基于计算流体力学优化的个体化自体组织工程补片的制作方法

本发明涉及医疗器械技术领域，具体地说，是基于计算流体力学优化的个体化自体组织工程补片。

背景技术：

补片是心脏外科，尤其是小儿心脏外科的重要手术材料。补片不仅可用于血管成型(血管补片)，也可用作心内分割板障。临床上常用的补片包括自体心包补片、牛心包补片或Gore-Tex补片。尽管目前这些补片仍然具有极普遍的使用性，但依然存在不同的缺点：新鲜的自体心包补片极柔软易皱褶，力学强度差，常需要在术中用0.6％戊二醛交联固定；但处理后的心包易钙化，同时将失去组织活性。异种心包补片，如牛心包补片，虽然来源广泛，但同样需经过交联剂处理，也容易引发机体对异种组织的排斥反应，最终出现严重钙化。Gore-Tex补片的缺点类似其血管制品，且不具有组织活性。因此，构建新型自体血管补片具有必要性。本发明的目的之一，即制备一种具有自体细胞和生物活性的组织工程补片。

然而，一种优良的组织工程血管补片并不是组织工程血管的简化——血管补片在用于狭窄血管的补片扩大后，需要协同周围自体血管，长期稳定地发挥生理功能。因此，在构建组织工程血管补片时，还要求个体化设计出补片的三维形态，使其整合到原有血管段后，能相互配合并发挥出最优化的血流特性。

以法洛四联症(ToF)右室流出道补片扩大术为例，补片植入后的肺动脉形态对患儿术后肺动脉发育具有直接的影响：ToF伴左右肺动脉分支狭窄的患儿，直接补片扩大左右肺动脉并不利于术后肺分支血管的发育。相反，通过合理的肺动脉总干补片扩大，使肺血流恢复正常后，发育不良的肺分支血管可恢复其生长潜能。在实际临床应用中，肺动脉跨瓣补片扩大术是纠治ToF患儿肺动脉瓣狭窄的常用方法，然而，肺动脉补片的裁剪、缝合依靠手术医生长期的手术经验和术中对患儿肺动脉解剖的判断，标准的补片成型方法有利于提高患儿中远期预后。因此，本发明的另一个目的，是结合一种科学的分析、评价手段，在术前即针对患者的个体特征，找到最佳的补片形态和手术植入方法。

计算流体力学(computational fluid dynamics,CFD)是利用数字分析和算法来分析、解决流体相关问题的的科学。通过传统的影像数据(CT、MRI)以及心脏多普勒超声数据，我们可以重建出符合患者肺动脉解剖的三维图形，并模拟每次心脏搏动肺动脉管腔中的血流速度等指标。已有研究证实CFD在个体化ToF术前规划中具有参考价值。因此，本发明中，我们主要结合计算流体技术，通过设计得到血流最优化的补片形态和植入方法，制备出个体化的、具有特定三维形态的自体组织工程补片。

中国专利文献CN103860291A公开了一种法洛氏四联症室间隔缺损补片的制作方法，包括以下步骤：1)制作三维实体模型：采集心脏数据后，用后处理工作站对原始数据进行数字化三维重建，获得心脏外形三维图像，并采用外科手术进路方式于右心室游离壁进一步切割，获得室间隔缺损三维图像；然后将所述两个图象通过数控转换，生成STL格式文件；接着将该STL数据输入选择性激光烧结成型设备中，进行烧结成型，制作带有室间隔缺损的心脏1：1的三维实体模型；2)制作补片：在上述制得的三维实体模型上对照室间隔缺损形状裁剪出手术补片。但是关于本发明的基于计算流体力学优化的个体化自体组织工程补片目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于计算流体力学优化的个体化自体组织工程补片及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种基于计算流体力学优化的组织工程血管补片的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

1)通过计算流体力学优化(和虚拟手术)设计血管补片；

2)将计算流体力学优化的设计模型制备出来，以制备的模型为内核，将电纺丝包裹于模型表面，然后进行组织工程构建，撤去模型即获得有自体细胞和组织的血管补片。

步骤1)为：以心血管影像数据对血管进行三维重建，设计不同的血管补片，在计算机系统进行虚拟手术规划，通过流体力学分析选择最佳的血管补片。或直接通过计算流体力学分析生成最佳的补片设计。

血管三维重建的方法为：术前获取患者心血管影像图像，通过医学图像三维重建软件标记每层图像中肺动脉的位置，重建后获得肺动脉三维图像；直接重建出的图像表面粗糙，在尽量减少处理对图像精确度带来损失的前提下，对肺动脉表面作光滑处理，完成肺动脉的三维重建。

