哺乳动物RPE65的高异构水解酶活性突变体的制作方法

本申请要求于2014年7月31日提交的美国临时申请序列号62/031,472的优先权，该申请通过引用被明确地整体并入本文。政府支持本发明得到了美国国立卫生研究院拨款EY012231、EY018659、EY019309和来自IRRF的拨款GM104934的支持。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术：
：：视网膜色素上皮(RPE)特异性65-kDa蛋白(RPE65)对于维生素A在眼睛中的代谢和维持正常视力是必需的。它是一种关键的类视黄醇视觉循环酶，其催化全反式视黄基酯异构化为11-顺式视黄醇(11cROL)，可见色素发色团的前体。RPE65的突变与遗传性视网膜营养不良诸如Leber氏先天性黑蒙(LCA)和视网膜色素变性(RP)有关。在狗和小鼠模型的RPE65无效突变体中先前的RPE65基因替代疗法显示出对视网膜变性的有希望的效应。然而，诸如人RPE65(hRPE65)的哺乳动物RPE65具有比其他类视黄醇加工酶更低的特异性活性，因此在RPE中需要高丰度的RPE65(在牛中11μg/眼)，从而为正常的视力产生足够的11-顺式类视黄醇。对高水平的hRPE65的这种需求限制了RPE65基因疗法的功效。用于基因递送的几种载体，例如腺病毒(AD)，重组腺相关病毒(rAAV)，慢病毒，掺入纳米颗粒中的质粒和用电穿孔的质粒DNA已经被用于将完整的DNA(或报告基因)递送至眼组织。使用AD和表达GFP的慢病毒载体的进入视网膜下空间中的基因递送示出了广泛分布的GFP表达。使用表达野生型(wt)人RPE65的rAAV(rAAV-hRPE65)的最近的人类临床试验在患有RP和LCA的患者中仅显示中度的视力改善。然而，尽管有成功的基因递送，现有的RPE65基因治疗尚未成功地产生全视觉恢复。技术实现要素：本公开的发明构思包括但不限于突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分，其包括与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17中的至少一种具有至少90％同一性的氨基酸序列；具有异构水解酶活性；并且具有在170位和297位的至少一个位置的氨基酸取代。在某些非限制性实施方式中，在170位的氨基酸取代可以是Lys、Arg或His。在某些非限制性实施方式中，在297位的氨基酸取代可以是Gly或Ala。在某些非限制性实施方式中，突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分可以包括在2位、3位和26位的一个或多个氨基酸取代。在某些非限制性实施方式中，在2位的氨基酸取代可以是Tyr、Phe或His。在某些非限制性实施方式中，在3位的氨基酸取代可以是Ser、Thr或Cys在某些非限制性实施方式中，在26位的氨基酸取代可以是Val、Ala或Ile。在某些非限制性实施方式中，突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分可以包括在2位、3位、26位、170位和297位的每一个位置中的氨基酸取代，其可以是例如本文所描述的那些取代。在某些非限制性实施方式中，突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分具有比非突变RPE65蛋白更大的异构水解酶活性。在某些非限制性实施方式中，突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分具有比具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的人RPE65或具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的牛RPE65更大的异构水解酶活性。本文还公开了药物组合物，其包括设置在药学上可接受的运载体(载体，carrier)或媒介物(vehicle)中的本文所述的突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分。本文还公开了编码本文所述的突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分的核酸。在某些非限制性实施方式中，所述核酸可以被设置在载体(vector)内。在某些非限制性实施方式中，所述载体包括与所述核酸可操作地连接的启动子或增强子序列；和/或包括位于核酸的3'的终止密码子或poly-A序列。在某些非限制性实施方式中，所述载体包括与核酸可操作地连接的RPE65启动子序列；和/或包括与核酸可操作地连接的CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子序列。在某些非限制性实施方式中，所述载体选自由腺病毒、腺相关病毒(AAV)、纳米颗粒、质粒和慢病毒组成的组。本文还公开了包括本文所述的核酸的AAV载体。在某些非限制性实施方式中，所述载体包括一个或多个AAV反向末端重复(ITR)序列。在某些非限制性实施方式中，AAVITR序列包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8AAV血清型中的任一种的ITR序列，或来自其的ITR序列的混合物。在某些非限制性实施方式中，所述AAV载体包括AAV衣壳序列。在某些非限制性实施方式中，AAV衣壳序列包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少90％同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳序列。还公开了产生本公开的发明构思的AAV载体的细胞。还公开了通过向受试者施用治疗有效量的载体在需要这种治疗的哺乳动物受试者中治疗与视网膜变性相关的病症的基因治疗方法，所述载体包括编码突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分的核酸，其中所述突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分被体内表达在所述受试者的视网膜细胞中，并具有异构水解酶活性。在这种基因治疗方法中使用的所述载体、核酸和突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分可以包括本文中所描述的那些。还公开了在需要这种治疗的哺乳动物受试者中治疗与视网膜变性相关的病症的基因治疗方法，所述基因治疗方法是通过向所述受试者施用治疗有效量的至少一种本文所述的突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分，从而减轻所述受试者中与视网膜变性相关的病症。在某些非限制性实施方式中，与视网膜变性有关的病症是利伯氏先天性黑蒙(利伯氏先天性黑内障，Leber'sCongenitalAmaurosi)或视网膜色素变性(色素性视网膜炎，Retinitispigmentosa)。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所治疗的受试者是人。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所述受试者小于18岁，小于15岁，小于12岁，小于10岁，约8-10岁之间，约6-10岁之间，约4-6岁之间，约1-3岁之间或小于1岁或更小。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所述受试者可具有或处于患由RPE65突变引起的视网膜变性或视网膜营养不良的风险。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所使用的载体可以施用于受试者的一只或多只眼睛。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所使用的载体可施用于受试者的一只或多只眼睛的视网膜下腔(视网膜下间隙，subretinalspace)和/或脉络膜上腔(suprachoroidalspace)。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所使用的载体是AAV载体。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，将约1×108个或更多个AAV载体基因组施用于所述受试者的一只或多只眼睛。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，将约1×108至约1×1014个AAV载体基因组施用于所述受试者的一只或多只眼睛。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，将约1×109至约1×1013个AAV载体基因组施用于所述受试者的一只或多只眼睛。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所述载体或突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分以约10微升(μl)至约1,000μl的体积施用。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所述载体或突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分以约50μl至约800μl的体积施用。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所述载体或突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分以约100μl至约600μl的体积施用。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，所述载体或突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分以约200μl至约500μl的体积施用。在本文所述方法的某些非限制性实施方式中，将本文所述的载体或突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分递送或引入到受试者的一只或多只眼睛的视网膜色素上皮的细胞中。本公开的发明构思的某些实施方式包括但不限于突变的哺乳动物RPE65蛋白或其部分，其包括与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15和SEQIDNO:17中的至少一种具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且具有至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代导致与野生型人RPE65相比，异构水解酶活性的约2倍的提高至约6倍的提高。