 轻链可变区氨基酸序列

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 58

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h89M5-H2L2 重链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(19)

<400> 58

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145 150 155 160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn

210 215 220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg

225 230 235 240

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 59

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的h89M5-H2L2 重链氨基酸序列

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Glu Phe Ser Asp Gly Tyr Tyr Phe Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys

210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 60

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h89M5-H2L2 轻链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(22)

<400> 60

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Ile Phe Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 61

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的h89M5-H2L2 轻链氨基酸序列

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 62

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H2L2 重链可变区核苷酸序列

<400> 62

caggtccagc tcgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc tgtgaaggtt 60

tcctgcaaga cttctggata caccttcact ggatacacca tgcactgggt tagacaggcc 120

cccggacaaa ggctggagtg gatgggaggt attaatccta acaatggtgg tactacttac 180

aaccagaact tcaagggcag agtcaccatt accagggaca catccgcaag cacagcctac 240

atggagctgt ccagcctgag atctgaagac acagctgtgt attactgtgc aagaaaggag 300

ttctctgatg gatactactt ttttgcttac tggggccaag ggaccctggt caccgtcagc 360

tca 363

<210> 63

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H2L2 轻链可变区核苷酸序列

<400> 63

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60

atcacttgca aggcctccca ggatgtgatt tttgctgttg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat tacactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcaa cattatagca ctccttggac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 64

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H2L2 重链核苷酸序列

<400> 64

atggactgga cctggaggat actctttctc gtggcagcag ccacaggagc ccactcccag 60

gtccagctcg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctctgt gaaggtttcc 120

tgcaagactt ctggatacac cttcactgga tacaccatgc actgggttag acaggccccc 180

ggacaaaggc tggagtggat gggaggtatt aatcctaaca atggtggtac tacttacaac 240

cagaacttca agggcagagt caccattacc agggacacat ccgcaagcac agcctacatg 300

gagctgtcca gcctgagatc tgaagacaca gctgtgtatt actgtgcaag aaaggagttc 360

tctgatggat actacttttt tgcttactgg ggccaaggga ccctggtcac cgtcagctca 420

gccagcacaa agggccctag cgtcttccct ctggctccct gcagcaggag caccagcgag 480

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540

tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 600

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 660

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 720

aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 780

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 840

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 900

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 960

gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 1080

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380

tccctgtctc cgggtaaatg a 1401

<210> 65

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h89M5-H2L2 轻链核苷酸序列

<400> 65

atggacatga gggtccccgc acagctcctg gggctcctgc tcctctggct ccggggtgcc 60

agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt cggagacaga 120

gtcaccatca cttgcaaggc ctcccaggat gtgatttttg ctgttgcctg gtatcagcag 180

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagattaca ctctcaccat cagcagtctg 300

caacctgaag attttgcaac ttactactgt cagcaacatt atagcactcc ttggactttc 360

ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaacgg actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420

cctccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480

ttctatccca gagaggccaa agtccagtgg aaggtggata acgccctcca atccggtaac 540

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcaacacc 600

ctgacactga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660

cagggcctga gctcccccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgcta a 711

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L2 轻链可变区氨基酸序列

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 67

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有预测信号序列的h130M23-H1L2 轻链氨基酸序列

<220>

<221> 信号

<222> (1)..(22)

<400> 67

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

130 135 140

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

165 170 175

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

195 200 205

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

210 215 220

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 68

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 不具有预测信号序列的h130M23-H1L2 轻链氨基酸序列

<400> 68

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ser Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 69

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L2 轻链可变区核苷酸序列

<400> 69

gacatccaga tgacccagtc cccttcctcc ctgtctgctt ccgtcggaga cagagtcacc 60

atcacttgca aggcctccca ggatgtgtcc tctgctgtcg cttggtatca gcagaaacca 120

ggaaaagctc ctaagctcct gatctattgg gcatccacca ggcacacagg agtcccttcc 180

aggttctccg gctctggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagctc cgtgcaagct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcaa cattatagca ctccttggac attcggacaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 70

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> h130M23-H1L2 轻链核苷酸序列

<400> 70

atgaaatacc tcctccctac agctgccgct ggactcctcc tcctcgctgc ccagcctgcc 60

atggccgaca tccagatgac ccagtcccct tcctccctgt ctgcttccgt cggagacaga 120

gtcaccatca cttgcaaggc ctcccaggat gtgtcctctg ctgtcgcttg gtatcagcag 180

aaaccaggaa aagctcctaa gctcctgatc tattgggcat ccaccaggca cacaggagtc 240

ccttccaggt tctccggctc tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagctccgtg 300

caagctgaag attttgcaac ttactactgt cagcaacatt atagcactcc ttggacattc 360

ggacaaggga ccaaggtgga aatcaaaaga actgtggctg caccttctgt cttcatcttc 420

cctccatctg atgagcagct caaatctgga actgcctccg ttgtgtgcct gctgaataac 480

ttctatccta gagaggccaa agtccagtgg aaggtggata acgccctcca atccggtaac 540

tcccaggagt ctgtcacaga gcaggactcc aaggacagca cctactccct cagcaacacc 600

ctgacactgt ctaaagctga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660

cagggactga gctcccccgt cacaaaatcc ttcaacaggg gagagtgcta a 711

<210> 71

<211> 951

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人LGR4蛋白序列

<400> 71

Met Pro Gly Pro Leu Gly Leu Leu Cys Phe Leu Ala Leu Gly Leu Leu

1 5 10 15

Gly Ser Ala Gly Pro Ser Gly Ala Ala Pro Pro Leu Cys Ala Ala Pro

20 25 30

Cys Ser Cys Asp Gly Asp Arg Arg Val Asp Cys Ser Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Thr Ala Val Pro Glu Gly Leu Ser Ala Phe Thr Gln Ala Leu Asp Ile