所述的心血管影像图像为MRI、CT或三维超声。

根据临床经验公式设计血管补片，并以临床经验公式设计的血管补片为基础进一步设计不同的血管补片。

计算流体力学优化的设计模型通过3D打印制得。

所述的电纺丝为聚己内酯电纺丝。

所述的聚己内酯电纺丝由聚己内酯的三氟乙醇溶液进行静电纺丝制得。

所述的聚己内酯电纺丝以质量体积比≥25％的聚己内酯的三氟乙醇溶液进行静电纺丝制得，静电纺丝过程中电纺丝的接收距离≤10cm，接收装置为转动的镂空骨架滚筒。所述的聚己内酯电纺棉具有微米级直径和高孔隙率的特征，在体内外均有利于细胞向电纺棉深层长入。

所述的组织工程构建的方法为：将包裹或不包裹生物材料的模型(实施例展示包裹聚己内酯电纺膜的方式)移植到皮下。

所述的组织工程构建的方法为：将包裹聚己内酯电纺丝的模型移植皮下。

以上制备方法制得的血管补片。

本发明优点在于：

1、本发明提供了一种基于计算流体力学优化的个体化自体组织工程补片的制备方法，与传统的二维补片相比，本发明的补片经过了计算流体力学优化，为个体化的具有三维形态的血管补片。

2、补片中的细胞和细胞外基质来源于自体，且具有组织活性，自体移植后不发生免疫排斥反应，也不易引起钙化。

3、以法洛四联症为例，通过本发明的方法制备的肺动脉补片的大小和成角均进行了优化，患者肺动脉总干流速及左右肺血流分配比均接近于正常生理条件。

附图说明

附图1：静电纺丝装置的搭建。

附图2：无细胞聚己内酯(PCL)电纺棉的形态和二维自体血管补片的构建。

附图3：患者肺动脉三维重建。获取患者心血管MRI图像，在Mimics 17.0软件中用黄色蒙版标记每层图像中肺动脉的位置(A和B)，重建后获得肺动脉三维图像(C)。直接重建出的图像表面粗糙，在尽量减少处理对图像精确度带来损失的前提下，对肺动脉表面作光滑处理，完成肺动脉的三维重建模型(D)。

附图4：肺动脉补片的大小设计、虚拟手术规划和流体分析。患者术前肺动脉及左右分支情况被用于模拟补片植入手术(A)，利用计算血流动力学可分析得到肺动脉血流速度和左右肺动脉血流分配(D)。补片①依据临床经验公式计算的肺动脉瓣环直径的150％设计，用于单纯瓣环扩大(B，白色显示补片设计)；补片②单纯瓣环扩大则依据采用临床经验公式计算的瓣环直径(C，白色显示补片设计)。两种补片的计算流体分析结果分别为E和F。

附图5：肺动脉补片的成角设计、虚拟手术规划和流体分析。补片②在设计时仅考虑了扩大肺动脉瓣环，因此虚拟手术规划后可看出该设计不影响肺动脉总干与左右肺动脉之间的成角关系，主肺动脉依然偏向左肺动脉(A)。补片③采取折中的做法，使虚拟手术植入后肺动脉总干与左右肺动脉间成角大小相当(B)。补片④在虚拟手术植入后肺动脉总干偏向左肺动脉(C)。上述3种补片的虚拟手术计算流体力学分析分别为图D，E和F。

附图6：个体化组织工程肺动脉补片的构建。3D打印出优化的补片模型作为组织工程肺动脉补片的三维形态支撑(A)，大孔径PCL电纺棉被包绕于3D打印补片模型的表面(B)。将其整体移植到大鼠皮下。4周后取材(C)并拨出3D打印模型表面的组织，可得到与优化补片相同三维结构的组织工程肺动脉补片(D，E)。组织切片HE染色证实细胞长入和组织形成(F)。标尺：F-框图＝100μm。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1大孔径聚己内酯(PCL)电纺纤维的制备和二维血管补片的构建

原料：聚己内酯(PCL)，三氟乙醇(TFE)

设备：高压电源，微量注射泵、静电纺接收装置(镂空四骨架滚筒)

方法：

(1)溶液的配置——35％PCL静电纺溶液

以TFE为溶剂，用电子天平称取PCL颗粒，按35％(m/v)的溶质比例称量后转入可密封玻璃瓶。按1.386g/ml的密度用电子天平量取相应体积的TFE转入对应溶解瓶中。室温下反复翻转玻璃瓶促进PCL均匀溶解。持续翻转溶解3天后用于静电纺。配制好的溶液应于1周内用完。

