本发明涉及一种丹参提取物、一种抗肿瘤药物、及丹参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重危害人类健康及生命的常见病，其死亡率居各种疾病之首。世界每年约有500万人因患恶性肿瘤而被夺去生命。目前治疗肿瘤的主要手段包括手术、放疗、化疗，但由于化疗药物对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差，在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时，亦严重损伤生长相当活跃的正常细胞，并对机体的重要器官如心、肝、肾、肺及神经系统等产生一定的毒副作用，对机体的免疫产生抑制作用。正因上述的各种原因，使世界上许多国家的科学家们逐步把研究重心移向中药方面。
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根及根茎，是最常用的活血化瘀中药之一，首载于《神农本草经》，具有祛瘀止痛、养血安神的功效，主要用于心血管疾病的治疗，随着对丹参药物研究的深入，丹参用于肿瘤治疗的研究报道逐年增多。
目前已发现的丹参的化学成分主要分为脂溶性二萜醌类化合物(主要是丹参酮、丹参酮IIA、隐丹参酮等)和水溶性酚酸类化合物(主要是丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸及甲酯、丹酚酸A，B，C等)两大类。已发表的文献对于丹参酮类化合物的抗肿瘤研究较多，这一类的化合物在乙醇中的溶解性较好，因此目前国内公开的丹参酮提取工艺都是用乙醇先对丹参粗提再对粗提取物进行精制得到丹参酮单体或混合提取物。该方法提取工艺复杂，成本较高。并且这些丹参酮类化合物抗肿瘤的效果差、溶解性低，很难在人体中达到对抗肿瘤的有效剂量。因此虽在众多的文献报道上能看到丹参具有良好的抗肿瘤作用，但至今未能开发成可应用于临床的抗肿瘤药物。
技术实现要素：
为弥补现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种具有抗肿瘤作用的丹参提取物，该丹参提取物抗肿瘤效果明显优于目前普遍使用的丹参醇提物以及丹参酮ⅡA等化合物，并且制备方法简单，溶解性好，具有更好的成药性。
本发明为达到上述目的采用的技术方案如下：
一种丹参提取物，其制备包括如下步骤：取丹参，向其中加入有机溶剂进行提取得提取液，对提取液进行过滤，对滤液进行浓缩、干燥，得提取物；所述有机溶剂包括乙醚、石油醚、氯仿、丙酮中的至少一种，其中优选乙醚和石油醚中的至少一种。
所述提取方式包括超声提取、回流提取、超临界萃取或微波提取，其中优选超声提取和回流提取。
作为一种具体实施方式，所述有机溶剂的用量为丹参质量的2-20倍，优选5-8倍。
作为一种优选方案，所述提取的温度为20～90℃。
作为进一步的优选方案，所述提取的时间为0.5h～8h，其中优选0.75h-3h；优选的，所述提取的次数为1～4次，其中优选2-3次。
作为一种具体实施方式，还包括对提取液进行浓缩，向浓缩物中加入辅料并混匀，然后挥干至干燥的步骤。所述辅料包括但不限于淀粉、硬脂酸镁等药学上接受的辅料。
本发明还提供上文所述的丹参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。上文所述的丹参提取物具有制备工艺简单，溶解性好，药效显著，而且还具有抗肿瘤作用。
所述肿瘤包括但不限于肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌或乳腺癌。
本发明还提供一种抗肿瘤药物，其药效成分包括丹参提取物，所述丹参提取物为丹参通过乙醚、石油醚、氯仿、丙酮中的至少一种溶剂提取所得。优选为石油醚和乙醚中的至少一种。所述药效成分可只含有丹参提取物，也不排除和其他药物组合。
本发明提出的丹参提取物的制备方法，首次采用石油醚、乙醚作为提取溶剂，使用最简单的工艺提取出丹参有效抗肿瘤成分，该丹参提取物抗肿瘤效果明显优于目前普遍使用的丹参醇提物以及丹参酮ⅡA等化合物，并且制备方法简单，溶解性好，成药性好。
优选的，所述丹参提取物为上文所述的丹参提取物。
作为一种具体实施方式，所述抗肿瘤药物还包括药学上可接受的载体或赋形物；和/或，所述抗肿瘤药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、滴丸剂、注射剂或颗粒剂。所述的载体或赋形剂可以为本领域常用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂或矫味剂。例如，填充剂可选自淀粉、蔗糖、乳糖或微晶纤维素；粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠；表面活性剂可以是十六玩机硫酸钠；润滑剂选自滑石粉、硬脂酸镁和钙、微粉硅胶或聚乙二醇等。
