一种新型的高分子键合血管阻断剂、制备方法及其医药用途与流程

本发明涉及高分子键合药领域，尤其涉及一种基于聚氨基酸嵌段共聚物和小分子血管阻断剂DMXAA的高分子键合药。

背景技术：

DMXAA(又称ASA404)是最近几年开发的一种新型的抗肿瘤药物，其结构式如下：

不同于传统的细胞毒素类抗癌药，如紫杉醇、阿霉素、顺铂等。DMXAA几乎没有癌细胞杀伤能力，不能直接杀死肿瘤细胞。与这些传统抗癌药物不同，它采用一种新的抗癌机制。DMXAA可以选择性的破坏肿瘤部位的血管，快速对肿瘤部位血管造成不可逆的损伤，切断肿瘤的血液供给，引起肿瘤严重的出血性坏死，而对正常组织血液供给基本没有影响。DMXAA首先在老鼠的荷瘤模型上取得明显的抗肿瘤效果。而且和其他抗肿瘤药物进行联用可以起到叠加甚至协同的抑瘤效果。二期临床试验中，DMXAA和紫杉醇/卡铂联用对非小细胞肺癌显示出强大的疗效。但是在后续的三期临床试验中，DMXAA作为一个二线药物对晚期的非小细胞肺癌患者的生存率并无明显的提高。造成这种现象可能的原因是多方面的，首先病人配型的过于随机，另一方面可能是临床上同时使用的其他药物(如类固醇等)的抑制。但是DMXAA仍然是一种有前景的抗肿瘤药物，而且亟待开发其新的剂型来改善其效果。

从结构上看DMXAA是一个小分子，在临床使用中仍然面临小分子药物常见的缺陷，如溶解性差、体内稳定性差、快速的血液清除速率等。肿瘤不同于正常组织，由于其过度的生长和促血管生产因子的大量表达，使得肿瘤表面血管生成速度很快，因此长期有效的肿瘤血管抑制是必需的，否则肿瘤仍然可以快速生长。而DXMAA是小分子，快的体内清除速率和不充分的肿瘤部位驻留都会影响其发挥长期的肿瘤血管抑制效果。

近年来，高分子纳米载药体系是抗肿瘤领域的研究热点。纳米级的高分子载体(主要为胶束、囊泡和纳米颗粒)通过对抗肿瘤药物的担载，可以改善药物的溶解性，提高药物在血液循环中的稳定性，改善药物的药代动力学，延长循环时间。更为重要的是，由于肿瘤部位的高渗透性的脉管系统和淋巴循环缺失，载药纳米粒子利用自身尺度效应，可以实现在肿瘤部位的“增强的渗透和蓄积”。常见的药物担载方式主要有物理包埋和化学键合两种方式。物理包埋的纳米载药体系主要通过疏水或静电相互作用将药物担载到纳米粒子内部。而化学键合则是药物分子通过酯键或酰胺键等共价键连接到高分子载体上面。相比于物理包埋，化学键合更加稳定，在血液循环不会突释药物。而且酯键或酰胺键一般只有进入组织或细胞，在细胞内更低的酸性或其中酶的参与下才能释放药物。因此缓释作用更加明显。

申请号201110317008.7的中国专利明公开了一种基于阿霉素的大分子键合药，它的活性成分是聚磷酸酯聚合物键合阿霉素形成的纳米颗粒，键合的阿霉素可以对肿瘤组织微环境存在响应性，能够迅速的肿瘤组织内弱酸性条件下释放，对肿瘤细胞有较好的杀伤效果。申请号为201310728210.8的专利公开了一种香菇多糖-阿霉素键合药，该键合药中香菇多糖和阿霉素通过肟键相连，其在肿瘤组织或细胞内较低的pH值条件下可以快速释放，从而增强药效。

因此，在本专利中，为了克服DMXAA的缺陷并进一步提高其疗效，我们采用化学键合的方法，制备了一种担载DMXAA高分子键合药。我们选用聚乙二醇-b-聚氨基酸作为高分子主体，对聚氨基酸进行合理修饰得到羟基官能化的聚氨基酸嵌段，通过酯缩合反应将DMXAA键合到高分子链上，制得新型高分子键合DMXAA。聚氨基酸类高分子由于具有和天然多肽类似结构和性质，是一类具有良好的生物相容性、生物降解性、丰富的可修饰性的高分子材料，广泛应用于生物医学领域尤其是药物载体领域等。其中，聚乙二醇类高分子既溶于水有溶于有机溶剂，同时具有良好的生物相容性、抗凝血性、低免疫性和无毒性，被广泛应用于生物医药领域。而且聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚已通过美国联邦药物管理局(FDA)认证可用于人体。在该高分子键合药中，聚乙二醇嵌段起到抗蛋白吸附、提高键合药稳定性的作用。目前，键合DMXAA的高分子药物尚未得到报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种DMXAA的高分子键合药。选用乙醇胺官能化的聚(乙二醇)-b-聚(L-天冬氨酸)为高分子主体，DMXAA为药物活性成分，两者通过酯键键合。由于键合疏水的DMXAA，使得该高分子键合药具有显著的双亲性特征，可以在水溶液中自发组装成纳米粒子。该高分子键合药可以用于提高DMXAA在体内循环稳定性，改善药代动力学，提高在肿瘤部位的蓄积和驻留，使得DMXAA可以长时间发挥破坏肿瘤血管的效果，克服了DMXAA小分子化合物在肿瘤细胞内药物浓度偏低制约其发挥抗肿瘤作用的瓶颈，发明创造了一种新型高效的高分子键合的抗肿瘤药物抑瘤效。

