本发明属于生物医用膜材料制备领域，特别涉及一种原位制备改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜的方法。
背景技术：
羟基磷灰石(简称HAP)分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，隶属于六方晶系。其具有良好的生物相容性，能够引导骨组织再生，主要存在于人骨和牙齿中，是医学上应用极为广泛的生物材料。人体骨骼中存在的并非是纯的HAP，还有其他一些阳离子。通过向HAP中引入锌、镁、锶、铬、钼等人体微量元素可以更大程度的模拟自然骨。聚乙烯醇(简称PVA)是一种可完全生物降解的水溶性高分子材料，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，在眼科、伤口敷料和人工关节等方面具有广泛应用。将改性后的羟基磷灰石和聚乙烯醇原位合成得到的生物膜，兼具聚乙烯醇的柔、韧等高分子特性，和羟基磷灰石的强、刚等无机特性。且通过交联剂对聚乙烯醇的原位交联，能有效提高生物膜的强度、耐热、耐溶剂等性能。
目前，对羟基磷灰石进行原位改性和对聚乙烯醇用交联剂进行原位交联已有一些文献和专利进行报道，例如，周宏卉利用锌、镁等元素对羟基磷灰石进行改性，研究了这些微量元素对羟基磷灰石结构和性能的影响(周宏卉.改性羟基磷灰石制备及结构表征[D].四川大学,2007.)；Eiji Fujii等人制备了掺锌的HAP晶体粉末，研究了掺锌量的多少对HAP表面形貌和晶体结构的影响，探究了ZnHAP对蛋白选择性吸附的能力(Eiji Fujii,Mizuki Ohkubo,Kanji Tsuru et al.Selective protein adsorption property and characterization of nano-crystalline zinc-containing hydroxyapatite[J].Acta Biomaterialia 2(2006)69–74)；Wang等人制备了PVA交联膜，并探究了其对蛋白质的吸附性能(Xiaoliang Wang,Qiuxia Fu,Xueqin Wang et al.In situ cross-linked and highly carboxylated poly(vinyl alcohol)nanofibrous membranes for efficient adsorption of proteins[J].J.Mater.Chem.B,2015,3,7281-7290)。但是，目前尚未有文献报道利用原位生成改性羟基磷灰石/聚乙烯醇溶液，后采用静电纺丝技术来制备用于蛋白质吸附的纳米复合膜。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种原位制备改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜的方法，该方法解决了HAP粒子在膜制备过程中易团聚的问题，通过交联剂的原位交联很好地提高了复合膜的强度、耐热性和耐溶剂等性能，并采用静电纺丝技术使得生物膜具有纳米级别的结构，使其拥有很好的生物特性和对蛋白质的吸附性能。
本发明的一种原位制备改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜的方法，包括：
(1)将掺杂硝酸盐的硝酸钙溶液在搅拌条件下滴加到聚乙烯醇的水溶液中，然后滴加磷酸氢二铵溶液，钙磷比为1.67，40-70℃下搅拌12～24h，原位生成掺杂改性羟基磷灰石/聚乙烯醇溶液；然后加入马来酸酐和催化剂，搅拌4～6h，得到混合溶液；其中，马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为5-50：100；聚乙烯醇与掺杂硝酸盐的硝酸钙的质量比为90:10～50:50；掺杂改性纳米羟基磷灰石中掺杂金属元素的质量分数为0.1～6.4％；
(2)将步骤(1)中的混合溶液进行静电纺丝，将得到的膜烘干，得到原位制备的改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。
所述步骤(1)中硝酸盐为硝酸镁，硝酸锶，硝酸锌，硝酸钼和硝酸铬中的至少一种。
所述硝酸盐溶液和硝酸钙溶液浓度为0.1～0.5mol/L。
掺杂硝酸盐的目的是为了更大程度地模拟自然骨，从模拟生物矿化的思路出发，对纯的羟基磷灰石进行改性，从而使得制备的改性羟基磷灰石具有更好的性能。
所述步骤(1)掺杂金属元素占HAP的质量分数，不包含Ca。
所述步骤(1)中磷酸氢二铵溶液浓度为0.1～0.3mol/L。
所述步骤(1)中掺杂硝酸盐的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液均用质量分数为28％的氨水溶液调节pH值为10～11。
所述步骤(1)中聚乙烯醇的水溶液的质量分数为5～20％。
所述步骤(1)中掺杂硝酸盐的硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液的滴加速度为0.5～3mL/min。
所述步骤(1)中催化剂为多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，加入量为聚乙烯醇质量的0.1-0.5％。
所述步骤(1)中聚乙烯醇与改性硝酸钙的质量比为90/10、80/20、70/30、60/40或50/50。
所述步骤(2)中静电纺丝的参数为：外加电压20-40KV，加料速度0.5-1.5mL/h，纺丝温度25-45℃，纺丝湿度30-50％，滚筒的转速为100-200rpm。
所述步骤(2)中烘干的条件为：烘干温度为70-100℃，烘干的时间为1-4h。
所述步骤(2)中通过原位生成的掺杂改性纳米羟基磷灰石在原位交联制得的膜内部具有很好的分散性和稳定性，同时兼具良好的生物相容性，能用来分离吸附多种蛋白质、生物酶以及其它生物制品。