在某些非限制性实施方式中，所述异构水解酶活性的约2倍至约6倍的提高是通过体外异构水解酶活性测试来确定的。在某些非限制性实施方式中，所述氨基酸取代是在170位的Lys、Arg或His；和/或在297位的Gly或Ala。在某些非限制性实施方式中，所述一个或多个氨基酸取代导致与野生型人RPE65相比，异构水解酶活性的约3.2倍的提高。在某些非限制性实施方式中，所述氨基酸取代包括在170位的Lys、Arg或His取代；在297位的Gly或Ala取代；在2位的Tyr、Phe或His取代；在3位的Ser、Thr或Cys取代；以及在26位的Val、Ala或Ile取代。在某些非限制性实施方式中，所述氨基酸取代导致与野生型人RPE65相比，异构水解酶活性的约4.4倍的提高。附图说明由此在附图中示出了本公开的发明构思的若干实施例。然而，应当注意的是，附图仅示出了几个典型的实施方式，并且因此不旨在被认为是对本公开的发明构思的范围的限制。此外，在附图中，同样或相同的参考标记可以用于识别共同或类似的要素，并且并非所有这样的要素都可以这样编号。附图不一定按比例绘制，并且为了清楚和简明起见，附图的某些特征和某些视图可能以夸张的比例示出或示意性地示出。图1示出了野生型(wt)人RPE65(hRPE65)和鸡RPE65(cRPE65)的氨基酸序列比对。与hRPE65的氨基酸相同的cRPE65的氨基酸残基用点“.”表示。图2A-2R示出了：(A)野生型人RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:1)；(B)编码人RPE65的核酸序列(SEQIDNO:2)；(C)鸡RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:3)；(D)编码鸡RPE65的核酸序列(SEQIDNO:4)；(E)食蟹猴RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:5)；(F)编码食蟹猴RPE65的核酸序列(SEQIDNO:6)；(G)绿猴RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:7)；(H)编码绿猴RPE65的核酸序列(SEQIDNO:8)；(I)牛RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:9)；(J)编码牛RPE65的核酸序列(SEQIDNO:10)；(K)山羊RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:11)；(L)编码山羊RPE65的核酸序列(SEQIDNO:12)；(M)狗RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:13)；(N)编码狗RPE65的核酸序列(SEQIDNO:14)；(O)家猫RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:15)；(P)编码家猫RPE65的核酸序列(SEQIDNO:16)；(Q)大鼠RPE65的氨基酸序列(SEQIDNO:17)；以及(R)编码大鼠RPE65的核酸序列(SEQIDNO:18)。图3A-3D示出了：来自人和鸡的RPE65的表达和酶活性。将表达wthRPE65、cRPE65和红色荧光蛋白(rfp，阴性对照)的质粒分别转染到293A-LRAT细胞中。分别通过蛋白质印迹分析(A，Pc；牛RPE微粒体蛋白(2.5μg)，Nc；Rfp，Hum；hRPE65和Chk；cRPE65，各20μg)和体外异构水解酶活性测试测量hRPE65和cRPE65的表达水平和酶活性。将全反式-[3H]视黄醇(0.2μM)与来自表达rfp(B)、hRPE65(C)和cRPE65(D)的细胞的125μg总细胞蛋白孵育2小时，并通过HPLC分析所产生的类视黄醇。峰1，视黄基酯；2，11cROL。图4A-4G示出了：定点突变对RPE65的异构水解酶活性和蛋白质水平的影响。将表达wthRPE65和cRPE65以及标示的hRPE65突变体的质粒分别转染到293A-LRAT细胞中并培养48小时。(A-D)将来自细胞裂解物的等量的总蛋白(20μg)用于蛋白质印迹，该蛋白质印迹使用对于RPE65是特异性的抗体，用抗β-肌动蛋白抗体作为加载对照(A；单，B；双，C；在第一个实验组中的三重和四重突变体，以及D；单，E；在第二个实验组中的双重突变体；Pc；阳性对照(牛RPE微粒体蛋白，2.5μg)Nc；阴性对照(红色荧光蛋白)，WT；wthRPE65)。通过光密度测量法半定量RPE65水平，并通过β-肌动蛋白水平进行标准化。(F和G)用相同批次的蛋白质印迹分析的样品进行体外活性测定。通过来自3次独立测量的产生的11-[3H]-顺式视黄醇来定量异构水解酶活性，并通过它们的相对RPE65蛋白水平进行标准化。值被表示为相对活性(wthRPE65活性的％，平均值±SEM，n＝3)。在酶活性表(F和G)中，人(○)和鸡(●)残基分别表示为白色和黑色圆圈。垂直数字表示候选残基的位置。表格(F和G)的小图(panel)上方和下方的字母分别表示在所示位置的hRPE65和cRPE65氨基酸残基：此外，在第一实验组的表(F)中的“●●○●”表示hRPE65的三重突变体(T39R/N170K/Q497P)。图5A-5C示出了：嵌合的人RPE65突变体及其酶活性的示意图。(A)每个片段中的候选位点和特异性限制性酶切位点的位置在图中表示(白色条；hRPE65，灰色条；cRPE65，F1-F6；用相应的cRPE65片段替换的嵌合hRPE65)。(B)通过蛋白质印迹分析测量hRPE65、cRPE65和嵌合体的表达水平(Pc；2.5μg的牛RPE微粒体蛋白，20μg的来自Hum的总细胞蛋白；hRPE65，Chk；cRPE65和F1-F6)，并通过光密度测量法半定量RPE65的蛋白质水平(C)。酶活性通过体外异构水解酶测定来测量，并使用产生的11-[3H]-顺式视黄醇来定量，并通过它们的相对RPE65蛋白水平来标准化(C)。图6A-6B示出了：所述定点突变和用cRPE65的那些片段的片段置换对hRPE65的蛋白水平和酶活性的影响。将本研究中鉴定的定点突变体(N170K和K297G)和F1嵌合体组合以产生突变体sIMH(F1/N170K/K297G)。所鉴定的RPE65的点突变体和F1嵌合体在293A-LRAT细胞中表达。在所述转染后48小时收获细胞，并通过蛋白质印迹分析证实RPE65的蛋白水平(A)。通过体外异构水解酶测定来测量酶活性，并通过产生的11-[3H]-顺式视黄醇来定量(B)。通过产生的11-[3H]-顺式视黄醇(皮摩尔/小时)来定量异构水解酶活性并表示为wthRPE65活性％(平均值±SEM，n＝3)。图7A-7C示出了：对wthRPE65和sIMH上的催化效率的分析。制备表达hRPE65和sIMH的腺病毒。wthRPE65和sIMH在293A(无LRAT)细胞中以MOI100分别表达24小时，并且通过蛋白质印迹分析来评估其表达(A)。将脂质体中的多种浓度的底物与总细胞蛋白裂解物(125μg)应用于体外酶测定中，并且通过11cROL代的Michaelis-Menten图分别计算wthRPE65(B)和sIMH(C)的Km和Vmax。图8A-8C示出了：在RPE653D结构模型中Asn170和Lys297以及F1片段的位置。在基于牛RPE65(PDB登录号：3FSN)的晶体结构的3D模型中示出了两个鉴定的关键残基和F1片段的位置。在催化结构域内的铁结合位点由橙色虚线圆圈指示。含有棕榈基化Cys残基(Cys112)的无序区段(Phe109-Val126)由粉红色虚线表示。含有活性位点的疏水通道的入口由红色虚线圆圈表示。F1片段的位置由黄色虚线指示。Asn170和Lys297残基均位于蛋白的表面上(A和B)，并且在潜在的催化结构域中距离铁-II大于(C)。图9示出了哺乳动物RPE65序列的各种位置中的可替代的突变体取代的非限制性实例。具体实施方式在通过示例性描述、实例和结果更详细地描述本公开的发明构思的RPE65突变体和方法的各种实施方式之前，应当理解的是，本公开的发明构思不限于应用于在以下描述中阐述的方法和组合物的细节。本公开的发明构思能够具有其他实施方式或者以各种方式实践或执行。因此，本文使用的语言旨在被给予最广泛的可能范围和含义；并且所述实施方式意在是示例性的，而不是穷举的。同样，应当理解，本文中使用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的，除非另外指出是限制性的。此外，在以下的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本公开的更透彻理解。然而，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，本公开的发明构思可以在没有这些具体细节的情况下实施。在其他情况下，本领域普通技术人员公知的特征未被详细描述，以避免不必要的复杂的描述。除非本文另有定义，否则结合本公开的发明构思使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应当包括复数，复数术语应当包括单数。说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物都指示本公开发明构思所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物通过引用以其整体明确地并入本文，其程度如同每个单独的专利或出版物被具体地和单独地指明通过引用并入一样。根据本公开，可以制备和实施本文公开的所有组合物及其制备方法和应用，而无需过度的实验。虽然已经根据具体实施方式描述了本公开的发明构思的组合物和方法，但是对于本领域技术人员明显的是，变化可以被应用于所述组合物和/或方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序，而不脱离本发明构思的构思、精神和范围。对于本领域普通技术人员明显的所有这些类似的替代和修改被认为是在如本文所定义的发明构思的精神、范围和构思内。如根据本公开的方法和组合物所使用的，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：当在权利要求和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，词“一个(a)”或“一个(an)”的使用可以表示“一个”，但是它也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。