所述剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备所需要的制剂。例如，片剂可为普通片、薄膜片、肠溶片、分散片、冻干片、缓释片，控释片等，可以用上述提取物干粉，加入适量稀释剂例如淀粉、糊精、甘露醇、微晶纤维素，适量的粘合剂例如水、乙醇、纤维素、淀粉、明胶，适量的崩解剂例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇，加入甜味剂，例如D-木糖、木糖醇、麦芽糖醇、甜叶菊素天冬甜母；按常规湿法制粒，干燥后整粒或者干法制粒后压片，如为包薄膜衣片，用成膜材料选自纤维素类、聚乙二醇类，按常规包衣，分装入密闭瓶或者铝塑板中；胶囊剂可为普通胶囊剂、肠溶胶囊剂、速溶胶囊、缓释胶囊、控释胶囊、包衣软胶囊、缓释软胶囊等；可将药物提取物加入适量辅料例如碳酸钙、甘露醇、氧化镁、微粉硅胶等，适当润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁、乙二醇脂、聚硅酮类，以及适当的粘合剂例如矿物油、食油，并加入适当的甜味剂，例如D-木糖、木糖醇、麦芽糖醇、甜叶菊素、天冬甜母，混合成干粉或者制成颗粒，填充入胶囊，分装在密闭瓶或者铝塑板中；注射剂可为溶液型注射剂、混悬型注射剂、乳浊型注射剂、冻干粉针剂等，可将药物提取物加入适量辅料例如乙醇、甘油、丙二醇等合用作为分散介质，乳化剂有阿拉伯胶、PEG-20蓖麻油、卵磷脂、豆磷脂、聚氧乙烯35蓖麻油、泊洛沙姆等，以及适量的稳定剂有羧甲基纤维素钠、吐温-80、甘露醇、山梨醇、PVP等。
本发明的丹参提取物可以是丹参的干燥根和/或根茎的提取物。
在现有技术中，丹参具有活血祛瘀，养血安神，凉血消肿的功效，主治瘀血头、胸、胁、腹疼痛，痛经经闭，产后瘀滞腹痛，关节痹痛，温病心烦，血虚心悸，疮疡肿毒；本申请发明人在探究高效、低毒治疗肿瘤疾病的过程中发现，本发明的丹参提取物对肿瘤细胞有明显的抑制效果。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
本发明首次采用石油醚、乙醚等使用最简单的工艺提取出丹参有效抗肿瘤成分，溶解性好，且保证其稳定性。
本发明的丹参提取物具有抗肿瘤效果强，成药性好，工艺简单，给药剂量低，用药安全等特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
以下实施例中所用丹参药材原产地安徽，所使用的环磷酰胺来源于通化茂祥制药有限公司，50mg/片。
实施例中所用细胞：BGC823(人胃癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)、SMMC-7721(人肝癌细胞株)、NCI-H460(人肺癌细胞株)、COLO205(人结肠癌细胞株)、PC-9(人前列腺癌细胞株)、OS-RC-2(人肾癌细胞株)、PANC-1(人胰腺癌细胞株)均为本实验保存。
一、提取工艺
实施例1丹参石油醚超声波提取物制备
一种丹参石油醚提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，用80ml石油醚超声提取1h，控制超声温度在20℃-25℃，收集提取液，过滤，重复超声提取2次，合并两次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物0.0837g，提取率为0.837％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例2丹参乙醚超声波提取物制备
一种丹参乙醚提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，用50ml乙醚超声提取1h，控制超声温度在20℃-25℃，收集提取液，过滤，重复超声提取3次，合并三次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物0.0702g，提取率为0.702％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例3丹参丙酮超声波提取物制备
一种丹参丙酮提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，用80ml丙酮，超声提取3h，控制超声温度在20℃-25℃，收集提取液，过滤，重复超声提取3次，合并三次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物0.1623g，提取率为1.623％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例4丹参氯仿超声波提取物制备
一种丹参氯仿提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，用80ml氯仿超声提取1h，控制超声温度在20℃-25℃，收集提取液，过滤，重复超声提取3次，合并三次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物0.3472g，提取率为3.472％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例5丹参乙醇超声波提取物制备
一种丹参石油醚提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，用80ml乙醇超声提取1h，控制超声温度在20℃-25℃，收集提取液，过滤，重复超声提取3次，合并三次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物2.0176g，提取率为20.176％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例6丹参石油醚回流提取物
