改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂及其制备方法与流程

本发明涉及改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂及其制备方法。本发明还公开了改进的喷雾干燥方法以获得热稳定的(热稳定)轮状病毒疫苗制剂。本发明的疫苗制剂具有改善的热稳定性、易用性、易于运输和可负担性(affordability)特征，其具有显著更好的机会在发展中国家和低收入国家的疫苗接种计划中成功采用。
背景技术：
：已经确定轮状病毒是婴儿和幼儿严重腹泻的主要原因。据估计，每年全球60万5岁以下的儿童死于轮状病毒腹泻，另有200万儿童住院。其中90％的死亡发生在发展中国家。轮状病毒具有高度传染性和抗性，无论水质和可用的卫生条件如何，世界上几乎每个儿童都有感染的风险。轮状病毒疫苗通常施用于儿童以保护他们免于轮状病毒感染。2009年6月5日，世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)建议将轮状病毒疫苗纳入所有国家免疫接种计划。轮状病毒疫苗计划(RotavirusVaccineProgram)和加速疫苗引入倡议(AcceleratedVaccineIntroductionInitiative)已经在发展中国家人群中运作以研究轮状病毒疫苗，从而协助发展中国家将轮状病毒疫苗引入常规免疫接种计划。这些伙伴关系由国际非政府组织PATH、WHO、美国疾病控制和预防中心以及全球疫苗和免疫接种联盟牵头。国际研究数据表明，目前轮状病毒疫苗对重症轮状病毒胃肠炎(rotavirusgastroenteritis，RVGE)具有85％至95％的效力。然而，当将其用在大多数轮状病毒导致死亡发生的发展中国家中，以及在获得治疗方面受到限制时，仍存在问题。一个主要原因是，这些国家既没有准备也没有严格遵守儿童的免疫接种时间表，尽管事实上世界上几乎每个儿童都将在五岁之前遭受轮状病毒感染。其主要原因是主要与当前疫苗的程序适应性(programmaticsuitability)和成本有关。程序适应性是WHO为疫苗进行资格预审所开发的一个新过程。资格预审过程包括审查生产过程和质量控制程序，审查临床数据，测试批次的一致性，以及WHO和国家监管机构对制造设施的联合访问。一旦评估完成并且如果疫苗对于购买原则上被认为是可接受的，则被认为是预先具有资格的并被公布在WHO网站上。现有的疫苗仅在特定温度下稳定有限的持续时间。本领域公知的是，疫苗必须在保持在2℃至8℃的冷藏温度下储存和运输。此外，还公知的是，疫苗必须在从冷藏中取出时立即施用。目前批准的疫苗在2℃至8℃下稳定达24至36个月。研究表明，如果一种目前WHO批准的轮状病毒疫苗Rotateq无意中被暴露或储存在高于8℃的温度下，则其最多在9℃至25℃下暴露48小时或在26℃至30℃下暴露仅12小时内保持效力。事实上，如果这种疫苗暴露于高于30℃的温度，或者如果上述时间已经过去，则该疫苗必须被丢弃，因为它已损失其效力。有限的数据表明，如果疫苗无意中暴露于低于0℃的温度，则仍保持疫苗的效力。这使得轮状病毒疫苗的严格冷链储存和运输成为必要，这在发展中地区和低收入地区是特别成问题，那里维持疫苗效力和功效所需的冷链不完善、负担过重或不存在，从而导致大量疫苗被浪费，并且在最坏的情景下危及潜在接受者的生命。据报道，浪费高达25％至50％。国际专利申请号WO2009042202公开了用于保存轮状病毒的制剂。这个发明提供了用于稳定液体和干燥制剂中的病毒的制剂和方法。特别地，提供了包含稳定轮状病毒生存力的Zn2+阳离子的制剂。疫苗接种方法包括中和胃内容物和施用该发明的疫苗制剂。美国专利申请号US20120308526公开了声波低压喷雾干燥法。该发明提供了在低压下从振动喷嘴喷雾干燥药物粉末的方法。该方法可以有效地喷雾干燥厚或粘稠的溶液或混悬液，以提供小的均匀颗粒。该发明包括通过从振动喷嘴低压喷雾的方法制备的干颗粒组合物。除了热稳定以外，从程序的角度来看疫苗合适也是重要的。疫苗应容易地制备成其最终形式，在冷链中占据小体积，并且在使用后易于处置。