本发明涉及丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体属于中药提取物
技术领域：
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背景技术：
：绿脓杆菌(P.aeruginosa)或称铜绿色假单胞菌，是一种致病力较低但抗药性强的杆菌。广泛存在于自然界，是伤口感染较常见的一种细菌，能引起化脓性病变。感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，故名。绿脓杆菌(P.aeruginosa)属假单胞菌属(pseudomonas)，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。绿脓杆菌作为一种非革兰氏阴性细菌普遍存在人的生活环境中，很容易感染人群，如烧伤的人感染绿脓杆菌后易得败血症，插管患者易患尿道感染等。丹参是一位非常重要且历史悠久的中药，已被列入2015版《中国药典》，《美国药典》，《欧洲药典》中。丹参具有明显抗氧化，抗菌，抗凝血药理性能，被广泛应用于预防炎症和治疗心脑血管疾病，丹参的化学成分主要分为水溶性和脂溶性成分。现有技术中，尚未有将丹参提取物应用到制备抗绿脓杆菌药物的相关报道。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种丹参提取物的应用，即将丹参提取物应用到制备抗绿脓杆菌药物中。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，应用方法为取丹参提取物制备成口服制剂、注射制剂或外用制剂；具体制备成为：片剂、口腔崩解片剂、分散片剂、胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、注射剂、冻干粉针剂、舌下片剂、涂膜剂、鼻腔吸入剂、透皮制剂、颗粒剂、凝胶剂、丸剂、微丸剂、浓缩丸、气雾剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、速释制剂、靶向制剂、口服液体制剂、糖浆剂、散剂或合剂。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，具体应用方法为：取10～20g氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液500～600mL，加丹参提取物，于60～70℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入余量的注射用水至1000mL，混匀后用0.22μm滤膜过滤，滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得注射剂。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，注射剂中丹参提取物的浓度为1000～1200μg/mL。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，具体应用方法为：取丹参提取物25～30g加适量乙醇溶解，补充注射用水至3000mL，用碳酸钠溶液调节pH值至6.0～8.0，加入25～28g甘露醇和52～55g乳糖使其完全溶解，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只3mL进行分装，冷冻干燥，封口，即得冻干粉针剂。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，具体应用方法为：取20～25g聚乙二醇6000，置于容器中，加热至70～80℃，待全部熔融，随后温度降到50℃时，加入11～15g丹参提取物使熔融，将温度控制在40～50℃，倒入滴丸机中滴制，滴入二甲基硅油中，制成滴丸，即得。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，具体应用方法为：取PVA-9010～20g加入200～220mL蒸馏水和50～60mL甘油中充分膨胀，水浴加热使其完全溶解，加入冰片1～2g、薄荷脑2～3g和丹参提取物2～3g，边加边搅拌，溶解后加乙醇至200mL，搅拌均匀，即得涂膜剂。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，具体应用方法为：取30～35g明胶加入反应罐中，在搅拌状态下加入适量水，密闭，待明胶完全溶解后，再加入22～25g甘油，搅拌均匀，抽真空脱气2小时，放入保温桶中，保温静置12h，待用；取30～35g大豆油、15～20g卵磷脂和2～5g蜂蜡混合均匀，称取15～18g丹参提取物加入，搅拌均匀，研磨至胶体状，室温静置；将药液倒入软胶囊机中，压制软胶囊，干燥，即得。