权利要求中的术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确表示仅指代替代物，或者当所述替代物是相互排斥的，尽管本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。术语“至少一个”的使用将被理解为包括一个以及多于一个的任何数量，包括但不限于，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或其中包括的任何整数。术语“至少一个”根据其所连接的术语，可向上延伸至100或1000或更多；另外，100/1000的数量不被认为是限制性的，因为较高的限度也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个”的使用将被理解为包括单独的X、单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包括(compring)”(以及包括的任何形式，诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)，“具有”(以及具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“含有”(以及含有的任何形式，诸如“含有(includes)”和“含有(include)”)或“包含”(以及包含的任何形式，诸如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。如本文所使用的术语“或其组合”是指在该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，除非从上下文看是明显的，否则通常对于任何组合中的项目或术语的数目没有限制。在本申请中，术语“约”用于表示一种值，其包括组合物、用于施用组合物的方法的误差的固有变化，或存在于研究受试者之间的变化。如本文所使用的，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在很大程度或度上发生。例如，术语“基本上”是指随后描述的事件或情况在至少90％的时间，或至少95％的时间，或至少98％的时间发生。术语“药学上可接受的”是指适合施用于人和/或动物而没有与合理的益处/风险比相当的不适当的不良副作用，例如毒性、刺激和/或过敏反应的化合物和组合物。“生物活性”是指改变生物体的生理系统而不考虑活性药剂如何具有其生理作用的能力。如本文所用，“纯的”或“基本上纯的”是指目标物类是存在的主要物类(即，在摩尔基础上，其比其组合物中的任何其他目标物类更丰富)，特别是基本上纯化的级分是其中目标物类包含存在的所有大分子物类的至少约50％(基于摩尔)的组合物。通常，基本上纯的组合物将包含存在于所述组合物中的所有大分子种类的大于约80％，更特别是大于约85％，大于约90％，大于约95％或大于约99％。术语“纯的”或“基本上纯的”还指其中目标物类(例如肽化合物)为至少60％(w/w)纯，或至少70％(w/w)纯，或至少75％(w/w)纯，或至少80％(w/w)纯，或至少85％(w/w)纯，或至少90％(w/w)纯，或至少92％(w/w)纯，或至少95％(w/w)纯，或至少96％(w/w)纯，或至少97％(w/w)纯，或至少98％(w/w)纯，或至少99％(w/w)纯，或100％(w/w)纯的制品。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且应理解为是指温血动物，特别是哺乳动物。在该术语的范围和含义内的动物的非限制性实例包括狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、旧世界猴和新世界猴、非人灵长类动物和人。在人类中，18岁及以上的成年人和小于18岁的儿童都适合治疗。治疗“是指治疗性治疗。术语“治疗”是指将组合物施用于患者以用于治疗目的。“防止”是指预防性或防止性治疗措施。对受试者的施用可以在由疾病引起或与疾病相关的不良症状、病症、并发症等的发展之前进行。例如，筛选(例如，遗传筛选)可以用于鉴定本公开的发明构思的组合物和方法的候选受试者。因此，这样的受试者包括那些对于功能基因产物(蛋白质)的量不足或缺乏被筛选为阳性，或产生异常的，部分功能的或非功能的基因产物(蛋白质)的受试者。术语“治疗组合物”和“药物组合物”是指可以通过本领域已知的或本文另外考虑的任何方法给予受试者的含活性药剂的组合物，其中给予所述组合物产生如本文其他地方描述的治疗性效应。此外，本公开的发明构思的组合物可以被设计为使用本领域熟知的制剂技术提供延迟的释放、控制的释放、延长的释放和/或持续的释放。术语“有效量”是指当以本发明构思的方式使用时足以显示可检测的治疗效果，没有与合理的益处/风险比相当的过多不良副作用(例如实质性毒性，刺激和过敏反应)比率的活性药剂的量。治疗效果可以包括，例如但不限于，部分或完全恢复视力。例如，为了评估对视网膜/视觉功能测试的有益效果，测定法包括在治疗之前和之后的视网膜电图(ERGS)、瞳孔测量和行为测试(例如，具有光变化的障碍物路线)。用于患者的有效量将取决于患者的类型、患者的大小和健康、待治疗的病症的性质和严重性、施用的方法、治疗的持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、所采用的具体制剂等。因此，不可能预先指定确切的有效量。然而，对于给定情况的有效量可以由本领域普通技术人员使用基于本文提供的信息的常规实验来确定。术语“缓解”是指受试者的疾病或其症状的可检测或可测量的改善。可检测或可测量的改善包括在疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间方面的主观或客观减少、降低、抑制、遏制、限制或控制，或者在症状或潜在原因或所述疾病的后果方面的改善，或者疾病的逆转。成功的治疗结果可以导致“治疗效果”或减少、降低、抑制、遏制、限制、控制或防止疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间或疾病在受试者中的后果的“益处”。影响疾病的一种或多种根本原因或不良症状的治疗方法和用途因此被认为是有益的。恶化的减少或降低，例如稳定所述疾病，也是成功的治疗结果。因此，治疗益处不需要是疾病，或与疾病相关的任何一种、大多数或所有不良症状、并发症、后果或根本原因的完全消融或逆转。因此，当在一段短的或长的时间段(小时、天、周、月等)内存在疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间方面递增的改善诸如部分减少、降低、抑制、遏制、限制、控制或防止，或疾病的抑制或逆转(例如，稳定化)时，实现了令人满意的终点。方法或用途的有效性，例如提供潜在的治疗益处或疾病改善的治疗，可以通过各种方法来确定，例如视网膜/视觉功能测试测定法，包括视网膜电图(ERGS)、瞳孔计量和行为测试治疗等。如本文所用的术语“同源”或“％同一性”是指与相应的天然参考核酸或蛋白质具有以下程度同源性的核酸(或其片段)或蛋白质(或其片段)：其可以超过70％，或超过80％，或超过85％，或超过90％，或超过91％，或超过92％，或超过93％，或超过94％，或超过95％，或超过96％，或超过97％，或超过98％，或超过99％。例如，关于肽或多肽，当在100个氨基酸长度中的四个空位(gap)可以被引入以辅助比对时，本文所述的同源性或同一性的百分比通常计算为在两个序列的较小的序列中发现的与所比较的序列中的相同氨基酸残基比对(对齐，align)的氨基酸残基的百分比(如Dayhoff在AtlasofProteinSequenceandStructure(1972)第5卷，第124页，国家生物化学研究基金，华盛顿特区中所提出的)。在一个实施方式中，如上所述的百分比同源性计算为在两个序列的较小的序列中发现的也可以在这两个序列的较大的序列中找到的组分的百分比(具有空位的引入)，其中组分被定义为四个连续氨基酸的序列。还包括为基本上同源的任何蛋白质产物，其可以通过与天然蛋白质产物的抗体的交叉反应性来分离。可以通过比较比对时的所述序列来确定序列同一性或同源性，以使得重叠和同一性最大化，同时使序列空位最小化。特别地，可以使用多种数学算法中的任何一种来确定序列同一性。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是如在Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873-5877中修改的Karlin&Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268的算法。在一个实施方式中，“％同一性”代表在具有相同活性的蛋白质的两个序列或编码相似蛋白质的两个序列中的相应位置处相同的氨基酸或核苷酸的数目。例如，当相应位置的氨基酸中的95个相同时，各自具有100个残基的两个氨基酸序列将具有95％的同一性。用于比较序列的数学算法的另一个实例是Myers&Miller(1988)CABIOS，4，11-17的算法。将这样的算法并入到作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(版本2.0)中。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。用于鉴定具有局部序列相似性和比对的区域的又一个有用的算法是如在Pearson&Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448中所描述的FASTA算法。另一种算法是WU-BLAST(华盛顿大学BLAST)版本2.0软件(用于几个UNIX平台的WU-BLAST版本2.0可执行程序)。该程序基于WU-BLAST版本1.4，WU-BLAST版本1.4又基于公共领域NCBI-BLAST版本1.4(Altschul&Gish(1996)局部比对统计。在MethodsinEnzymology(R.Doolittle编)266，460-480中；Altschul等人(1990)JournalofMolecularBiology，215，403-410；Gish和States(1993)NatureGenetics，3：266-272；Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873-5877；所有这些文献通过引用并入本文中)。除了本文另外提及的那些之外，也提及由国家生物技术信息中心(theNationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的程序BLAST、空位BLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中广泛用于该目的，并且可以比对两个氨基酸序列的同源区。