包括冷冻干燥疫苗以及喷雾干燥的候选疫苗之大多数现有固体形式的疫苗包装在单独的容器/组件中，并且需要注射器和小瓶以及用于重构和施用的其他复杂和昂贵的机构。这在疫苗的施用中造成困难，并且也大大增加了使冷链负担过重的疫苗足迹(footprint)。这也进而增加了运输和分配挑战、用于储存的物流，并且易于导致潜在致命的重构错误例如缓冲剂/疫苗错配、污染、错误体积施用或通过错误途径施用等。很明显，初级包装对上述程序方面有最大的影响。正在开发和测试用于疫苗施用的许多递送装置。为了使这些多样且有前景的递送装置与疫苗成功匹配，关键是设计提供最大包装灵活性的疫苗制剂。常用的稳定化小瓶冻干法产生疫苗饼，其在药物递送装置中提供最小量的包装灵活性。即使在药物递送装置(例如双室注射器和药筒装置)中进行冻干过程，然而由于装置以及加工成本，其成本也极高。对于在低收入地区广泛采用的疫苗来说，保持加工和包装疫苗的低成本至关重要。对疫苗价格有影响的另一组分是用于制剂中的稳定剂和赋形剂。从管理和安全的角度来看，使用的赋形剂和稳定剂应该既不含动物来源的物质也不含有动物组分，这也是至关重要的。事实上，在一些国家，出于文化和宗教原因也不希望如此。因此，为了解决上述问题，需要一种热稳定的、划算的疫苗，其在解决运送疫苗的物流方面将是疫苗接种计划的一个巨大优势，所述疫苗在室温下保持其效力，并且是低收入和发展中世界国家可以负担得起的。发明目的本发明的主要目的是提供改进的热稳定喷雾干燥的轮状病毒疫苗制剂。本发明的另一个目的是提供获得改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂的喷雾干燥方法。本发明的另一个目的是提供改进的喷雾干燥方法以获得改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂，所述方法使用双流体喷嘴(two-fluidnozzle)以通过所述喷嘴雾化流体。本发明的另一个目的是提供改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂，其使在升高的温度下的效力损失消除或显著最小化，持续更长的时间段，从而减少对冷藏和冷链维持的依赖。本发明的另一个目的是提供制备改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂的方法，所述制剂包含选自牛、恒河猴(rhesus)、人、绵羊(ovine)、恒河猴/人重配株(reassortant)或牛/人重配株的活轮状病毒毒株。本发明的另一个目的是提供制备改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂的方法，所述制剂包含单价或多价轮状病毒血清型混合物中的轮状病毒毒株。本发明的另一个目的是制备改进的热稳定喷雾干燥的基于粉末或颗粒的轮状病毒疫苗制剂。本发明的另一个目的是制备改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂，其具有用于通过经口递送装置填充和施用的理想性质。本发明的另一个目的是制备改进的热稳定的喷雾干燥的基于粉末或颗粒的轮状病毒疫苗制剂，并将其与掺和剂(blendingagent)共混以赋予其用于通过经口递送装置填充和施用的理想性质。本发明的另一个目的是提供划算的方法来制备可被低收入和发展中世界国家负担得起的划算的改进的热稳定轮状病毒疫苗制剂。技术实现要素：因此，本发明涉及改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂。本发明还提供了喷雾干燥方法以获得改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂。所述方法用于从含有不同血清型的液体轮状病毒疫苗中单独或组合地除去水部分(含水轮状病毒疫苗不稳定性的主要来源之一)，以形成脱水的稳定颗粒。通过使用喷雾干燥方法，用制剂成分的稳定相互作用代替去稳定化的水相互作用来完成脱水，从而提供通过划算的方法制备的更加热稳定的疫苗。