本发明的实现过程如下：配置一定浓度的硝酸盐溶液、硝酸钙溶液以及磷酸氢二铵溶液，并用氨水调节其pH值。按一定比例将硝酸盐类溶液和硝酸钙溶液混合均匀。而后在搅拌作用下将掺杂的硝酸钙溶液加入到聚乙烯醇的水溶液中，在一定温度下，朝混合溶液中逐滴加入一定量的磷酸氢二铵溶液原位生成掺杂改性纳米羟基磷灰石，持续搅拌24h。在反应所得的溶液中加入一定量的马来酸酐粉末，以及作为反应催化剂的多磷酸使聚乙烯醇产生原位交联，持续搅拌4h后得到混合溶液，并用溶液进行静电纺丝，将得到的膜放入烘箱中烘干后，即得到掺杂改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。
与现有技术相比，本发明利用原位生成和原位交联，并通过静电纺丝制备得到生物膜，羟基磷灰石在聚合物基体内具有很好的分散性，并且对多种蛋白质的分离具有良好的吸附选择性。
本发明采用原位合成和原位交联的方法，有效解决了无机粒子在复合膜中的团聚问题，使得HAP能分散均匀，从而使最终得到的膜均一、稳定。此外，利用静电纺丝技术制备得到的生物膜具备纳米级的分子结构，应用前景广阔。
有益效果
(1)本发明采用原位合成的方法制备改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜，使无机粒子能够均匀分散，膜的最终性能均一、稳定，改善了无机粒子和聚乙烯醇之间的界面相容性；对多种蛋白质的分离具有良好的吸附选择性；
(2)本发明对羟基磷灰石进行了掺杂改性，通过调节掺杂元素量的多少，改变羟基磷灰石的晶体结构和表面形貌，来获得高生物活性和相容性的生物膜；
(3)本发明利用交联剂来对聚乙烯醇进行原位交联，提高了最终生物膜的强度、耐热、耐溶剂等性能；
(4)本发明采用静电纺丝技术来加工反应得到的混合液，得到具有纳米级别的生物膜；
(5)本发明所生成的纳米复合膜能用来分离吸附多种蛋白质、生物酶以及其它生物制品，在蛋白质吸附领域有潜在的应用前景；
(6)本发明中通过改性HAP得到的复合膜更加贴近于人体自然骨的成分，具有很好的生物活性和生物相容性，其对蛋白的吸附能力比纯HAP优异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
配置0.5mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液、0.5mol/L的Sr(NO3)2溶液以及0.3mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至10。将47.775mL的Ca(NO3)2·4H2O溶液和0.975mL的Sr(NO3)2溶液混合均匀，得到掺杂Sr(NO3)2的硝酸钙溶液。而后在搅拌作用下以0.5mL/min的滴加速度将掺杂的硝酸钙溶液加入到5wt％的聚乙烯醇(取9.789g)水溶液中，在40℃下，以1mL/min的速度向混合溶液中滴加0.3mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌12h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为5：100)，以及质量分数为0.1％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压20KV，加料速度0.5mL/h，纺丝温度30℃，纺丝湿度40％，滚筒的转速为100rpm)，将得到的膜放入70℃的烘箱中烘干4h后，即得到改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。所述改性羟基磷灰石中所掺杂金属的质量分数为1.29％，其对LZ的吸附量为41.7mg/g，对BSA的吸附量为13.8mg/g，LZ/BSA吸附选择性为3.0。
实施例2
配置0.33mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液、0.33mol/L的Mg(NO3)2·6H2O溶液以及0.2mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至10。将46.8mL的Ca(NO3)2·4H2O溶液和1.95mL的Mg(NO3)2·6H2O溶液混合均匀，得到掺杂Mg(NO3)2的硝酸钙溶液。而后在搅拌作用下以1mL/min的滴加速度将掺杂的硝酸钙溶液加入到10wt％的聚乙烯醇(取9.838g)水溶液中，在70℃下，以2mL/min的速度向混合溶液中滴加0.2mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌24h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为10：100)，以及质量分数为0.3％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压30KV，加料速度0.6mL/h，纺丝温度40℃，纺丝湿度45％，滚筒的转速为100rpm)，将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。所述改性羟基磷灰石中所掺杂金属的质量分数为2.56％，其对LZ的吸附量为68.1mg/g，对BSA的吸附量为26.6mg/g，LZ/BSA吸附选择性为2.6。
实施例3
配置0.1mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液、0.1mol/L的Zn(NO3)2·6H2O溶液以及0.06mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至10。将45.825mL的Ca(NO3)2·4H2O溶液和2.925mL的Zn(NO3)2·6H2O溶液混合均匀，得到掺杂Zn(NO3)2的硝酸钙溶液。而后在搅拌作用下以1.5mL/min的滴加速度将掺杂的硝酸钙溶液加入到12wt％的聚乙烯醇(取9.9352g)水溶液中，在60℃下，以3mL/min的速度向混合溶液中滴加0.06mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌18h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为15：100)，以及质量分数为0.4％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压25KV，加料速度0.7mL/h，纺丝温度45℃，纺丝湿度35％，滚筒的转速为150rpm)，将得到的膜放入90℃的烘箱中烘干2h后，即得到改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。所述改性羟基磷灰石中所掺杂金属的质量分数为3.83％，其对LZ的吸附量为57.4mg/g，对BSA的吸附量为21.2mg/g，LZ/BSA吸附选择性为2.7。