在套件中的所有搜索程序中，有空位的对齐例程(gappedalignmentroutine)是数据库搜索本身的组成部分。如果需要，可以关闭空位。对于蛋白质和BLASTP，长度为1的空位的默认罚分(Q)为Q＝9，并且对于BLASTN，Q＝10，但可以改变为任何整数。对于蛋白质和BLASTP，延长空位的默认每残基罚分(R)为R＝2，并且对于BLASTN，R＝10，但可以改变为任何整数。Q和R的值的任何组合可以用于比对序列以便最大化重叠和同一性，同时使序列空位最小化。默认氨基酸比较矩阵是BLOSUM62，但是可以使用其他氨基酸比较矩阵，例如PAM。如本文所使用的，术语“多核苷酸序列”或“核酸”包括编码突变RPE65蛋白质产物的任何多核苷酸，包括以RNA形式的多核苷酸，如mRNA，或以DNA的形式的多核苷酸，包括例如通过克隆获得或通过化学合成技术产生或通过其组合产生的cDNA和基因组DNA。所述DNA可以是双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为正义链，或者其可以是非编码链，也称为反义链。编码突变蛋白或编码突变蛋白的片段的多核苷酸序列可以与内源编码序列的编码序列基本上相同，只要其编码生物活性突变蛋白产物即可。此外，所述突变蛋白或突变蛋白的片段可使用由于遗传密码的简并性或等位基因变异而在密码子使用方面不同的一种或多种多核苷酸序列表达。术语“感染”、“转导”和“转染”在本文中可互换使用，并且是指将基因、核酸或多核苷酸序列引入到细胞中，从而表达编码的蛋白质产物。本公开的发明构思的多核苷酸可以包含另外的序列，例如：在相同转录单位内的另外的编码序列，例如启动子的控制元件，核糖体结合位点，转录终止子，聚腺苷酸化位点，在相同或不同的控制启动子控制下的另外的转录单位，允许宿主细胞的克隆、表达、同源重组和转化的序列，以及可被期望提供本公开的发明构思的实施方式的任何此类构建体。如本文所使用的术语“基因治疗”是指为了在体内表达或复制一种或多种肽、多肽、蛋白质、寡核苷酸或多核苷酸用于治疗或防止人或动物的疾病或缺陷的目的通过将外源性DNA或RNA引入到这些细胞中的细胞遗传修饰。基因治疗被总体公开在美国专利号5,399,346中。所述核酸或蛋白质的任何合适的施用途径可被用于为受试者提供本公开的发明构思的药物组合物。例如，可以采用肠胃外(皮下、视网膜下、脉络膜上、肌内、静脉内、经皮)和类似的施用形式。剂量制剂包括注射剂、植入剂(implant)或其他已知和有效的基因治疗递送方法。用于编码本公开的发明构思的蛋白产物的核酸的基因递送媒介物(载体)包括任何适合于促进突变RPE65蛋白产物表达的载体，并且可选地包括对视网膜色素上皮细胞是特异性的可操作地连接的启动子序列(例如，参见美国专利号8,785,413)。这样的基因递送媒介物在本领域中对于本领域普通技术人员来说是熟知的；因此，其详细描述在本文不视为必需的。例如，编码本公开的发明构思的蛋白质产物的核酸可以包含在腺相关病毒载体中(例如，如在美国专利号5,139,941，5,436,146和5,622,856中所公开的)，减毒或无肠腺病毒载体(例如，如Morsy，M.A.和Caskey，C.T.(1999)Mol.Med.Today5:18-24；和在美国专利号5,935,935中所公开的)，慢病毒载体(例如公开在美国专利号5,665,577；5,994,136；和6,013,516)，质粒或合成(非病毒)载体(例如在美国专利号4,394,448和5,676,954中公开的)和/或纳米颗粒(诸如例如在美国专利6,217,912；7514098；和8,323,618中所公开的)。替代性的病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体(例如在美国专利号5,672,510；5,707,865；和5,817,491中所公开的)，疱疹病毒载体(例如在美国专利号5,288,641中所公开的)，和辛德毕斯病毒载体和乳头瘤病毒载体(例如在EP820773中公开的)。载体可以是单顺反子的、双顺反子的或多顺反子的。腺病毒载体可以基本上包括完整的腺病毒基因组(Shenk等人，(1984)Curr.Top.Microbiol.Immunol.，111：1-39)。可替代地，腺病毒载体可以是其中至少一部分腺病毒基因组缺失的修饰的腺病毒载体。腺病毒载体可以根据He等人，(1998)PNAS，95：2590-2514；Chartier等人，(1996)J.Virol.，70：4805-4810；和Hitt等人，(1995)MethodsinMolecularGenetics，7：13-30制备。使用腺病毒载体将基因转移到细胞中的方法已经描述在PCT/US95/15947中。许多腺病毒载体已被开发用于将基因转导入细胞中(Berkner等人(1988)BioTechniques6：616-629)。转导的基因产物的组成型高水平表达已被实现。这些载体相对于逆转录病毒载体具有固有的优点，即不需要复制细胞用于感染，使其成为用于体细胞基因治疗的合适载体(Mulligan，R.C.(1993)Science260：926-932)。已经描述了使用腺病毒介导的转移在培养中的原代大鼠肝细胞和成肌细胞中转导与葡萄糖代谢相关的基因的可行性(Baque等人(1994)Biochem.J.304(Pt3)：1009-1014；Gomez-Foix等人(1992)J.Biol.Chem.267：25129-25134)。可用于本公开的发明构思的方法中的载体也描述于Narfstrom，等人，(2003)“FunctionalandstructuralrecoveryoftheretinaaftergenetherapyintheRPE65nullmutationdog.”Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.44，1663-1672；Bennett，等人，(1994)“Adenovirusvector-mediatedinvivogenetransferintoadultmurineretina.”Invest.Ophthalmol.Vis.，35，2535-2542；Zhang，等人，(2008)“Distinctivegenetransductionefficiencyienciesofcommonusedviralvectorsintheretina.”Curr.EyeRes.33，81-90；Weber，等人，(2003)“Recombinantadeno-associatedvirusserotype4mediatesuniqueandexclusivelong-termtransductionofretinalpigmentedepitheliuminrat，dog，andnonhumanprimateaftersubretinaldelivery.”Mol.Ther.，7，774-781；Yokoi，等人，(2007)“Oculargenetransferwithself-complementaryAAVvectors”.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，48，3324-3328；Auricchio，等人，(2001)“Exchangeofsurfaceproteinsimpactsonviralvectorcellularspecificityandtransductioncharacteristics：theretinaasamodel.”Hum.Mol.Genet.，10，3075-3081；Pang，等人，(2008)“ComparativeanalysisofinvivoandinvitroAAVvectortransductionintheneonatalmouseretina：effectsofserotypeandsiteofadministration.”VisionRes.，48，377-385；Yanez-Munoz等人，(2006)“Effectivegenetherapywithnonintegratinglentiviralvectors.”Nat.Med.，12，348-353；Bemelmans，等人，(2006)“LentiviralgenetransferofRPE65rescuessurvivalandfunctionofconesinamousemodelofLebercongenitalamaurosis.”PLoSMed.，3，1892-1903；Miyoshi，等人，(1997)“StableandefficientgenetransferintotheretinausinganHIV-basedlentiviralvector.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，10319-10323；Farjo，等人，(2006)“Efficientnon-viraloculargenetransferwithcompactedDNAnanoparticles.”PLoSOne，1，e38；Kachi，等人，(2005)“Nonviraloculargenetransfer.”GeneTher.，12，843-851；以及Johnson，等人，(2008)“Technicalbrief：subretinalinjectionandelectroporationintoadultmouseeyes.”Mol.Vis.，14，2211-2226。重组载体(例如，lenti-，parvo-，AAV)序列可以是被包装的-在本文中被称为“颗粒”，用于随后离体、体外或体内细胞的感染(转导)。当重组载体序列被包衣壳(衣壳化，encapsidate)或包装成AAV颗粒时，该颗粒也可以称为“rAAV”。这种颗粒包括对载体基因组包衣壳或包装的蛋白质。具体实例包括病毒包膜蛋白，并且在AAV的情况下为衣壳蛋白。载体“基因组”是指重组质粒序列的最终被包装或包衣壳以形成病毒(例如AAV)颗粒的部分。在重组质粒用于构建或制造重组载体的情况下，载体基因组并不包括与重组质粒的载体基因组序列不对应的“质粒”部分。重组质粒的这种非载体基因组的部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(重组病毒生产所需的过程)是重要的，但是其本身不被包装到或包衣壳到病毒(例如AAV)颗粒中。因此，载体“基因组”是指载体质粒的被包装或被包衣壳(例如AAV)且含有编码突变RPE65蛋白或其片段的序列的部分。重组质粒的非载体基因组的部分是对于质粒的克隆和扩增重要的“质粒骨架”，例如具有选择性标记，诸如卡那霉素，但其本身不被病毒(例如，AAV)包装或包衣壳。AAV载体可以是任何血清型。代表性的血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8。载体可以包括额外的核酸或蛋白质元件。例如，AAV载体可以包括保留在AAV载体中的AAV基因组的一个或两个反向末端重复(ITR)序列。