改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂可包含在单价或多价轮状病毒血清型混合物中选自牛、恒河猴、人、绵羊、恒河猴/人重配株或牛/人重配株的活轮状病毒毒株。本发明涉及使用双流体喷嘴喷雾干燥方法的喷雾干燥方法的用途，其用于在适当压力、流速、干燥温度和加压雾化气体下使用雾化气体将通过喷嘴的流体雾化。所述干燥和加压气体选自氮、氩、CO2或空气、或其组合。由此获得的热稳定轮状病毒疫苗制剂具有在发展中地区和低收入地区经常遇到的高温下保留效力的潜力(所述地区存在大多数轮状病毒负担)，并且具有部分或完全消除疫苗冷链依赖性的潜力。因此，本发明公开了改进的热稳定轮状病毒疫苗制剂，其具有更强的热稳定性、减少的足迹、低成本的运输和易于使用的特征。附图说明图1描绘了当以1×剂和10×剂喷雾干燥时先导制剂(leadformulation)SD62的累积效力损失。图2描绘了DoE共混的10×批次方法加上8周的稳定性损失。图3描绘了共混和未共混的粉末样品的水分含量比较。图4描绘了DoE批次(未共混，10×轮状病毒疫苗制剂)的玻璃化转变温度。图5A描绘了在先导制剂SD64中于4℃下储存指定时间量的5种轮状病毒喷雾干燥的血清型的效力变化。图5B描绘了在先导制剂SD64中于37℃下储存指定时间量的5种轮状病毒喷雾干燥的血清型的效力变化。图6A描绘了SD66在4℃下保留效力24周。图6B描绘了SD66在37℃下保留其效力24周。图7A描绘了SD64可重复性批次的加工损失(processloss)比较。图7B描绘了SD66可重复性批次的加工损失比较。图8描绘了当在4℃和37℃下孵育时SD66可重复地保留效力16周。图9A和图9B描绘了SD64和SD66分别在45℃下保留效力2周和4周。带有举例说明和附图的本发明具体实施方式为了消除现有技术中的上述缺点，本发明提供了改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂。更具体地，本发明提供了改进的喷雾干燥方法以获得所述轮状病毒疫苗制剂。更具体地，本发明公开了通过喷雾干燥方法制备的多价热稳定的轮状病毒疫苗，以使得所述疫苗具有改善的热稳定性、易用性、易于运输和可负担性特征，其具有显著更好的机会在发展中国家和低收入国家的疫苗接种计划中采用。为了合理地实现喷雾干燥方法和制剂，其最好地支持方法产率、热稳定性和随后直至施用的对疫苗处理，已经利用了实验筛选策略的部分因子设计(fractionalfactorialdesign)以从赋形剂/稳定剂及其组合中针对其赋予单个以及多种血清型热稳定性的能力方面进行选择。所述热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂获自包含由美国食品和药物管理局(UnitedStatesFoodandDrugAdministration，USFDA)定义的“通常认为安全的”(GenerallyRegardedAsSafe，GRAS)之赋形剂和稳定剂的液体疫苗制剂(进料)，并且在喷雾干燥期间和之后以及由在喷雾干燥(进料)之前和喷雾干燥粉末重构之后获得的液态中，向包含单价和多价血清型的轮状病毒疫苗提供热稳定性。所述赋形剂和稳定剂选自-(a)糖类，例如麦芽糖糊精、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇和海藻糖；(b)二价离子蛋白质结构稳定剂如Zn(II)和Ca(II)；(c)缓冲剂，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、Tris、磷酸盐或组氨酸；(d)盐，例如氯化钠(NaCl)；(e)填充剂，例如低粒度糖球/药物球(NPS)、麦芽糖糊精、山梨糖醇、甘露糖醇、葡聚糖或乳糖；(f)活化剂，例如精氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠；(g)分散剂，例如吐温(Tween)20和吐温80；以及(h)表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)400、PEG-300、PEG-400和PEG-600、普朗尼克(Pluronic)68和F127。