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.2～0.3g，加入5％甲醇20mL～30mL，超声25min～35min，以10000rpm速度离心10～15min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。进一步地，前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.2g，加入5％甲醇20mL，超声30min，以10000rpm速度离心10min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。前述丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用中，丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.2～0.3g，加入20％～30％乙醇40mL～50mL进行渗漉，控制流速5mL/s，渗漉液回收乙醇至20～25mL，取上清液以10000rpm速度离心10～15min，再取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。为确保本发明技术方案的科学、有效、合理，发明人进行了一系列的实验研究。本发明选用涂膜剂作为样品。一、实验材料和仪器1.1、材料丹参为贵州省信邦公司提供的样品。所有样品均在-20℃保存。绿脓杆菌(ATCC27853)为解放军第302医院微生物中心提供。SD大鼠来源贵州信邦远东制药有限公司动物房提供，自然喂养，随机分组。其余试剂均为市售产品。1.2、仪器采用瑞典产的3114/3226型生物活性检测系统，岛津HPLC配备LC-20AT四元梯度泵，SPD-M20A二级阵列管检测器。色谱柱为5C18-PAQ(5μm，250mm×4.6mm，COSMOSIL，日本)。二、样品的制备2.1、丹参提取物的制备精密称取丹参干燥样品0.2～0.3g，加入5％的甲醇20mL～30mL，超声25min～35min，以10000rpm速度离心10～15min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得丹参提取物。2.2、本发明样品的制备取PVA-9010g加入200mL蒸馏水和50mL甘油中充分膨胀，水浴加热使其完全溶解，加入冰片1g、薄荷脑2g和丹参提取物3g，边加边搅拌，溶解后加乙醇至200mL，搅拌均匀，即得涂膜剂。2.3、对照品的制备取甲壳胺2g，加醋酸溶解，得Ⅰ液，取PVA(04-86)6g，加蒸馏水溶解得Ⅱ液。取诺氟沙星1.0g，用适量乳酸溶解，加Ⅰ液50mL，Ⅱ液20mL，搅匀，用氢氧化钠溶液调pH值6.5左右，加乙醇至100mL，搅匀，即得诺氟沙星涂膜剂对照品。三、样品性能实验方法3.1、含量测定方法取本发明样品，用5％甲醇溶液稀释至适当浓度(0.5μg/mL～10μg/mL)，在272nm波长处测定吸收度，通过标准曲线计算含量。3.2、动物实验将36只SD大鼠随机分为3组，第1～3组分别为生理盐水组、本发明样品组、诺氟沙星涂膜剂组。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30mg·kg-1)麻醉，背部脱毛，浸入100℃沸水浴中持续烫伤15S，造成15％的Ⅲ级烫伤。伤后10min取绿脓杆菌菌液(1×109CFU/mL)1mL，分两次均匀涂布在创面上。染菌后4h涂药，每日3次，生理盐水组、本发明样品组和诺氟沙星涂膜剂组均每次涂药1mL。用药后48h与120h，每组分别取6只大鼠，乙醚麻醉后在无菌操作下，活检取材行痂下组织细菌计数。痂下组织细菌定量取痂下组织100mg，加林格液2mL匀浆，取匀浆液进行一系列10倍梯度稀释后，定量接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，将平板置于37℃温箱中孵育24h，选择典型菌落计算菌量。标本含菌量(CFU/g组织)＝(标本重量+2)/标本重量×菌落数×释释倍数×1/取样量3.3、体外药敏试验在接种绿脓杆菌的Muller-Hinton琼脂平板上均匀挖3个孔，每孔注入生理盐水，本发明样品和诺氟沙星涂膜剂各25mg，在37℃条件下培养24h，观察抑菌环大小。实验重复3次，取其平均值。四、样品性能实验结果4.1、含量测定对同一批次的样品进行6次测定，RSD值为0.65％。回收率试验结果表明平均回收率为99.78％，RSD为0.68％。对样品进行含量测定(n＝6)，RSD分别为0.59％、0.62％、0.57％、0.61％、0.65％、0.60％，表明含量测定方法快速准确、重现性好。4.2、动物实验疗效观察用药后1～2d，3组创面均较干燥。生理盐水组创面有绿色斑点；本发明样品组创面呈白色，弹性好；涂膜剂组创面呈浅黄色。用药3～5d，生理盐水组创面脱痂腐烂；诺氟沙星涂膜剂组脱痂后形成又厚又硬的药痂，本发明样品组无溃烂或坏死斑。痂下组织细菌定量结果见表1、表2。