该发明提供的DMXAA高分子键合药，具有式(I)的结构或式(II)的结构。

式(I)中和式(II)中，R1独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R2独立地选自-NH-或-R4(CH2)rNH-，其中，R4为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R3独立地选自氢或疏水基团；

n为聚乙二醇的聚合度，20≤n≤500；m1和m2为主链中天冬氨酸的聚合度，5≤m1+m2≤200，m2＞0，DMXAA以无规的方式接枝到高分子主链上。

本发明所述的高分子键合药，其特征在于，所述R1独立地选自C1～C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽、叶酸取代的烷基。

所述的高分子键合药，其特征在于，所述R3独立地选自氢、乙酰基、C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基、脱氧胆酸基。

所述的高分子键合药，其特征在于，R1是甲基；R2为-NH-；R3是乙酰基。

本发明还提供了一种氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：

具有式(III)或式(IV)结构的单氨基聚乙二醇与γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐单体在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物与乙醇胺反应，得到具有式(VII)嵌段共聚物；或者具有式(V)或式(VI)的双氨基聚乙二醇在与γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐单体在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物与乙醇胺反应，得到具有式(VIII)结构的嵌段共聚物；

其中R1独立地选自C1～C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽、叶酸取代的烷基；R3独立地选自氢、乙酰基、C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基、脱氧胆酸基；R2独立地选自-NH-或-R4(CH2)rNH-，其中，R4为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10。

在式(III)、式(IV)、式(V)或式(VI)中，n为乙二醇聚合度，20≤n≤500，优选为40≤n≤250；在式(VII)和(VIII)中，m为主链中天冬氨酸的聚合度，5≤m≤200，优选为5≤m≤50。

该嵌段聚合物的制备方法中，所述的反应有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺和二氧六环混合物，所述反应优选在无水条件下进行。

本发明提供了一种高分子键合药制备方法。具有式(VII)结构的氨基酸嵌段共聚物与DMXAA在有机溶剂中，在有机碱和缩合剂的作用下通过酯缩合反应得到式(I)结构的高分子键合药；具有式(VIII)结构的氨基酸嵌段共聚物与DMXAA在有机溶剂中，有机碱和缩合剂的作用下通过酯缩合反应得到式(II)结构的高分子键合药。

在所述的制备方法中，有机碱为N，N-二甲基对氨基吡啶(DMAP)、三乙胺或吡啶。缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或其他类似的常见缩合试剂。所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜混合物，所述反应优选在无水条件下进行。

本发明提供了一种药物组合物，包含式(I)化合物、式(II)化合物、式(I)的可药用盐、式(II)的可药用盐、式(I)的异构体、式(II)的异构体、式(I)的水合物、式(II)的水合物、式(I)的溶剂合物、式(II)的溶剂合物中的至少一种。

本发明还提供了式(I)化合物、式(II)化合物、式(I)的可药用盐、式(II)的可药用盐、式(I)的异构体、式(II)的异构体、式(I)的水合物、式(II)的水合物、式(I)的溶剂合物、式(II)的溶剂合物中的任意一种具有抗肿瘤的用途

本发明还提供了另一种药物组合物，包含式(I)化合物、式(II)化合物、式(I)的可药用盐、式(II)的可药用盐、式(I)的异构体、式(II)的异构体、式(I)的水合物、式(II)的水合物、式(I)的溶剂合物、式(II)的溶剂合物中的任意一种或多种；还包含药学上可接受的任意辅料中的一种或多种，如溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等，

制备成适合服用的固体制剂、气体制剂、液体制剂、半固体制剂中的任一一种。

与现有技术相比，本发明提供一种新型的键合DMXAA的高分子键合药。目前该药物相关键合药制剂尚未被报道，因此该发明具有一定的创新性。该DMXAA高分子键合药可以在水溶液中自发组装成纳米粒子，有望提高DMXAA循环稳定性，改善其药代动力学，提高在肿瘤部位的分布，而且通过在肿瘤部位长时间驻留和长期的释放使得DMXAA可以发挥长效破坏肿瘤血管的效果，最终达到全面提高抑瘤效果的目的。