在一个优选的实施方案中，使用液体疫苗进料形成所述喷雾干燥疫苗的制剂，所述液体疫苗进料包含：轮状病毒血清型，1％至15％(w/v)蔗糖或海藻糖、或其组合；10mM至100mMpH缓冲组分或其组合，pH范围为6.0至8.0；0.001％至0.08％的表面活性剂，0.1mM至5mM的二价阳离子和0.5％至10％的填充剂。本发明的轮状病毒疫苗制剂包含所施用范围为每剂8.18×106至2.0×106的至少一种轮状病毒血清型，所述至少一种赋形剂的范围为1％至15％(w/v)，所述至少一种缓冲剂的范围为10mM至100mM，所述至少一种表面活性剂的范围为0.001％至0.08％且pH为6-8。选择赋形剂和稳定剂(特别是缓冲剂)以允许二价离子如Zn(II)和Ca(II)的最大溶解度，其主要是最大过程稳定性所需的并且还在轮状病毒于升高的温度下经延长的时间段的储存稳定性中起作用。还选择赋形剂及其组合以产生粉末，其特征在于玻璃化转变温度(glasstransitiontemperature，Tg)高于疫苗的预期储存温度。高于预期储存温度的制剂的Tg表明，那些制剂在低于Tg的升高温度下的储存期间将保持刚性玻璃态。本发明的稳健性(robustness)取决于由许多报告关键质量属性的分析测定对其的评价和验证。优化用于喷雾干燥方法的关键方法参数(criticalprocessparameter，CPP)以产生关键质量属性，例如现有技术中已知的影响配制的疫苗之稳定性和性能的效力、产率、水分等。因此，在本发明中，监测的对实验设计的响应包括通过基于“定量逆转录酶聚合酶链式反应”(ReverseTranscriptasePolymeraseChainReaction，RTPCR)的多价定量效力测定所测量的效力、使用KarlFisher或重量法测定水分含量、包括玻璃化转变温度、流动和固结性质的热性质以及喷雾干燥材料的目视观察。参数(如入口温度、吸气、固体含量百分比)已被评估为CPP，以研究它们对临界质量属性(如水分、产率、粒度和出口温度)的影响。为了优化CPP，在表1中示出了代表最终制剂并因此可用于过程优化的无病毒安慰剂制剂组成的一个实例。表1：用于喷雾干燥过程优化的安慰剂制剂的组成。赋形剂组成蔗糖1.765M柠檬酸钠235mM磷酸钠118mMpH6.2水qs50mL本发明还公开了使用组合了加压雾化气体和液体形式的疫苗制剂(以下称为液体疫苗制剂(进料))的“双流体喷嘴”(二元喷嘴)完成的喷雾干燥方法。所述双流体喷嘴喷雾干燥方法使用在4bar至7bar的压力范围和0℃至20℃温度范围下的加压雾化气体。用于雾化的干燥和加压气体选自纯度不小于95％(v/v)的氮、氩、CO2，或空气，且水分含量不大于2％。干燥气体处于这样的压力，其允许气体对于特定规模的操作和设备(例如BuchiB290高级模型)以25Nm3/小时至35Nm3/小时，优选30Nm3/小时的速率流动，并且在0℃至200℃的温度范围以及35℃至60℃的出口温度范围下进行。所述喷雾干燥过程还包括使用“双流体喷嘴”以通过喷嘴雾化流体，其中对于特定规模的操作和设备(例如BuchiB290高级模型)，将喷嘴孔从直径0.7mm调节至1.2mm，优选1mm，以调节在以D90约30μm为特征的粒度下的产率＞60％。此外，调整所述二元喷嘴以调节喷雾羽流(sprayplume)，从而产生与干燥气体的最大产物接触和最小损失，从而导致高产物产率。所述喷雾干燥方法使用范围为10.00g/100mL至25.00g/100mL，优选约21g/100mL的液体进料固体含量，用于最佳干燥和产率，并且对于特定的操作规模，所述液体疫苗制剂(进料)以0.3mL/分钟至10.0mL/分钟的流速进料。在表2中给出了优化的方法参数的一个实例。表2：优化的方法参数，其支持最大产率和最小水分含量。使用上述优化的参数和所述组成的喷雾干燥方法产生喷雾干燥粉末，通过防止加工中的损失，特别是通过防止设备死体积中的材料损失，提高粉末产率至＞60％。