表1用药48h后各组动物痂下组织细菌计数(CFU·g-1)动物生理盐水组本发明样品组诺氟沙星涂膜剂组13.6×1051.1×1038.0×10324.6×1051.5×1034.7×10335.7×1050.9×1035.6×10342.8×1052.1×1036.9×10354.2×1050.5×1037.7×10363.8×1050.7×1035.9×103表2用药120h后各组动物痂下组织细菌计数(CFU·g-1)实验数据取对数值进行方差分析，结果表明，用药48h和用药120h后各组动物痂下组织菌量有非常显著差异(P<0.01)；用药48h与120h两个时相点各组动物痂下组织菌量有非常显著差异(P<0.001)。4.3、体外药敏试验结果结果如表3所示。生理盐水组无抑菌作用，本发明样品组的抑菌作用强于诺氟沙星涂膜剂组，两组间差异显著(P<0.01)。表3体外抑菌环(mm，x±s，n＝10)五、丹参提取物活性成分研究5.1、指纹图谱5.1.1、样品准备与项目2.1下相同。5.1.2、色谱条件1％的甲酸水的流动相组成(洗脱液A)和乙腈(洗脱液B)在使用前通过超声波除气。流量为1.0mL/min，以下为梯度程序:0.01～15min，A︰B＝93～89︰7～11；15～27min，A︰B＝89～74︰11～26；27～55min，A︰B＝74～73︰26～27；55～75min，A︰B＝73～60︰27～40；75～105min，A︰B＝60～0︰40～100；105～113min，A︰B＝0～93︰100～7。检测波长被设定为284nm。5.1.3方法学考察精密度，稳定性，重复性实验表明分析物的相对标准偏差分别小于8.79％，8.28％和6.82％，证明建立的指纹图谱分析方法具有较好的精密度和稳定性、重复性。5.1.4建立HPLC指纹图谱在优化的色谱条件下，选用不同批次丹参根据上述的方法制样，并进样HPLC系统。在系统运行时间内出现共有峰和识别18个相同的特征峰。与对照指纹图谱的相似系数均较高。5.2、抑制率5.2.1、微量热分析的样品制备精密称取丹参干燥样品0.2～0.3g，加入5％甲醇20mL～30mL，超声25min～35min，以10000rpm速度离心10～15min，取上清液，用水浴锅蒸干，将浸膏用培养基配成浓度为1000μg/mL溶液，将其在-4℃保存。5.2.2、绿脓杆菌的生长代谢的热谱曲线绿脓杆菌在密封的安瓿瓶中生长，在有限的营养物质和氧气的作用下产生的生长代谢的热谱曲线可分为五个生长阶段：停滞期，第一指数生长期，稳定期，第二指数生长期和衰亡期。丹参样品对绿脓杆菌的抑制效果的定量描述，可以按照以下公式：I＝[(k(2,0)-k(2,s))/k(2,0)]×100％其中，k(2，0)是空白组的第二指数生长期的生长速率常数和k(2，s)是加入提取物实验组的第二指数生长期的生长速率常数。抑制率(I)作为评价丹参抑菌效果的重要指数，I的值越高，丹参的抑菌效果越好。5.3结论以抑制率I的平方根为因变量Y，18共有峰的峰面积值为自变量X，采用多元线性分析(mLRA)建立化学指纹图谱上共有色谱峰峰面积与对绿脓杆菌生长抑制率的关系，其多元线性回归方程如下：Y＝-8.918×10-17+0.212x1-0.096x2+0.329x3+0.535x4-0.391x5+0.12x6-0.234x7+0.483x8-0.150x9-0.055x10-0.141x11-0.183x12+0.603x13-0.143x14+0.270x15+0.124x16+0.506x17-0.663x18上述方程显示，18个峰对于抗绿脓杆菌活性的贡献率存在较大差异。结果表明原儿茶醛(峰值4)、丹酚酸B(峰值13)和三种未知成分(峰值8、峰值17、峰18)可能是丹参抗绿脓杆菌的主要生物活性成分。本发明的有益之处在于：本发明提供了一种丹参提取物的应用，即将丹参提取物用于制备抗绿脓杆菌药物中。采用本发明的丹参提取物在创面保护和修复方面明显优于现有技术中抗绿脓杆菌药物。动物实验和体外药敏试验表明，丹参提取物具有较强的抗绿脓杆菌功效，能够有效保护创面，抗菌性能稳定，作用效果持久。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。实施例1丹参提取物的制备丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.28g，加入5％甲醇30mL，超声25min，以10000rpm速度离心12min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。实施例2丹参提取物的制备丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.3g，加入5％甲醇25mL，超声35min，以10000rpm速度离心15min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。实施例3丹参提取物的制备丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.2g，加入5％甲醇20mL，超声30min，以10000rpm速度离心10min，取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。