ITR序列可以包括或基于来自任何AAV血清型(包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8)的ITR。通常，在AAV载体中，编码突变RPE65蛋白或其片段(部分)的核酸的侧翼是5'和/或3'AAVITR序列。核酸序列的另外的非限制性实例包括表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、聚腺嘌呤序列、终止密码子等。这样的包括表达控制元件的序列可以位于转录序列的5'(即“上游”)、3'端(即“下游”)或在序列内(例如，在内含子中)。包括表达控制元件的这些序列可以定位成与转录序列相邻或相隔一定距离(例如，距多核苷酸1-10、10-25、25-50、50-100、100到500或更多个核苷酸)，甚至相当远的距离。表达控制元件的一个具体实例是启动子，其通常位于转录序列(编码突变RPE65蛋白或其片段的核苷酸序列)的5'。表达控制元件的另一个实例是增强子，其可位于转录序列的5'和/或3'，或位于转录的序列内。“启动子”可以指位置与序列诸如例如编码突变RPE65蛋白或其片段的核苷酸序列相邻的核酸(例如，DNA)序列。与不存在启动子时被表达的量相比，启动子通常增加与其可操作地连接的被表达的核酸的量。“增强子”可以指被定位成与序列诸如例如编码突变RPE65蛋白或其片段的核苷酸序列相邻的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也起作用且可以位于启动子的下游或DNA序列内。因此，增强子元件可位于编码突变RPE65蛋白或其片段的序列的上游或下游10-25、25-50、50-100、100-200、200-300或更多个碱基对。增强子元件通常还增加可操作地连接的序列的表达。如本文所使用的，术语“可操作的连接(operablelinkage)”或“可操作地连接”是指被这样描述的组分允许它们以其预期的方式起作用的物理并置或功能并置。在与核酸可操作的连接的表达控制元件的实例中，关系是使得所述控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列意味着两个DNA以这样的关系排列(顺式或反式)，使得至少一个DNA序列能够对另一个序列施加生理效应。任何合适的视网膜色素上皮特异性启动子序列可以与所述突变RPE65蛋白编码或片段编码核酸一起使用。可以从能够例如在眼睛环境中表达RPE65蛋白编码或片段编码核酸的许多天然的、组成型或诱导型启动子中对待使用的启动子进行选择。在一个实施方式中，启动子是细胞特异性的。术语“细胞特异性的”是指被选择用于重组载体的特定启动子可以指导所选择的转基因的表达是特定的眼细胞类型。作为一个实例，所述启动子对RPE细胞中的表达是特异性的。作为另一个实例，启动子对于在感光细胞中的表达是特异性的。RPE特异性启动子的代表性非限制性实例包括RPE-65启动子、金属蛋白酶3的组织抑制剂(Timp3)启动子以及酪氨酸酶启动子。还有其他RPE特异性启动子是本领域已知的(参见例如在国际专利公开号WO00/15822中描述的启动子)。感光启动子的代表性非限制性实例包括棒视蛋白启动子、红绿色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子、光受体间结合蛋白(IRBP)启动子和cGMP-β-磷酸二酯酶启动子(参见例如在国际专利公开号WO98/48097中描述的启动子。表达控制元件包括普遍存在的或混杂的启动子/增强子，其能够驱动在许多不同细胞类型中的表达。在一个具体的实施方式中，启动子是组成型的。组成型启动子的代表性非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子/鸡β-肌动蛋白(CβA)启动子-外显子1-内含子1元件、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子/增强子序列、LTR启动子/增强子、SV40启动子、CMV启动子、二氢叶酸还原酶启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。AAV载体可以包括任何血清型的衣壳。代表性的AAV衣壳血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8。AAV载体可以包括衣壳嵌合体或任何血清型的变体。具体的AAV衣壳变体包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74或AAV-2i8的衣壳变体，例如具有氨基酸取代、缺失或插入/添加的衣壳序列。在本公开的发明构思的某些实施方式中，在治疗性治疗中提供包含突变RPE65蛋白(和/或其治疗有效片段)的组合物。可替代地，可以在基因疗法治疗中提供包含编码突变RPE65蛋白或片段的核苷酸序列的组合物。还提供了生产这些组合物的方法及其使用方法。在一个实施方式中，所述组合物用于治疗受试者的与视网膜变性相关的疾病(营养不良)或病症，包括但不限于利伯氏先天性黑蒙和视网膜色素变性(例如常染色体隐性视网膜色素变性)。如所指出的，特定的治疗方法是通过基因治疗，例如通过腺相关病毒、慢病毒、质粒或纳米颗粒。在某些实施方式中，所述治疗导致降低诸如人的哺乳动物受试者的视力丧失的发生和/或严重性。在某些实施方式中，本公开的发明构思的治疗使用包含载体的药物组合物，所述载体在适当或合适的条件下或在合适的宿主细胞中体内表达期望的突变RPE65蛋白或片段。所述药物组合物可以包括一种或多种载体，基本上由一种或多种载体构成，或由一种或多种载体构成，所述一种或多种载体为例如表达载体(病毒诸如AAV、lenti等)，诸如体内表达载体，其包括以下，基本上由以下构成，或由以下构成，并且表达以下：与药学上可接受的运载体、赋形剂和/或媒介物组合的编码突变RPE65蛋白或片段的核酸。在某些实施方式中，所述载体包括以下，基本上由以下构成，或由以下构成并表达以下：药学上可接受的运载体、赋形剂和/或媒介物中的至少一种编码突变RPE65蛋白或片段的核酸。因此，根据本公开的发明构思的一个实施方式，组合物中的一种或多种其他载体包含编码突变RPE65蛋白或片段的核酸。所述药学上可接受的运载体、媒介物和/或赋形剂促进转染和/或改善载体的保存。本领域已知的或本文另外预期的任何药学上可接受的运载体、媒介物和赋形剂可以根据本公开的发明构思使用。例如但不限于，药学上可接受的运载体、媒介物或赋形剂可以是水、0.9％NaCl(例如生理盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本公开的发明构思的方法中的其他药学上可接受的运载体、媒介物和赋形剂包括但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上可接受的运载体、媒介物或赋形剂可以是有助于载体施用、增加表达水平和/或增加表达持续时间的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量体积在本文中在一般性描述中讨论，并且也可以由技术人员从阅读的本公开内容结合本领域的知识来确定，而无需任何过度的实验。例如，剂量体积可以在约0.01到约2ml之间，例如在约0.02到约1ml之间。更具体的剂量体积可以在约0.05到约0.80ml之间，在约0.10到约0.60ml之间，或在约0.20到约0.50ml之间。在非限制性实施方式中，所述治疗和/或药物组合物每个剂量含有以下范围中的病毒颗粒：例如从约104至约1011个颗粒，从约105至约1010个颗粒，或从约106个至约109个颗粒。在AAV载体的上下文中，载体基因组在以下范围中被提供：例如从约104至约1014个载体基因组，从约105至约1013个载体基因组，从约106至约1013个载体基因组，从约107个至约1013个载体基因组，从约108至约1013个载体基因组或从约109至约1013个载体基因组。这样的剂量/数量的AAV载体在本文所述的方法中是有用的。本公开的发明构思考虑了将有效量的根据本公开的发明构思制备的治疗组合物至少一次施用给受试者。这种施用可以通过各种途径，包括但不限于肌内、皮下、眼内、结膜下、视网膜下、脉络膜上或血管内。作为说明，本公开的发明构思的蛋白质/核酸所涵盖的突变RPE65蛋白或片段包括但不限于由如下核苷酸序列编码的突变RPE65蛋白或片段：与本文公开的核苷酸序列不完全相同，但是其中核苷酸序列的变化不改变编码的氨基酸序列，或仅导致氨基酸残基的保守取代，一个或几个氨基酸的缺失和/或添加，氨基酸残基被不显著影响所编码多肽的性质的氨基酸类似物取代等。保守的氨基酸取代的实例包括但不限于甘氨酸/丙氨酸取代；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸取代；天冬酰胺/谷氨酰胺取代；天冬氨酸/谷氨酸取代；丝氨酸/苏氨酸/甲硫氨酸取代；赖氨酸/精氨酸/组氨酸取代；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸取代。因此，也包括在本公开的发明构思中的是如下突变RPE65蛋白和片段，其中至少一个氨基酸残基被去除，并且不同的残基插入到其位置中。关于蛋白质化学和结构的详细描述，参见Schulz，G.E.等人(1979)PrinciplesofProteinStructure，Springer-Verlag，纽约和Creighton，T.E.(1984)Proteins：StructureandMolecularPrinciples，W.H.Freeman&Co.，旧金山。可以进行的取代类型是保守取代，并且在本文中定义为在以下组之一内的交换：(1)小的脂肪族、非极性的或轻微极性的残基：例如Ala、Ser、Thr、Gly；(2)极性的、带负电荷的残基及其酰胺：例如Asp、Asn、Glu、Gin；和(3)极性的、带正电荷的残基：例如、His、Arg、Lys。因为Pro不寻常的几何形状，其牢固地限制了所述链。通过选择较不保守的取代，例如在上述基团(或上文未示出的两个其他氨基酸基团)之间，而不是内部的取代，进行了功能性质的实质性改变，所述取代在对维持(a)所述取代区域中肽骨架的结构(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的效应方面更显著地不同。根据本公开的发明构思的大多数取代是不会产生蛋白质特征的根本改变的那些取代。即使难以在进行取代之前预测取代的确切效应时，本领域技术人员将理解，可以通过常规筛选测定(例如本文所述的活性测定)来评价该效应(例如，异构水解酶活性测定)。通过本领域技术人员已知的方法来测定肽性质的改变，所述肽性质包括氧化还原或热稳定性、疏水性、对蛋白水解降解的易感性或与运载体或聚集成多聚体的倾向。导致如上所述的功能性突变RPE65蛋白或片段和同源物的其他类型的取代、变化、添加、缺失和衍生物也被本公开的发明构思涵盖，且本领域技术人员将容易地知道如何制备、鉴定或选择这样的变体或衍生物，以及如何测试那些变体或衍生物的RPE65活性。