具有上述优化参数的所述加压雾化气体如氮或氩以及所述组成产生具有残留水分含量＜2％的喷雾干燥粉末，从而与使用残留水分含量＞2％的环境或除湿空气相比，其防止与水的存在相关的疫苗降解途径。重要的是避免在加工和储存过程中疫苗抗原的损失或使其保持最小以使与抗原过量填充相关的疫苗的成本最小化。因此，方法和制剂的一个关键标准是当在37℃下储存并分析至少4周时，可重复地证明可接受的效力损失[在本发明中小于Log10＝[0.5]]，从而满足世界卫生组织指示VVM30标准的最高热稳定性。为了节约加工成本，必须减少加工特定量材料所需的时间量。因此，以高10倍(10×)滴度的批次进行喷雾干燥，并用掺和剂进一步稀释回收的浓缩粉末10次，可以将加工时间减少10倍，并提高该过程的生产量。因此，在一个实施方案中，用于喷雾干燥的轮状病毒血清型包含范围为约1×104至1×109IU/mL的血清型的一种或组合，并与填充剂和/或缓冲剂共混。通过允许选择具有不同物理化学性质的掺和剂，另外的共混过程有机会改造粉末性质，以适合于在不同的易于使用的容器封闭件中精确和可重复的称重和填充。因此，在一个实施方案中，使用具有精确填充操作所需的理想粉末流动性质的掺和剂来改善喷雾干燥粉末的流动性质。可用于所述粉末改造的掺和剂的实例包括糖和糖醇，如各种大小和级别的环糊精、麦芽糖糊精、右旋糖、葡萄糖、甘露糖醇淀粉、山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇和乳糖。本发明改进的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗制剂包含具有单价和多价轮状病毒毒株的单个或多种轮状病毒血清型，其适当地包装为单剂量或多剂量。易于使用的包装的实例包括提供有疫苗粉末和用于重构的稀释剂的小袋(sachet)、双室小瓶，其中喷雾干燥的轮状病毒疫苗和具有易碎密封件的双室袋/单个容器封闭件(其可以被手指在稀释剂/缓冲室上挤压时破裂)允许固体喷雾干燥的轮状病毒疫苗和稀释剂混合。使用易于使用的包装提高了疫苗施用的方便性以及降低了多组分疫苗的开放操作/重构的风险。重构错误包括缓冲剂/疫苗错配、错误的体积、污染等。此外，它们具有减少疫苗足迹的潜力，从而减轻传统多组分初级包装选择(例如用于每个组件以及相关联的注射器和适配器的单独小瓶)所面临的运输以及分配挑战。由此获得的热稳定喷雾干燥的轮状病毒疫苗粉末也可以配制成可迅速分散的片剂剂型。在一个优选的实施方案中，液体五价进料制剂的喷雾干燥在每种轮状病毒血清型(即G1、G2、G3、G4和P1)的更高病毒滴度下进行，优选10倍量，而不会不利地影响过程中的效力。在一个特别优选的实施方案中，对于五种血清型(即G1、G2、G3、G4和P1)的混合物，以更高的病毒滴度进行液体五价进料制剂的喷雾干燥。当以1倍(1×)剂水平喷雾干燥，或以10×剂滴度水平从喷雾干燥粉末获得共混的疫苗制剂时，由此获得的热稳定喷雾干燥轮状病毒疫苗(不论血清型及其组合)在2℃-8℃下经至少24个月不超过效力损失，并且当在合适体积的含水稀释剂中重构并在2℃-8℃下孵育24小时时，也不超过Log10[0.5]的效力损失，从而促进施用用于活动设定(campaignsetting)的多剂量重构疫苗并减少浪费。还希望程序性地使粉末状疫苗容易地溶解在稀释剂中用于使用以促进在更少的时间内免疫接种更多的对象。因此，在一个优选实施方案中，将喷雾干燥粉末的全部粉末剂量溶解于水或水溶液中不超过60秒。经口施用疫苗在胃酸中存活至关重要。通过在喷雾干燥的疫苗中并入酸中和能力(AcidNeutralizationCapacity，ANC)作为缓冲剂/抗酸剂粉末，通过中和胃酸在经口施用后保护疫苗免受胃酸的损害。缓冲/抗酸组分选自HEPES、柠檬酸盐、组氨酸、碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钙、碳酸氢钾、氢氧化铝或氢氧化镁、或其组合。在另一个优选的实施方案中，所述喷雾干燥的轮状病毒粉末与缓冲剂和/或填充剂共混，从而产生范围为2.0mEq/g至5.0mEq/g粉末的酸中和能力。因此，本发明提供了热稳定、易于使用、易于运输和可负担的喷雾干燥轮状病毒疫苗，其将影响发展中国家数百万儿童的健康。