实施例4丹参提取物的制备丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.2g，加入30％乙醇40mL进行渗漉，控制流速5mL/s，渗漉液回收乙醇至25mL，取上清液以10000rpm速度离心10min，再取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。实施例5丹参提取物的制备丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.3g，加入20％乙醇50mL进行渗漉，控制流速5mL/s，渗漉液回收乙醇至20mL，取上清液以10000rpm速度离心15min，再取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。实施例6丹参提取物的制备丹参提取物通过以下步骤制备：精密称取丹参干燥样品0.25g，加入25％乙醇45mL进行渗漉，控制流速5mL/s，渗漉液回收乙醇至22mL，取上清液以10000rpm速度离心13min，再取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，冷冻干燥，-4℃下保存即得。实施例7丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取10g氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液500mL，加实施例1中丹参提取物，于60℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入余量的注射用水至1000mL，混匀后用0.22μm滤膜过滤，滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得注射剂，注射剂中丹参提取物的浓度为1000μg/mL。用法为：肌内注射，一次2～4ml，1次/日。实施例8丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取15g氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液550mL，加实施例2中丹参提取物，于65℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入余量的注射用水至1000mL，混匀后用0.22μm滤膜过滤，滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得注射剂，注射剂中丹参提取物的浓度为1200μg/mL。用法为：肌内注射，一次2～4ml，1次/日。实施例9丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取20g氯化钠溶解至20％丙二醇水溶液600mL，加实施例3中丹参提取物，于70℃水浴上搅拌至全溶，冷却至室温，加入余量的注射用水至1000mL，混匀后用0.22μm滤膜过滤，滤液分瓶灌装，封口，灭菌，即得注射剂，注射剂中丹参提取物的浓度为1100μg/mL。用法为：肌内注射，一次2～4ml，1次/日。实施例10丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取实施例4中丹参提取物25g加适量乙醇溶解，补充注射用水至3000mL，用碳酸钠溶液调节pH值至6.0，加入25g甘露醇和52g乳糖使完全溶解，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只3mL进行分装，冷冻干燥，封口，即得冻干粉针剂。用法为：静脉滴注，每次1支(用5％葡萄糖注射液100～200ml稀释后使用)，一日1次。实施例11丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取实施例5中丹参提取物26g加适量乙醇溶解，补充注射用水至3000mL，用碳酸钠溶液调节pH值至7.0，加入28g甘露醇和53g乳糖使完全溶解，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只3mL进行分装，冷冻干燥，封口，即得冻干粉针剂。用法为：静脉滴注，每次1支(用5％葡萄糖注射液100～200ml稀释后使用)，一日1次。实施例12丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取实施例6中丹参提取物30g加适量乙醇溶解，补充注射用水至3000mL，用碳酸钠溶液调节pH值至8.0，加入27g甘露醇和55g乳糖使完全溶解，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只3mL进行分装，冷冻干燥，封口，即得冻干粉针剂。