50 55 60

Ser Met Asn Asn Ile Thr Gln Leu Pro Glu Asp Ala Phe Lys Asn Phe

65 70 75 80

Pro Phe Leu Glu Glu Leu Gln Leu Ala Gly Asn Asp Leu Ser Phe Ile

85 90 95

His Pro Lys Ala Leu Ser Gly Leu Lys Glu Leu Lys Val Leu Thr Leu

100 105 110

Gln Asn Asn Gln Leu Lys Thr Val Pro Ser Glu Ala Ile Arg Gly Leu

115 120 125

Ser Ala Leu Gln Ser Leu Arg Leu Asp Ala Asn His Ile Thr Ser Val

130 135 140

Pro Glu Asp Ser Phe Glu Gly Leu Val Gln Leu Arg His Leu Trp Leu

145 150 155 160

Asp Asp Asn Ser Leu Thr Glu Val Pro Val His Pro Leu Ser Asn Leu

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<210> 75

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LGR5-Fc蛋白序列

<400> 75

Met Asp Thr Ser Arg Leu Gly Val Leu Leu Ser Leu Pro Val Leu Leu

1 5 10 15

Gln Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ser Pro Arg Ser Gly Val Leu Leu Arg

20 25 30

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100 105 110

Leu Tyr Ser Leu Lys Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg His

115 120 125

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180 185 190

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195 200 205

Leu Ser Ser Leu Val Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser

210 215 220

Leu Gly Lys Lys Cys Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp

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Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala Ile Arg Thr Leu

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275 280 285

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660 665 670

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675 680 685

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

705 710 715 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

725 730 735

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

740 745 750

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

755 760 765

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

770 775 780

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

785 790

<210> 76

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1 Fc区

<400> 76

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 77

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1 Fc区

<400> 77

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 78

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1 Fc区

<400> 78

Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

100 105 110

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 79

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG1 Fc区

<400> 79

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 80

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人IgG2 Fc区

<400> 80

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

35 40 45

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

65 70 75 80

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种治疗或预防受试者中的纤维化疾病的方法，其包括对该受试者施用治疗有效量的人R-脊椎蛋白(RSPO)拮抗剂或LGR拮抗剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述RSPO拮抗剂或LGR拮抗剂是抗体。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体特异性结合选自由人RSPO3、人RSPO2、人RSPO1或人RSPO4组成的组中的至少一种RSPO蛋白。

4.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述抗体特异性结合RSPO3且包含：

(a)包含DYSIH(SEQ ID NO:37)的重链CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO:38)的重链CDR2和包含TYFANNFD(SEQ ID NO:39)的重链CDR3；以及包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:41)的轻链CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO:42)的轻链CDR2和包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO:44)的轻链CDR3；

(b)与SEQ ID NO:46具有至少90％序列同一性的重链可变区及与SEQ ID NO:47具有至少90％序列同一性的轻链可变区；或

(c)SEQ ID NO:46的重链可变区及SEQ ID NO:47的轻链可变区。

5.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述抗体特异性结合RSPO2且包含：

(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:21)的重链CDR1、包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:22)的重链CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO:23)的重链CDR3；以及包含KASQDVSSAVA(SEQ ID NO:24)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:25)的轻链CDR2和包含QQHYSTP(SEQ ID NO:26)的轻链CDR3；

(b)与SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性的重链可变区及与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66具有至少90％序列同一性的轻链可变区；或

(c)SEQ ID NO:27的重链可变区及SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:66的轻链可变区。

6.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述抗体特异性结合RSPO1且包含：

(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO:5)的重链CDR1、包含GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO:6)的重链CDR2和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO:7)的重链CDR3；以及包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO:8)的轻链CDR1、包含WASTRHT(SEQ ID NO:9)的轻链CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO:10)的轻链CDR3。

(b)与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:12具有至少90％序列同一性的轻链可变区；或与SEQ ID NO:56具有至少90％序列同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的轻链可变区；

(c)SEQ ID NO:11的重链可变区和SEQ ID NO:12的轻链可变区；或SEQ ID NO:56的重链可变区和SEQ ID NO:57的轻链可变区。

7.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体特异性结合至少一种人LGR蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体特异性结合选自由以下组成的组中的至少一种人LGR蛋白：LGR4、LGR5和LGR6。

9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述抗体是重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、人源化抗体、人抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或包含抗原结合位点的抗体片段。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述RSPO拮抗剂或LGR拮抗剂是包含人LGR蛋白的胞外结构域的可溶性受体，其中所述胞外结构域能够结合人RSPO蛋白。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述人LGR蛋白是LGR5。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述人LGR蛋白的胞外结构域包含人LGR5的22-564位氨基酸(SEQ ID NO:74)。

13.如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述可溶性受体包含非LGR多肽。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述非LGR多肽包含人Fc区。

15.如权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述非LGR多肽包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其包括施用至少一种额外治疗剂。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述额外治疗剂是第二抗体或抗炎剂。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述纤维化疾病选自由以下组成的组：肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、心纤维化和粘连。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述皮肤纤维化是硬皮症、全身性硬化、硬皮症样疾病、无皮肤硬化的硬皮症、瘢痕疙瘩形成或肥厚性瘢痕。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述肾纤维化是慢性肾疾病。