本领域技术人员还将认识到该方法和制剂对其他病毒的适用性，所述其他病毒包括但不限于麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒(Epstein-Barvirus)。类似地，所述方法和制剂适用于细菌，所述细菌包括但不限于分枝杆菌属(Mycobacterium)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、利斯特氏菌属(Listeria)、大肠杆菌(E.Coli)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和弧菌属(Vibrio)。以下实施例举例说明但不限制本发明的范围。实施例1：喷雾干燥对轮状病毒血清型稳定性的作用已经制备了含有5种人-牛轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的一种示例性先导制剂SD62(表3)，对于每种血清型具有0.818×107的病毒滴度。表3：针对含有轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的轮状病毒疫苗制剂的喷雾干燥热稳定性评价DoE制剂的组成。用0.1NHCI或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。在70℃-75℃的入口温度、43℃-48℃的出口温度、吸气器在70-75％操作下进行喷雾干燥。进料速率保持在0.4-1.0mL/分钟，且进料固体为17-20.45％g/mL，喷雾气流为30Nm3/小时，雾化压力为5bar。所用的喷雾喷嘴是Buchi双流体(0.7mm)，用于收集粉末的旋风分离器是BuchiHP。在低RH(＜5％)条件下进行对所收集粉末的回收。a)研究1：使用MettlerToledo卤素天平或/和KarlFischer滴定仪测试所回收喷雾干燥粉末的瞬时水分含量，并且发现水分含量＜2.0％。b)研究2：将经回收的喷雾干燥粉末以150mg/mL的浓度用MilliQ水重构，并且与液体对照(储存在-70℃)相比测试加工损失，并且已经发现产生的损失统计学上等于零。c)研究3：将剩余的经回收喷雾干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在37℃/75％RH下在稳定室中储存至少4周。这些样品已经以150mg/mL的浓度重构并测试稳定性损失，并且已经发现在1×剂下产生不超过Log10[0.5]IU/mL的损失(图1的实心条)。实施例2：在高病毒滴度下喷雾干燥轮状病毒血清型，以及随后共混对喷雾干燥的轮状病毒粉末之效力的作用以8.18×107(10×剂)IU/ml的高病毒滴度制备含有5种人-牛轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的示例性先导制剂SD62组合物。用0.1NHCl或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。喷雾干燥和样品加工如实施例1中所述进行。a)研究1：将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂麦芽糖糊精(DE4-7)共混，以产生如实施例1所述的等于1.0×剂的病毒层(tier)。根据表4所示的组成制备填充剂和/或缓冲剂。表4：用于先导制剂SD62的填充剂和/或缓冲剂的组成喷雾干燥的粉末(10×)10％麦芽糖糊精83.97％HEPES3.84％组氨酸2.00％氯化钙0.19％b)研究2：使用MettlerToledo卤素天平或/和KarlFischer滴定仪测试所回收未共混和共混的喷雾干燥粉末的瞬时水分含量，并且发现水分含量＜2.0％。c)研究3：将浓度为150mg/mL所回收的共混喷雾干燥粉末以及液体对照(储存在-70℃)重构并测试加工损失，并且已经发现产生的损失与零没有统计学上的差异。d)研究4：将所回收的共混喷雾干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在稳定室中在37℃175％RH下储存至少4周。