一种丹参石油醚提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，用80ml石油醚在90℃回流加热提取1h，收集提取液，过滤，重复回流提取3次，合并三次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物0.1277g，提取率为1.277％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例7丹参微波萃取提取物制备
一种丹参提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材10g，干燥后，粉碎，加入8倍量石油醚，微波功率320w，提取30min，收集提取液，过滤，重复提取2次，合并两次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物1.2980g，提取率为1.298％；
向提取物中加入10ml二甲基亚砜溶解提取物，待用。
实施例8丹参超临界CO2萃取提取物制备
一种丹参提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材，干燥后，粉碎，进行超临界CO2萃取，萃取压力为35MPa，提取时间为1.5h，萃取温度为4O℃，解析压力为8Mpa，得提取物1.4330g，提取率为1.433％；
实施例9丹参石油醚回流提取物的制备
一种丹参石油醚回流提取物，按照如下步骤制备：
称取丹参药材100g，干燥后，粉碎，用800ml石油醚在65℃回流加热提取1h，收集提取液，过滤，重复回流提取3次，合并三次滤液，旋转蒸发回收溶剂，得提取物；向提取物中加入1-3倍质量的淀粉、及少量硬脂酸镁以收干提取物，待用。
二、药效学实验
2.1体外细胞毒性实验
实施例10-12均为体外细胞毒性实验，其中的MTT实验均参照如下2.1.1-2.1.2的方法进行。
2.1.1样品准备：
丹参提取物、丹参酮ⅡA、对照品环磷酰胺，以二甲基亚砜分别溶解，配成贮存液，在-20下保存，使用时可用新鲜的培养基稀释到所需浓度。
2.1.2MTT法检测细胞增殖参照如下步骤：
细胞于含10％的胎牛血清、100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，在37℃，5％二氧化碳的条件下培养。取对数细胞，用血细胞计数板进行计数。按每孔100ul体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量为5000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，培养过夜使细胞贴壁。加入所需待测样品，同时设空白对照和生长对照，每孔100ul，每个浓度平行三个样品，于二氧化碳培养箱中(5％CO2、37℃)培育48小时。吸掉药液，每孔加入100ul 0.5mg/ml的MTT溶液(避光操作)，继续培养4小时后，小心吸去孔内培养液，每孔加入200ul的二甲基亚枫，于570nm/630nm波长处测定其光吸收值。
实施例10采用不同提取溶剂得到丹参提取物的抗肿瘤效果对比
将实施例1、2、3、4、5制备的丹参提取物经MTT实验检测对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823的抑制作用，结果见下表1，各样品对细胞抑制率为50％的结果：
表1采用不同试剂对丹参药材超声提取样品的IC50结果：
实验结果：
●丹参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物、丹参丙酮超声提取物、丹参氯仿超声提取物对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823有明显的杀伤作用；且丹参乙醚超声提取物效果最优，其次为丹参石油醚超声提取物、丹参丙酮超声提取物、丹参氯仿超声提取物；
●丹参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物、丹参丙酮超声提取物、丹参氯仿超声提取物对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823的IC50值明显低于丹参乙醇超声提取物，说明丹参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物、丹参丙酮超声提取物、丹参氯仿超声提取物的抗肿瘤功效明显优于丹参乙醇超声提取物；
结论：
本实验证明乙醚、石油醚、丙酮和氯仿是提取丹参药材的优选溶剂，这些溶剂对丹参进行提取所得提取物抗肿瘤效果佳。由于乙醚在工业生产中容易产生爆炸，氯仿对人体的毒性较大，因此实际生产中优选石油醚和丙酮。乙醇不是提取丹参药材的优选溶剂。
实施例11采用不同提取方式得到的丹参提取物的抗肿瘤效果比较
将实施例1、6、7、8制备的丹参提取物经MTT实验检测对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823抑制作用的IC50值，结果见下表2：
表2采用不同提取方式得到的丹参提取物的抗肿瘤效果比较
实验结果及结论：