本领域普通技术人员可以优化本公开的发明构思的突变RPE65蛋白或片段多肽的表达，以通过本领域已知的任何方法来改善表达，所述方法包括但不限于通过去除隐藏的剪接位点，通过在起始密码子之前引入Kozak共有序列而改变密码子使用，通过改变密码子使用，或其任何组合。在某些实施方式中，本公开的发明构思包含与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16或SEQIDNO:18中的至少一个或多个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性或同源性的核酸变体，并且其编码如下突变RPE65蛋白：与由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17编码的多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性或同源性，且包括至少一个或多个本文所述的氨基酸取代，例如图9中所述的那些氨基酸取代中的一个或多个。在一些实施方式中，编码所述突变RPE65蛋白或片段的DNA是与本文所述的野生型DNA(例如，SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16或SEQIDNO:18)在严格条件下杂交的DNA。“在严格条件下杂交的DNA”是指使用编码RPE65蛋白的DNA通过菌落杂交、噬菌斑杂交或蛋白质印迹杂交获得的DNA，具体包括杂交后鉴定的DNA，所述杂交使用在65℃下在0.7至1.0MNaCl的存在下菌落或噬菌斑衍生的DNA被固定在其上的过滤器(滤膜，filter)，并在65℃下使用0.1x至2xSSC溶液(1xSSC溶液的组成包含150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)洗涤所得过滤器。杂交可以根据例如MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版(Sambrook，Fritsch，&Maniatis编，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1989)中描述的方法进行。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开的发明构思所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本公开的发明构思的实践或测试中，但是本文描述了合适的方法和材料。本文使用的缩写包括：11cROL，11-顺式视黄醇；AD，腺病毒；BTP，1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷；cRPE65，鸡RPE65；HPLC，高效液相色谱；hRPE65，人RPE65；LCA，利伯氏先天性黑蒙；PVDF，聚偏氟乙烯；rAAV，重组腺相关病毒；RFP，红色荧光蛋白；RPE，视网膜色素上皮；RPE65，RPE特异性65-kDa蛋白；RP，视网膜色素变性；TBST，含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水；wt，野生型。本文引用的所有申请、出版物、专利和其他参考文献、GenBank引文和ATCC引文以其整体通过引用并入。在冲突的情况下，包括定义的说明书将支配。本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。在本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的特征(例如，核酸、载体、质粒、重组载体(例如rAAV)、载体基因组或病毒颗粒)是等同或类似特征种类的实例。如上所指出的，如本文所使用的，单数形式“一个”，“和”与“该”除非上下文另有明确指示，否则包括复数指代物。因此，例如，提及“一个核酸”包括多个这样的核酸，提及“一个载体”包括多个这样的载体，并且提及“一个病毒”或“微粒”包括多个这样的病毒粒子/颗粒。如本文所用，所有数值或数值范围除非上下文另有明确指示，否则包括此类范围内的整数以及范围内的值或整数的分数。因此，为了说明，提及80％或更高同一性包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，诸如此类。与更多(更大)或更少一起提及整数分别包括大于或小于该参考数的任何数。因此，例如，提及小于100包括99、98、97等，一路直到数字一(1)；以及小于10包括9、8、7等一路直到数字一(1)。如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括在这样的范围内的值和整数的分数以及在这样的范围内的整数的分数。因此，为了说明，提到数值范围诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，诸如此类。提及1-50的范围因此包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直到并包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，诸如此类。提及一系列范围包括组合该系列内的不同范围的边界的值的范围。因此，为了说明提及一系列范围，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000的范围，包括1-20、10-50、50-100、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000等的范围。通过参考以下实施例和实施方式，将更容易地理解本公开的发明构思，这些实施例和实施方式仅仅是为了说明本公开的发明构思的某些方面和实施方式的目的而被包括的，而不旨在是限制性的。以下详细的实施例和方法描述了如何制备和使用本公开的发明构思的各种突变蛋白，并且应仅被解释为(如上所指出的)说明性的，而不以无论什么任何方式限制本公开。本领域技术人员将迅速认识到来自本文所述的材料和程序的适当变化。已知视锥显性鸡RPE65(cRPE65-SEQIDNO:3)具有比人RPE65(hRPE65-SEQIDNO:1)、牛RPE65(bRPE65-SEQIDNO:9)或其他哺乳动物RPE65蛋白的异构水解酶活性明显更大的异构水解酶活性。如下面详细解释的，通过体外异构水解酶活性测定来测量cRPE65、hRPE65和hRPE65突变体的酶活性，并通过HPLC来分析类视黄醇产物。在本文所分析的本公开的发明构思的突变体中，hRPE65的两个单点突变体N170K和K297G以及双突变体N170K/K297G显示出比wthRPE65的催化活性显著更高的催化活性。此外，当hRPE65的N170K/K297G双突变体的氨基末端片段(氨基酸1Met-33Arg)被相应的N末端cRPE6533残基片段取代时，异构水解酶活性进一步提高至与cRPE65的水平类似的水平。在本公开内容的某些RPE65基因治疗实施方式中，可以使用这种高效的异构水解酶突变体组合(S2Y/I3S/L26V/N170K/K297G-进一步在下文描述的)来改善具有或处于患由RPE65突变引起的视网膜变性的风险的哺乳动物受试者(包括但不限于人)的视力。在目前公开的工作中，使用定点诱变，hRPE65的若干残基用其cRPE65的位置对应残基(图1所示的比对)取代，并评估了所产生的hRPE65突变体的异构水解酶活性。结果如下所示和讨论。实验程序定点诱变如先前所述将编码野生型(wt)hRPE65蛋白(SEQIDNO:1)和cRPE65蛋白(SEQIDNO:3)的cDNA亚克隆到克隆载体中(Moiseyev等，(2005)“RPE65IstheIsomerohydrolaseintheRetinoidVisualCycle“，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102，12413-12418；和Moiseyev等人(2008)“RPE65fromCone-dominantChickenIsaMoreEfficientIsomerohydrolaseComparedwithThatFromRod-dominantSpecies”J.Biol.Chem.，283，8110-8117)。按照制造商的方案，使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene，拉荷亚，加州)，将hRPE65中的选定残基用其在cRPE65中的对应残基替换。引入的突变通过使用ABI-3730DNA测序仪(AppliedBiosystems，福斯特市，加州)从两条链测序来证实并被亚克隆到表达载体pcDNA3.1(-)(Invitrogen，卡尔斯巴德，加州)中。在序列确认之后，通过QIAfilterMaxiPrep试剂盒(Qiagen，巴伦西亚，加州)来纯化该表达构建体。此外，将hRPE65cDNA(SEQIDNO:2)和cRPE65cDNA(SEQIDNO:4)单独亚克隆到pUC18中。为了产生hRPE65和cRPE65的6个限制性片段，引入了独特的限制性酶切位点而不改变氨基酸序列(参见图5A)。使用引入的限制性酶切位点，将hRPE65的每个片段用其cRPE65的对应片段替换。本研究中使用的所有引物组(SEQIDNO:19-42)在表1中示出。表1：引物组。质粒转染。使用QIAfilterMaxiPrep试剂盒(Qiagen，巴伦西亚，加州)对表达wthRPE65、cRPE65和hRPE65突变体的构建质粒进行纯化，并使用Fugene6转染试剂(罗氏公司，印第安纳波利斯，印第安纳州)或聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences，Inc.，沃灵顿，宾夕法尼亚州；1mg/ml，pH7.4，2:1的PEI:DNA比)将其转染到293A-LRAT细胞中，所述细胞是稳定表达人LRAT的细胞系(45)，并且在转染后6小时更换培养基。在转染后48小时，通过细胞刮刀(细胞刮，cellscraper)收获细胞，并用冰冷的PBS漂洗两次。通过蛋白质印迹分析和体外异构水解酶活性测定证实wthRPE65及其突变体的蛋白水平和酶活性。蛋白质印迹分析。使用Bradford测定来测量总细胞蛋白质浓度。将等量的表达wthRPE65和cRPE65以及hRPE65突变体的293A-LRAT细胞的总细胞蛋白(20μg)和作为阳性对照的牛RPE微粒体蛋白(2.5μg)用通过8％Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶的电泳来分辨并被电转移到埃托啡(immobilon)PVDF膜(Millipore，比尔里卡，马萨诸塞州)上，除非指定。