这些样品已经以150mg/mL的浓度重构并测试稳定性损失。已经发现所有样品在150mg中不小于2×106的10×剂下产生的损失不超过Log10[0.5]IU/mL(图1条纹条)。实施例3糖、缓冲剂和阳离子对喷雾干燥轮状病毒血清型之热稳定的作用示例组成的先导制剂SD62已经在不同浓度的成分下进一步修饰和测试，以产生示例性的五价制剂SD63、SD64、SD65和SD66(表3)。含有5种人-牛轮状病毒血清型G1、G2、G3、G4和P1的这些制剂已经以8.18×107(10×剂)IU/ml的病毒滴度制备。如实施例1中所述进行喷雾干燥。如实施例2和表4所述，将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂共混以产生等于1.0×剂的病毒层。a)研究1：将浓度为150mg/mL所回收的未共混和共混的喷雾干燥粉末以及液体对照(储存在-70℃)重构并测试加工损失，并且已经发现产生的损失与零没有统计学上的差异。e)研究2：将所回收的未共混和共混的喷雾干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在稳定室中在37℃/75％RH下储存至少4周。将这些浓度为150mg/mL的样品重构并测试稳定性损失(图2)。b)研究3：使用KarlFischer滴定仪测试所回收的未共混和共混的喷雾干燥粉末的瞬时水分含量(图3)。喷雾干燥的样品的特征在于水分含量小于2.0％，而共混样品的水分含量为0.44％至0.95％。c)研究4：使用差示扫描量热法(DifferentialScanningCalorimetry，DSC)测试20mg所回收的未共混喷雾干燥粉末的玻璃化转变温度(Tg)。喷雾干燥粉末的Tg报告为中点温度和粒度分布(图4)。d)研究5：使用MalvernMastersizer3000测定分散在合适反溶剂中的未共混对照(单独的麦芽糖糊精)和共混的粉末混合物的粒度分布(particlesizedistribution，PSD)。潜在批次的D90、D50和D10值示于表5中。表5：未共混和共混的示例性制剂的粒度分布及其与麦芽糖糊精填充剂的比较实施例4喷雾干燥参数对喷雾干燥的示例性先导制剂之粉末性质的作用。研究1：测定先导制剂的流动和固结性质：已经以8.18×107(10×剂)IU/mL的病毒滴度喷雾干燥含有5种人-牛轮状病毒血清型的示例性先导制剂SD64。用0.1NHCl或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。喷雾干燥如实施例1中所述进行。如实施例2和表4所述，将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂共混以产生等于1.0×剂的病毒层。将5.16g粉末转移到50mL量筒以测量所占据的堆体积并计算堆密度。此外，按照USP敲击(tap)量筒，直到单独组敲击的振实体积(tappedvolume)的体积差异小于2％。测量振实体积以计算振实密度。已经导出了诸如卡尔(Carr’s)/固结系数和豪斯纳比率(Hausner’sratio)的固结性质，其值示于表6中。这些值表示在USP中分类的粉末的平顺(fair)至可通过的流动特征。表6：先导制剂SD64的流动特征研究2：测定先导制剂SD64中的溶解时间：以8.18×107(10×剂)IU/ml的病毒滴度喷雾干燥含有5种人-牛轮状病毒血清型的示例性先导制剂SD64。用0.1NHCl或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。喷雾干燥如实施例1中所述进行。如实施例2和表4所述，将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂共混以产生等于1.0×剂的病毒层。在大致的低RH(＜5％)氮环境下，将共混的喷雾干燥粉末在小瓶中精确称重。向这种粉末添加水成为150mg/2mL至200mg/2mL的浓度，并手动摇动小瓶以观察溶解。