丹参石油醚回流提取物、丹参石油醚超声波提取物、丹参微波萃取提取物及丹参超临界萃取提取物对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823有明显的杀伤作用，因此回流提取、超声提取、超临界提取以及微波提取都可以作为提取丹参的优选方法。综合考虑实际生产中的成本因素，优选回流提取和超声提取作为丹参提取方法。
实施例12丹参提取物与环磷酰胺及丹参酮ⅡA的抗肿瘤效果对比
将实施例1、2制备的丹参提取物与丹参酮ⅡA、环磷酰胺经MTT实验检测对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823、NCI-H460、COLO205、PC-9、OS-RC-2、PANC-1的抑制作用，结果见下表，各样品对细胞抑制率为50％的结果：
表3丹参超声提取物与丹参酮ⅡA、环磷酰胺IC50结果
实验结果：
●丹参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823、NCI-H460、COLO205、PC-9的IC50值明显低于环磷酰胺，说明丹参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物的抗肿瘤功效明显优于环磷酰胺；
●丹参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物对肿瘤细胞MCF-7、SMMC-7721、BGC823、NCI-H460、COLO205、PC-9的IC50值明显低于丹参酮ⅡA，说明参乙醚超声提取物、丹参石油醚超声提取物的抗肿瘤功效明显优于丹参酮ⅡA。
结论：
环磷酰胺是临床上已上市应用的抗肿瘤药物。本实验证明本发明所述的丹参提取物的抗肿瘤效果优于环磷酰胺(对照药物)，说明其是一种具有开发价值的理想的低毒抗肿瘤药物备选物。
丹参酮ⅡA是已发现抗肿瘤效果最强的丹参活性成分之一。实验证明本发明所述的丹参提取物的抗肿瘤效果优于丹参酮ⅡA，并且其制备工艺简单，溶解性优于丹参酮ⅡA，因此该丹参提取物是优于丹参酮ⅡA的新的抗肿瘤药物备选物。
2.2S180小鼠抗肿瘤实验
实施例13为小鼠抗肿瘤实验，参照如下2.2.1-2.2.2的方法进行。
2.2.1样品准备：
将实施例9得到的样品用食用油与水制备成均匀的乳悬液，作用浓度为80mg/kg；取对照药物环磷酰胺用食用油与水制备成均匀的乳悬液，作用浓度为40mg/ml。
2.2.2操作步骤：
取腹水瘤S180细胞，用PBS稀释至约4*106/ml，用1ml无菌注射器吸取0.2ml抽出的细胞液注射到小鼠右腋下；注射后的第二天开始观察小鼠腋下的肿瘤生长情况，筛选出肿瘤硬块情况较一致的小鼠用于后续实验；将S180肿瘤模型制造成功的小鼠分组，每组10只，分为给药组、空白组、阳性对照。给药组灌胃丹参石油醚提取物样品，空白组灌胃油水混合液，阳性对照组灌胃环磷酰胺，均灌胃0.5ml，实验持续10天，每天灌胃给药和记录各组小鼠体重。10天后，称量小鼠体重后处死取出肿瘤称重及测量肿瘤大小。测量肿瘤大小用游标卡尺量取肿瘤的长、宽、和对角线的长度后取平均值作为肿瘤的直径。
实施例13丹参石油醚回流提取物与对照药物环磷酰胺抗肿瘤效果实验
参照2.2.1-2.2.2的方法开展实验，实验数据见表4。
表4丹参石油醚回流提取物与对照药物环磷酰胺抗肿瘤效果比较：
实验结果：
●从抑制率的数据(表4)可看到，本发明所述丹参提取物对肿瘤有很好的抑制效果，其在80mg/kg的浓度下作用效果与市售产品环磷酰胺相似；
●从小鼠实验前后的体重分析，本发明所述丹参提取物对S180小鼠的体重增长没有影响，而使用环磷酰胺的S180小鼠在试验后体重增长受到严重的影响，说明与环磷酰胺相比本发明所述丹参提取物对小鼠副作用远低于环磷酰胺。
结论：
本实验证明本发明所述的丹参提取物具有显著的抗肿瘤效果，且是相对于环磷酰胺更加安全的一种抗肿瘤药物。
三、毒理学实验
3.1昆明小鼠急性毒性实验
实施例14为小鼠急性毒性实验，参照3.1.1-3.1.2的方法进行。
3.1.1样品准备：
实施例9制备的样品用食用油与水制备成均匀的乳悬液，作用浓度为10g/kg、8g/kg、5g/kg。
3.1.2步骤：
取18-22g昆明小鼠(购于南方医科大实验动物中心，雄性)30只，分为3组，每组10只。第一组：按10g/kg丹参石油醚提取物对小鼠进行灌胃，一次给药完成；第二组：按8g/kg丹参石油醚提取物对小鼠进行灌胃，一次给药完成；第三组：按5g/kg丹参石油醚提取物对小鼠进行灌胃，一次给药完成。整个实验跟踪记录小鼠共14天，观察其精神状态。实验结束后，将实验小鼠处死，进行病理分析。
实施例14丹参石油醚回流提取物对小鼠的急性毒性研究
参照3.1.1-3.1.2的方法开展实验。
实验结果：
第一组，有3只小鼠在灌胃完成后1.5-4h内出现腹泻现象，12h后小鼠恢复正常；14天内小鼠未出现死亡；
第二组，小鼠未出现病理现象出现精神状态良好，发育正常，无一死亡，未观察到毒性；
第三组，小鼠未出现病理现象出现精神状态良好，发育正常，无一死亡，未观察到毒性。结论：
本文所述丹参提取物在8g/kg的剂量下对小鼠仍未显现明显毒性作用，该剂量已经达到了抗肿瘤有效剂量(0.08g/kg)的100倍，说明该丹参提取物是一种有效的、安全性极高的提取物。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。