用TBST(含有0.1％Tween-20的Tris-缓冲盐水)中的5％(重量/体积)脱脂奶粉封闭膜30分钟，并且随后在4℃下与1:1,000稀释的鉴定关键残基的抗RPE65多克隆抗体(例如，参见Ma等人(2001)“Expression，purification，andMALDIanalysisofRPE65.”Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，42,1429-1435)和1:50,000稀释的抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)一起孵育过夜。我们使用另一种RPE65抗体(Moiseyev，等人(2008)“RPE65fromCone-dominantChickenIsaMoreEfficientIsomerohydrolaseComparedwithThatfromRod-dominantSpecies.”J.Biol.Chem.，283，8110-8117)比较cRPE65以及RPE65嵌合突变体的表达水平以避免片段3上的免疫反应性差异。在用TBST洗涤四次后，将膜在遮光容器中与1:25,000稀释的用DyLight-549缀合的山羊抗小鼠IgG以及用DyLight-649缀合的山羊抗兔IgG(Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)孵育1.5小时，并使用FluorChemQ成像系统(AlphaInnotech，圣里安德鲁，加州)检测条带。使用AlphaViewQ软件(AlphaInnotech，圣里安德鲁，加州)通过光密度测量法对信号强度进行半定量，并从至少3次独立实验中求平均值。异构水解酶活性测定。分别用表达野生型人RPE65和鸡RPE65以及hRPE65突变体的质粒转染293A-LRAT细胞。使用表达红色荧光蛋白(rfp)的293A-LRAT细胞作为阴性对照。通过在反应缓冲液(10mM的1,3-双[三(羟甲基)-甲氨基]丙烷(BTP)，pH8.0,100mMNaCl)中超声处理来裂解细胞。使用在N,N-二甲基甲酰胺中的全反式[11,12-3H]-视黄醇(1mCi/ml，45.5Ci/mmol，AmericanRadiolabeledChemical，Inc.，圣路易斯，密苏里州)作为底物，以用于异构水解酶测定。对于每个反应，将总细胞蛋白(125μg)加入到含有0.2μM全反式视黄醇、1％BSA和25μM细胞视黄醛结合蛋白的200μl反应缓冲液(10mMBTP，pH8.0，100mMNaCl)中。停止反应，并用300μl冷甲醇和300μl己烷萃取类视黄醇。通过正相HPLC来分析所产生的类视黄醇。每种类视黄醇异构体的峰基于其特征性的保留时间和类视黄醇标准品的吸收光谱而被鉴定。使用Radiomatic610TR软件(PerkinElmer，波士顿，马萨诸塞州)以合成的11-顺式[3H]-视黄醇作为标准，从11cROL峰的面积计算异构水解酶活性。为了使转染效率的变化最小化，用wthRPE65并行地进行突变体的所有体外活性测定，并且催化活性表示为相对于wthRPE65的催化活性的值，除非指定。结果hRPE65和cRPE65的表达和酶活性的比较。将表达红色荧光蛋白(rfp；阴性对照)、hRPE65和cRPE65的质粒分别转染到293A-LRAT细胞中并培养48小时。通过蛋白质印迹分析(图3A)和体外异构水解酶测定来验证hRPE65和cRPE65的表达水平和酶活性。hRPE65和cRPE65二者，而不是阴性对照蛋白rfp，将全反式视黄基酯转化为11cROL(异构水解酶的产物)(图3B-3D)。在标准化至其RPE65蛋白水平后，cRPE65产生比wthRPE65显著更高水平的11cROL，表明cRPE65的更高的酶活性。突变体的选择。选择cRPE65中各个位置的8个残基用于检查hRPE65和cRPE65之间的异构水解酶活性的差异(参见图1)。为了评价这些残基对异构水解酶活性的贡献，通过定点诱变产生hRPE65中8个候选残基的一系列点突变。对于体外酶活性测定，在第一实验组中检测在hRPE65中39位的Thr、170位的Asn、330位的Cys和497位的Gln的取代的影响。在第二实验组中检测了106位的Cys、297位的Lys、510位的Leu和533位的Ser的取代。定点突变对hRPE65的蛋白水平和催化活性的影响。将表达hRPE65和cRPE65以及定点突变体的质粒分别转染到293A-LRAT细胞中，并将转染的细胞培养48小时。通过蛋白质印迹分析证实蛋白质表达(测试的RPE65突变体的相对表达水平显示在表2中)，并且相同批次的总细胞蛋白被用于体外异构水解酶活性测定。对于所有含有单个、双重和多重突变的hRPE65突变体，RPE65的表达水平是相当的(图4A-4E)，而在通过总RPE65表达水平标准化之后，两个单点突变体N170K和K297G分别表现出为wthRPE65的酶活性的1.6倍和1.7倍高的酶活性(图4F和图4G)。此外，在每个实验组中所测试的具有N170K(或K297G)的双重、三重或多重突变体没有进一步提高RPE65的催化活性。这些结果表明，hRPE65中N170K和K297G的突变对于增强其酶活性可能是重要的。表2：所产生的RPE65突变体的表达水平。嵌合的人RPE65的构建及其对蛋白质水平和催化活性的影响。为了进一步提高hRPE65的催化活性，我们通过用cRPE65的对应肽片段取代hRPE65的肽片段来构建嵌合RPE65(图5A，片段F1-F6)。在转染后48小时，收获细胞以用于蛋白质印迹分析和体外异构水解酶测定。蛋白质印迹分析表明，除了F1嵌合体(取代的片段1)之外的嵌合突变体显示出比wthRPE65和其他嵌合突变体的RPE65蛋白水平更高的RPE65蛋白水平(图5B-5C)。有趣的是，F1和F3嵌合突变体显示出为wthRPE65催化活性的约1.5-2倍高的催化活性，而F2、F4和F5嵌合突变体显著降低了其hRPE65的催化活性。在通过RPE65蛋白水平的标准化之后，F1嵌合突变体显示出与wthRPE65的催化活性相当的催化活性(wthRPE65的106.9％)，表明F1嵌合体的增强的催化活性可能是由于F1RPE65嵌合体增加的蛋白水平(图5B，图5C)。应当注意，F3嵌合体显示出比wthRPE65更高的标准化酶活性，可能是由于N170K突变(wthRPE65的152％)。这与N170K单突变的结果良好相关。cRPE65的F1片段在2位、3位和26位包含与hRPE65中的相应残基不同的残基(S2Y、I3S和L26V)。通过高活性突变体的组合产生超级异构水解酶(sIMH)。组合由从系列定点的点突变体和嵌合突变体研究中发现的三种高活性突变体组成。如上所述，两个单突变体(N170K和K297G)显示出比wthRPE65的催化活性显著更高的催化活性(图6B)，尽管它们的表达水平与wthRPE65的表达水平相似(图6A)。如图6所示，hRPE65的双突变体(N170K/K297G)表现出为野生型hRPE65的酶活性的3.2倍高的酶活性。此外，F1嵌合体(具有3个取代)与N170K突变的组合显示出比N170K单突变体更高(2.2倍)的蛋白水平和催化活性。在将所有这些突变(S2Y/I3S/L26V/N170K/K297G)组合成单个突变体(sIMH)后，发现该突变体的催化活性是wthRPE65的催化活性的4.4倍，其与wtcRPE65的活性是相当的(在相同测定中为5.8倍，图6B)。替代突变体。如表3所示，基于hRPE65与cRPE65之间(例如在220位和302位)的差异的某些突变要么不提高活性、降低活性，要么降低由170位和297位的突变诱导的提高。表3：hRPE65的I220M和N302I突变体系列的异构水解酶活性。两点突变(特别是N170K和K297G)显著提高了hRPE65的酶活性。包括这两种突变(N170K/K297G)的突变体显示出进一步增强的hRPE65的催化活性(wtRPE65的3.2倍)。此外，通过来自cRPE65的F1片段(1Met-33Arg；含有3个不同的残基：2位的Y、3位的S、26位的V)的替换，进一步增强了该双突变体的活性。结果，在相同的实验条件下，该超级异构水解酶突变体(sIMH；F1/N170K/K297G)的催化活性是wthRPE65的催化活性的约4.4倍，并且其是由1.9倍高的催化活性加上2.3倍高的蛋白水平贡献的。由sIMH产生的11cROL接近wtcRPE65的水平(wthRPE65的5.8倍)。作为sIMH的增强的酶活性的进一步证明，我们评估了wthRPE65和sIMH的催化效率(图7)。计算的Km和Vmax表明sIMH的更高的Vmax主要有助于其更高的酶活性(图7C)。为了理解经鉴定的关键残基对cRPE65的更高催化活性的潜在贡献，我们通过SwissPDBViewer4.01版(/www.expasy.org/spdbv/)分析了牛RPE65(PDB登录号：3FSN)的3D结构，并通过POV-Ray版本3.61(www.povray.org/)显示结果。在3D模型中，Asn170和Lys297残基都位于RPE65分子(图8A，B)的表面上，并且远离RPE65催化位点中的辅因子铁(图8C)，表明这两个残基不可能直接参与底物的催化。不希望受理论束缚，我们推测这些残基取代可能提高RPE65膜缔合，例如，用于更有效的底物摄取和/或产物(11cROL)释放。可替换地，这两个残基可能有助于RPE65的恰当的折叠，以在与膜缔合时实现其活性构象。有趣的是，F1嵌合体(在2位、3位和26位被取代)还显示出由于RPE65的蛋白水平增加的hRPE65的催化活性的显著提高。与其他两个残基取代不同，其中仅F1片段被cRPE65的F1片段取代的所述F1嵌合体显示出与通过RPE65蛋白水平标准化后的wthRPE65的催化活性类似的催化活性。所述F1片段含有33个氨基酸，以及仅3个在hRPE65和cRPE65之间不同的残基。所述F1片段中的这些残基可能有助于恰当的折叠以增强hRPE65突变体的蛋白稳定性。另一种可能性是核苷酸序列差异的贡献。在编码F1片段中33个氨基酸的99个碱基对中，在hRPE65与cRPE65之间存在19种不同的核苷酸。这些核苷酸取代可能提高hRPE65mRNA的稳定性或有助于更有效的密码子使用，从而导致更高水平的表达。如从上文可以看出的，本发明的工作在至少一个实施方式中通过将野生型5个残基(在2位、3位、26位、170位和297位)用cRPE65的相应氨基酸位置的残基取代产生高活性hRPE65突变体(本文称为超级异构水解酶(sIMH))。该sIMH在通过总细胞蛋白水平标准化后显示出更高的催化活性(wtRPE65的4.4倍高)。在一个实施方式中，该sIMH突变体可以用于RPE65基因替代治疗，以用于更有效地治疗人类受试者的视网膜营养不良。为形成本公开的发明构思的其他突变体的可基于其他哺乳动物RPE65序列(包括但不限于本文所述的其他哺乳动物RPE65序列)作出的其他取代包括但不限于在图9中显示的那些。