实施例4
配置0.17mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液、0.17mol/L的Mo(NO3)3·5H2O溶液以及0.1mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至11。将44.85mLCa(NO3)2·4H2O溶液和3.9mL的Mo(NO3)3·5H2O溶液混合均匀，得到掺杂Mo(NO3)3的硝酸钙溶液。而后在搅拌作用下以1.2mL/min的滴加速度将掺杂的硝酸钙溶液加入到20wt％的聚乙烯醇(取9.984g)水溶液中，在60℃下，以1.5mL/min的速度向混合溶液中滴加0.1mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌24h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为20：100)，以及质量分数为0.5％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压35KV，加料速度0.9mL/h，纺丝温度40℃，纺丝湿度38％，滚筒的转速为200rpm)，将得到的膜放入80℃的烘箱中烘干3h后，即得到改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。所述改性羟基磷灰石中所掺杂金属的质量分数为5.08％，其对LZ的吸附量为51.9mg/g，对BSA的吸附量为30.1mg/g，LZ/BSA吸附选择性为1.7。
实施例5
配置0.5mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液、0.5mol/L的Cr(NO3)3·9H2O溶液以及0.3mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至10。将43.875mLCa(NO3)2·4H2O溶液和4.875mL的Cr(NO3)3·9H2O溶液混合均匀，得到掺杂Cr(NO3)3的硝酸钙溶液。而后在搅拌作用下以2mL/min的滴加速度将掺杂的硝酸钙溶液加入到16wt％的聚乙烯醇(取10.0328g)水溶液中，在85℃下，以2.5mL/min的速度向混合溶液中滴加0.3mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌24h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为30：100)，以及质量分数为0.2％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压40KV，加料速度1.5mL/h，纺丝温度30℃，纺丝湿度42％，滚筒的转速为100rpm)，将得到的膜放入90℃的烘箱中烘干1h后，即得到改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。所述改性羟基磷灰石中所掺杂金属的质量分数为6.32％，其对LZ的吸附量为45.7mg/g，对BSA的吸附量为21.0mg/g，LZ/BSA吸附选择性为2.2。
实施例6
配置0.5mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液、0.5mol/L的Sr(NO3)2溶液以及0.3mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至10。将48.694mL的Ca(NO3)2·4H2O溶液和0.056mL的Sr(NO3)2溶液混合均匀，得到掺杂Sr(NO3)2的硝酸钙溶液。而后在搅拌作用下以0.5mL/min的滴加速度将掺杂的硝酸钙溶液加入到5wt％的聚乙烯醇(取9.789g)水溶液中，在40℃下，以1mL/min的速度向混合溶液中滴加0.3mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌12h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为25：100)，以及质量分数为0.1％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压20KV，加料速度0.5mL/h，纺丝温度30℃，纺丝湿度40％，滚筒的转速为100rpm)，将得到的膜放入70℃的烘箱中烘干4h后，即得到改性羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。制得的纳米羟基磷灰石所掺杂金属的质量分数为0.1％，其对LZ的吸附量为44mg/g，对BSA的吸附量为30mg/g，LZ/BSA吸附选择性为1.5。
对比例1
配置0.33mol/L的Ca(NO3)2·4H2O溶液以及0.2mol/L的磷酸氢二铵溶液各50mL，并用28wt％的氨水调节其pH值至10.5。将48.75mL的Ca(NO3)2·4H2O溶液在搅拌作用下加入到20wt％的聚乙烯醇(取9.838g)水溶液中，在60℃下，以2mL/min的速度向混合溶液中滴加0.2mol/L磷酸氢二铵溶液48.75mL，持续搅拌24h。在反应所得的溶液中加入马来酸酐粉末(马来酸酐与聚乙烯醇的摩尔比为50：100)，以及质量分数为0.1％(相对于聚乙烯醇)的反应催化剂多磷酸(即聚磷酸H6P4O13)，持续搅拌4h后对溶液进行静电纺丝(外加电压38KV，加料速度1.5mL/h，纺丝温度45℃，纺丝湿度30％，滚筒的转速为150rpm)，将得到的膜放入100℃的烘箱中烘干1h后，即得到羟基磷灰石/聚乙烯醇纳米复合膜。所述羟基磷灰石中所掺杂金属的质量分数为0，其对LZ的吸附量为44.5mg/g，对BSA的吸附量为31.2mg/g，LZ/BSA吸附选择性为1.4。