用法为：静脉滴注，每次1支(用5％葡萄糖注射液100～200ml稀释后使用)，一日1次。实施例13丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取20g聚乙二醇6000，置于容器中，加热至70℃，待全部熔融，温度降到50℃时，加入11g实施例6中丹参提取物使熔融，将温度控制在40℃，倒入滴丸机中滴制，滴入二甲基硅油中，制成滴丸，即得。用法为：一次10丸，一日3次，4周为一个疗程。实施例14丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取22g聚乙二醇6000，置于容器中，加热至75℃，待全部熔融，温度降到50℃时，加入12g实施例5中丹参提取物使熔融，将温度控制在45℃，倒入滴丸机中滴制，滴入二甲基硅油中，制成滴丸，即得。用法为：一次10丸，一日3次，4周为一个疗程。实施例15丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取25g聚乙二醇6000，置于容器中，加热至80℃，待全部熔融，温度降到50℃时，加入15g实施例4中丹参提取物使熔融，将温度控制在50℃，倒入滴丸机中滴制，滴入二甲基硅油中，制成滴丸，即得。用法为：一次10丸，一日3次，4周为一个疗程。实施例16丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取PVA-9010g加入210mL蒸馏水和50mL甘油中充分膨胀，水浴加热使其完全溶解，加入冰片2g、薄荷脑2.5g和实施例1中丹参提取物2.8g，边加边搅拌，溶解后加乙醇至200mL，搅拌均匀，即得涂膜剂。用法为：涂在患处，一日2-3次。实施例17丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取PVA-9015g加入200mL蒸馏水和55mL甘油中充分膨胀，水浴加热使其完全溶解，加入冰片1g、薄荷脑2g和实施例2中丹参提取物3g，边加边搅拌，溶解后加乙醇至200mL，搅拌均匀，即得涂膜剂。用法为：涂在患处，一日2-3次。实施例18丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取PVA-9020g加入220mL蒸馏水和60mL甘油中充分膨胀，水浴加热使其完全溶解，加入冰片1.5g、薄荷脑3g和实施例3中丹参提取物3g，边加边搅拌，溶解后加乙醇至200mL，搅拌均匀，即得涂膜剂。用法为：涂在患处，一日2-3次。实施例19丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取30g明胶加入反应罐中，在搅拌状态下加入适量水，密闭，待明胶完全溶解后，再加入25g甘油，搅拌均匀，抽真空脱气2小时，放入保温桶中，保温静置12h，待用；取32g大豆油、15g卵磷脂和2g蜂蜡混合均匀，称取15g实施例5中丹参提取物加入，搅拌均匀，研磨至胶体状，室温静置；将药液倒入软胶囊机中，压制软胶囊，干燥，即得。用法为：口服，一次2～4粒，一日2次。实施例20丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取33g明胶加入反应罐中，在搅拌状态下加入适量水，密闭，待明胶完全溶解后，再加入22g甘油，搅拌均匀，抽真空脱气2小时，放入保温桶中，保温静置12h，待用；取35g大豆油、18g卵磷脂和5g蜂蜡混合均匀，称取16g实施例6中丹参提取物加入，搅拌均匀，研磨至胶体状，室温静置；将药液倒入软胶囊机中，压制软胶囊，干燥，即得。用法为：口服，一次2～4粒，一日2次。实施例21丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的应用，具体应用方法为：取35g明胶加入反应罐中，在搅拌状态下加入适量水，密闭，待明胶完全溶解后，再加入23g甘油，搅拌均匀，抽真空脱气2小时，放入保温桶中，保温静置12h，待用；取30g大豆油、20g卵磷脂和4g蜂蜡混合均匀，称取18g实施例4中丹参提取物加入，搅拌均匀，研磨至胶体状，室温静置；将药液倒入软胶囊机中，压制软胶囊，干燥，即得。用法为：口服，一次2～4粒，一日2次。丹参提取物在制备抗绿脓杆菌药物中的具体应用方法还可为取实施例1～6中丹参提取物制备成片剂、口腔崩解片剂、分散片剂、胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、注射剂、冻干粉针剂、舌下片剂、涂膜剂、鼻腔吸入剂、透皮制剂、颗粒剂、凝胶剂、丸剂、微丸剂、浓缩丸、气雾剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、速释制剂、靶向制剂、口服液体制剂、糖浆剂、散剂或合剂。当前第1页1 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