例如，在一个或多个非限制性实施方式中，在2位，Phe或His可以被用作取代的氨基酸以代替Tyr，在3位，Thr或Cys可以用作取代的氨基酸以代替Ser，在26位，Ala或Ile可以用作取代的氨基酸以代替Val，在170位，Arg或His可以用作取代的氨基酸以代替Lys，并且在297位，Ala可以用作取代的氨基酸以代替Gly。例如，基于SEQIDNO:1形成的任何突变体也可以在哺乳动物RPE65序列SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15或SEQIDNO:17的任何一种中产生。指定的突变体的体外活性测定如本文所述的进行，并且异构水解酶活性被表示为RPE65水平标准化后的相对活性(wthRPE65活性的％，平均值±SEM，n＝3)。尽管本文已结合某些实施方式描述了本公开的发明构思，使得其各方面可以被更充分地理解和领会，但是并不旨在将本公开的发明构思限于这些特定实施方式。相反，旨在所有替代、修改和等同物被包括在如本文所定义的本公开的发明构思的范围内。因此，包括特定实施方式的上述实施例将用于说明本公开的发明构思的实践，应当理解，所示的细节是通过举例的方式，并且仅仅用于本公开的发明构思的特定实施方式的说明性讨论的目的，并且为了提供被认为是对程序以及本发明构思的原理和概念的最有用和容易理解的描述而被呈现。在不脱离本公开的发明构思的精神和范围的情况下，可以在本文所述的各种组合物的制剂、本文所述的方法或在本文所述的方法的步骤或步骤的顺序方面进行改变。此外，虽然在本文以下的权利要求中描述了本公开的发明构思的各种实施方式，但是并不旨在将本公开的发明构思限于这些特定的权利要求。序列表<110>俄克拉何马大学董事会<120>哺乳动物RPE65的高异构水解酶活性突变体<130>PN1750121PZC<140>PCT/US2015/042263<141>2015-07-27<150>62/031,472<151>2014-07-31<160>42<170>PatentInversion3.5<210>1<211>533<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>1MetSerIleGlnValGluHisProAlaGlyGlyTyrLysLysLeuPhe151015GluThrValGluGluLeuSerSerProLeuThrAlaHisValThrGly202530ArgIleProLeuTrpLeuThrGlySerLeuLeuArgCysGlyProGly354045LeuPheGluValGlySerGluProPheTyrHisLeuPheAspGlyGln505560AlaLeuLeuHisLysPheAspPheLysGluGlyHisValThrTyrHis65707580ArgArgPheIleArgThrAspAlaTyrValArgAlaMetThrGluLys859095ArgIleValIleThrGluPheGlyThrCysAlaPheProAspProCys100105110LysAsnIlePheSerArgPhePheSerTyrPheArgGlyValGluVal115120125ThrAspAsnAlaLeuValAsnValTyrProValGlyGluAspTyrTyr130135140AlaCysThrGluThrAsnPheIleThrLysIleAsnProGluThrLeu145150155160GluThrIleLysGlnValAspLeuCysAsnTyrValSerValAsnGly165170175AlaThrAlaHisProHisIleGluAsnAspGlyThrValTyrAsnIle180185190GlyAsnCysPheGlyLysAsnPheSerIleAlaTyrAsnIleValLys195200205IleProProLeuGlnAlaAspLysGluAspProIleSerLysSerGlu210215220IleValValGlnPheProCysSerAspArgPheLysProSerTyrVal225230235240HisSerPheGlyLeuThrProAsnTyrIleValPheValGluThrPro245250255ValLysIleAsnLeuPheLysPheLeuSerSerTrpSerLeuTrpGly260265270AlaAsnTyrMetAspCysPheGluSerAsnGluThrMetGlyValTrp275280285LeuHisIleAlaAspLysLysArgLysLysTyrLeuAsnAsnLysTyr290295300ArgThrSerProPheAsnLeuPheHisHisIleAsnThrTyrGluAsp305310315320AsnGlyPheLeuIleValAspLeuCysCysTrpLysGlyPheGluPhe325330335ValTyrAsnTyrLeuTyrLeuAlaAsnLeuArgGluAsnTrpGluGlu340345350ValLysLysAsnAlaArgLysAlaProGlnProGluValArgArgTyr355360365ValLeuProLeuAsnIleAspLysAlaAspThrGlyLysAsnLeuVal370375380ThrLeuProAsnThrThrAlaThrAlaIleLeuCysSerAspGluThr385390395400IleTrpLeuGluProGluValLeuPheSerGlyProArgGlnAlaPhe405410415GluPheProGlnIleAsnTyrGlnLysTyrCysGlyLysProTyrThr420425430TyrAlaTyrGlyLeuGlyLeuAsnHisPheValProAspArgLeuCys435440445LysLeuAsnValLysThrLysGluThrTrpValTrpGlnGluProAsp450455460SerTyrProSerGluProIlePheValSerHisProAspAlaLeuGlu465470475480GluAspAspGlyValValLeuSerValValValSerProGlyAlaGly485490495GlnLysProAlaTyrLeuLeuIleLeuAsnAlaLysAspLeuSerGlu500505510ValAlaArgAlaGluValGluIleAsnIleProValThrPheHisGly515520525LeuPheLysLysSer530<210>2<211>1602<212>DNA<213>智人<400>2atgtctatccaggttgagcatcctgctggtggttacaagaaactgtttgaaactgtggag60gaactgtcctcgccgctcacagctcatgtaacaggcaggatccccctctggctcaccggc120agtctccttcgatgtgggccaggactctttgaagttggatctgagccattttaccacctg180tttgatgggcaagccctcctgcacaagtttgactttaaagaaggacatgtcacataccac240agaaggttcatccgcactgatgcttacgtacgggcaatgactgagaaaaggatcgtcata300acagaatttggcacctgtgctttcccagatccctgcaagaatatattttccaggtttttt360tcttactttcgaggagtagaggttactgacaatgcccttgttaatgtctacccagtgggg420gaagattactacgcttgcacagagaccaactttattacaaagattaatccagagaccttg480gagacaattaagcaggttgatctttgcaactatgtctctgtcaatggggccactgctcac540ccccacattgaaaatgatggaaccgtttacaatattggtaattgctttggaaaaaatttt600tcaattgcctacaacattgtaaagatcccaccactgcaagcagacaaggaagatccaata660agcaagtcagagatcgttgtacaattcccctgcagtgaccgattcaagccatcttacgtt720catagttttggtctgactcccaactatatcgtttttgtggagacaccagtcaaaattaac780ctgttcaagttcctttcttcatggagtctttggggagccaactacatggattgttttgag840tccaatgaaaccatgggggtttggcttcatattgctgacaaaaaaaggaaaaagtacctc900aataataaatacagaacttctcctttcaacctcttccatcacatcaacacctatgaagac960aatgggtttctgattgtggatctctgctgctggaaaggatttgagtttgtttataattac1020ttatatttagccaatttacgtgagaactgggaagaggtgaaaaaaaatgccagaaaggct1080ccccaacctgaagttaggagatatgtacttcctttgaatattgacaaggctgacacaggc1140aagaatttagtcacgctccccaatacaactgccactgcaattctgtgcagtgacgagact1200atctggctggagcctgaagttctcttttcagggcctcgtcaagcatttgagtttcctcaa1260atcaattaccagaagtattgtgggaaaccttacacatatgcgtatggacttggcttgaat1320cactttgttccagataggctctgtaagctgaatgtcaaaactaaagaaacttgggtttgg1380caagagcctgattcatacccatcagaacccatctttgtttctcacccagatgccttggaa1440gaagatgatggtgtagttctgagtgtggtggtgagcccaggagcaggacaaaagcctgct1500tatctcctgattctgaatgccaaggacttaagtgaagttgcccgggctgaagtggagatt1560aacatccctgtcacctttcatggactgttcaaaaaatcttga1602<210>3<211>533<212>PRT<213>鸡<400>3MetTyrSerGlnValGluHisProAlaGlyGlyTyrLysLysLeuPhe151015GluThrValGluGluLeuSerSerProValThrAlaHisVa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