将添加水至溶液中没有可见颗粒的点之间经过的时间被记录溶解时间。先导制剂SD64的溶解速率示于表7中。表7：在SD64中喷雾干燥粉末在水中的溶解速率实施例5：在示例性先导制剂SD64中轮状病毒血清型的喷雾干燥对重构后效力的作用以8.18×107(10×剂)IU/mL的病毒滴度喷雾干燥含有5种人-牛轮状病毒血清型的示例性先导制剂SD64。用0.1NHCI或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。喷雾干燥如实施例1中所述进行。如实施例2和表4所述，将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂共混以产生等于1.0×剂的病毒层。将150mg共混粉末溶解在2mL水中，并在稳定室中在37℃/75％RH和2-8℃下储存至少24小时。先导制剂在不同温度下24小时的效力损失示于表8中。表8：喷雾干燥的轮状病毒血清型在不同温度下24小时的效力损失。血清型在2-8℃下24小时的LOG损失在37℃下24小时的LOG损失G10.09±0.070.33±0.16G30.17±0.090.70±0.17实施例6：测定示例性先导制剂SD64的酸中和能力(ANC)以8.18×107(10×剂)IU/mL的病毒滴度喷雾干燥含有5种人-牛轮状病毒血清型的示例性先导制剂SD64。用0.1NHCl或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。喷雾干燥如实施例1中所述进行。如实施例2和表4所述，将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂共混以产生等于1.0×剂的病毒层。共混的喷雾干燥粉末的酸中和能力(ANC)根据USP测定。简言之，将150mg共混粉末溶解在70mL水中，并将溶液搅拌1分钟。然后向该样品溶液添加30mL1NHCl，并再次将溶液搅拌正好15分钟，并且不超过额外5分钟的时间段。用0.5NNaOH滴定过量的HCl以达到3.5的稳定(10-15秒)pH。粉末所消耗的酸的毫当量数通过下式计算：总mEq＝(30×NHCl)-VNaOH-NNaOH)。计算ANC并且结果示于表9中。表9：组合物号SD64的ANC。实施例7：测定延伸的纵向(longitudinal)热稳定性用实施例2中概述的方法制备示例性制剂SD64和SD66，并测试病毒滴度的过程和稳定性损失，并且已经发现统计学上没有加工损失并且在4℃和37℃下其效力分别保留20周(图5A和5B)至24周(图6A和6B)。实施例8：喷雾干燥方法的可重复性对示例性先导制剂SD64和SD66进行了可重复性试验，其中样品如实施例7中所述制备。比较了来自所述三个试验的加工损失的结果，即N＝1、2、3(图7A和7B)。图8中总结了在37℃下在三个批次中SD66中可重复的效力保留至少16周的结果。实施例9：在示例性喷雾干燥制剂组合物SD64和SD66中高温对轮状病毒效力的作用已经在45℃下测试了示例性先导制剂SD64和SD66的稳定性损失，以确定它们在“受控温度链”运输中的适合性，其中疫苗在免疫供应的最后一英里中在冷链外运输，潜在地将疫苗暴露于＞40℃的温度下。以8.18×107(10×剂)IU/ml的病毒滴度制备含有5种人-牛轮状病毒血清型的SD64和SD66制剂。用0.1NHCl或NaOH将进料溶液的pH调节至6.2。喷雾干燥如实施例1中所述进行。如实施例2和表4所述，将所回收的喷雾干燥粉末与填充剂和/或缓冲剂共混以产生等于1.0×剂的病毒层。使用MettlerToledo卤素天平和/或KarlFischer滴定仪测试所回收的未共混和共混的喷雾干燥粉末的瞬时水分含量(图4)。将浓度为150mg/mL所回收的未共混和共混的喷雾干燥粉末以及液体对照储存在-70℃。将所回收的未共混和共混的喷雾干燥粉末密封在玻璃小瓶中，并在稳定室中在45℃/75％RH和2-8℃下储存至少2周。浓度为150mg/mL的SD64和SD66样品已经重构并测试效力损失(图9A和图9B)，并发现表现出低于Log10＝[0.5]的效力损失。当前第1页1 2 3