(2)静电纺PCL纤维的制备

用10mL注射器吸取35％PCL静电纺溶液，换14G平口点胶针头。将注射器装载于微量注射泵，并安置使之悬于镂空四骨架滚筒接收装置的上方。调节高度，使针尖与接收装置之间的距离为6cm。将高压电源地极端连接于滚筒接收装置，电源高压端夹于针头金属部分。调节高压电源，使高压输出为16kV。调节微量注射泵注射速率为5ml/h。调节滚筒控制器，使滚筒旋转速率为2000rpm。静电纺初期，由于出丝尚不稳定，这部分电纺丝可收集于滚筒一端。待出丝稳定后，于滚筒中部接收电纺丝。接收过程中应不断缓慢左右移动滚动，使电纺丝在滚筒上以均匀的密度分布。本例收集1ml PCL/TFE溶液。

(3)一般的组织工程血管补片

为了探索上述PCL电纺纤维是否可以作为一般组织工程血管补片的支架，我们首先将上述PCL纤维沿同一方向反复层叠10次(层)，制备出“无细胞PCL电纺棉”。将PCL电纺棉用75％乙醇和紫外照射灭菌处理后，移植到大鼠皮下，待细胞长入和组织形成。4周后取出，得到自体血管补片。

无细胞PCL电纺棉片直接移植于大鼠背部皮下4周后，取材可见新生皮下组织形成。组织肉红色，质地均一，富有弹性，与周围其他组织靠疏松结缔组织分界。组织石蜡切片HE染色证明细胞已完全长入电纺棉片，并分泌大量细胞外基质，形成致密紧实的自体组织片。

实施例2患者血管补片的设计、虚拟手术和计算流体优化

以一例法洛四联症(ToF)患者为例说明(本例中，采用补片大小优化和成角优化)：

患儿一般情况：男，入院时11月龄，身长75cm，体重8.8kg。术前心脏超声显示ToF，其中肺动脉瓣及瓣下狭窄。瓣环直径0.61cm，总干内径0.63cm，流速5.23m/s。

患儿心血管MRI图像被用于肺动脉三维重建。蒙版的作用是指导计算机层叠图像蒙版所在的图像区域以完成三维重建，这里肺动脉所在部位被黄色蒙版标记。因为直接重建的图像表面粗糙，在尽量减少图像精度损失的前提下，完成重建图像的光滑处理。

根据临床经验公式计算出的瓣环扩大直径为10.7mm，首先设计出下列两种补片设计：补片①：按经验公式计算值的150％，即以16.0mm的瓣环直径作瓣环扩大；补片②：按肺动脉瓣环经验公式计算值10.7mm为直径作瓣环扩大。结合患者原始肺动脉形态进行流体计算。分析后可知，患者术前肺动脉瓣环较临床经验公式计算值小43％，肺总干血流流速总体高于4m/s，左右肺血流分配比约30:70。经过补片①扩大后，患者肺动脉总干流速降低，平均<2.0m/s，左右肺血流分配比约32:68。以补片②作虚拟手术计算结果显示，肺总干血流高于补片①组，低于术前组；然而，左右肺血流分配比保持不变，依然为32:68。

在确认以补片设计的基础上，为了研究肺动脉总干与左右肺血流分配比之间的关系，在补片②依据临床经验公式计算瓣环扩大直径的基础上，进一步设计出两种补片设计：补片③：肺动脉总干与左右肺动脉分支角度相当；补片④：肺动脉总干稍偏向右肺动脉。其中，原有补片②血管夹角关系与患者术前动脉间夹角关系一致，即肺动脉总干稍偏向左肺动脉。以上述补片设计为模板，整合入患者术前肺动脉完成虚拟手术规划。通过计算流体力学分析可以看出，三种针对角度的补片设计基本不影响肺动脉血流流速。然而，补片③行虚拟手术后左右肺动脉血流比例为40:60，补片④行虚拟手术后左右肺血流比例为43:57。

综合上述对瓣环补片扩大大小和肺动脉成角的虚拟手术及对应计算流体分析，我们认为补片④的设计是上述方案中的最优设计，因为不仅可以降低肺动脉血流速度，缓解肺动脉梗阻，还使左右肺血流分配比接近正常生理条件下的分配比例(45:55)。此后以补片④的设计方案完成实验。

实施例3基于计算流体力学优化的个体化组织工程血管补片的构建

将上述计算流体力学分析优化的瓣膜设计模型(即补片④)用3D打印机打印出来，作为个体化组织工程肺动脉补片构建的内核。由于本例实验中以大鼠为移植对象，因此打印的补片模型等比例缩小至长轴为2.0cm。将静电纺PCL电纺丝包裹于3D打印补片表面，大鼠皮下移植4周可见3D打印表面已完全包裹自体组织。撤去3D打印补片内核，可见基于PCL电纺棉支架形成的组织完全按照3D打印补片的形态生长，初步实现了个体化组织工程补片的构建。

此外，为了实现个体化组织工程血管补片的构建，还可以使用自体细胞接种、干细胞接种等方法，在体内外培养实现组织形成，最终构建出具有优化三维形态特征的补片组织。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。