附图说明

图1为实施例1制备的带有保护基的嵌段共聚物mPEG113-b-PBLA12以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图2为实施例1制备的嵌段共聚物mPEG113-b-P(ASP-EI)12以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图3为实施例2制备的高分子键合药PAED-1以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；

图4为实施例2制备的PAED-1的流体力学半径分布图；

图5为实施例2制备的键合药PAED-1胶束的透射电子显微镜照片；

图6实施例2制备的PAED-1键合药在pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中释放示意图。

图7为实施例1制备的键合药前体材料mPEG113-b-P(ASP-EI)12对A549细胞的毒性考察结果图。

图8为实施例1制备的键合药前体材料mPEG113-b-P(ASP-EI)12对MCF-7细胞的毒性考察结果图。

图9为实施例2制备的高分子键合药PAED-1和DMXAA纯药对A549细胞的毒性考察结果图

图10为实施例2制备的高分子键合药PAED-1和DMXAA纯药对MCF-7细胞的毒性考察结果图

图11为一种DMXAA高分子键合药。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

该发明提供的DMXAA高分子键合药，具有式(I)的结构或式(II)的结构。

式(I)中和式(II)中，R1独立地选自氢、烷基或取代烷基；

R2独立地选自-NH-或-R4(CH2)rNH-，其中，R4为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；

R3独立地选自氢或疏水基团；

n为聚乙二醇的聚合度，20≤n≤500；m1和m2为主链中天冬氨酸的聚合度，5≤m1+m2≤200，m2＞0，DMXAA以无规的方式接枝到高分子主链上。

本发明所述的高分子键合药，其特征在于，所述R1独立地选自C1～C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽、叶酸取代的烷基。

所述的高分子键合药，其特征在于，所述R3独立地选自氢、乙酰基、C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基、脱氧胆酸基。

所述的聚氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，R1是甲基；R2为-NH-；R3是乙酰基。

本发明还提供了一种氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：

具有式(III)或式(IV)结构的单氨基聚乙二醇与γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐单体在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物与乙醇胺反应，得到具有式(VII)嵌段共聚物；或者具有式(V)或式(VI)的双氨基聚乙二醇在与γ-苯甲基-L-天冬氨酸-N-内羧酸酐单体在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物与乙醇胺反应，得到具有式(VIII)结构的嵌段共聚物；

其中R1独立地选自C1～C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽、叶酸取代的烷基；R3独立地选自氢、乙酰基、C4～C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基、脱氧胆酸基；R2独立地选自-NH-或-R4(CH2)rNH-，其中，R4为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10。

在式(III)、式(IV)、式(V)或式(VI)中，n为乙二醇聚合度，20≤n≤500，优选为40≤n≤250；在式(VII)和(VIII)中，m为主链中天冬氨酸的聚合度，5≤m≤200，优选为5≤m≤50。

该嵌段聚合物的制备方法中，所述的反应有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺和二氧六环混合物，所述反应优选在无水条件下进行。所述嵌段共聚物利用具有式(III)、式(IV)、式(V)或式(VI)的聚乙二醇中的伯胺基引发γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐。得到带有保护基的中间体在有机溶剂中和乙醇胺反应，得到(VII)和(VIII)的嵌段共聚物。

在制备带有保护基的嵌段共聚物中间体的过程中，所述具有式(III)或式(IV)结构的聚乙二醇单甲醚或者具有式(V)或式(VI)结构的聚乙二醇与所述γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐的摩尔比优选为1∶5～200，更优选为1∶5～50。所述搅拌反应的温度优选为20℃～30℃。所述搅拌反应的时间优选为48h～96h。

在将带有保护基的嵌段共聚物在有机溶剂中进一步与乙醇胺反应，乙醇胺的氨基将苯甲基保护基取代，得到具有(VII)和(VIII)的嵌段共聚物。其中所述反应的温度优选为30℃～40℃。所述搅拌反应的时间优选为24h～48h。所述的反应有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或两者二氧六环混合物，所述反应优选在无水条件下进行。反应结束后，将反应产物用过量乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，在纯水中透析24h～72h，透析过程中换水6～15次，冷冻干燥，得到具有式(VII)和(VIII)结构嵌段共聚物的冻干粉。

本发明提供了一种高分子键合药制备方法。具有式(VII)结构的氨基酸嵌段共聚物与DMXAA在有机溶剂中，在有机碱和缩合剂的作用下通过酯缩合反应得到式(I)结构的高分子键合药；具有式(VIII)结构的氨基酸嵌段共聚物与DMXAA在有机溶剂中，有机碱和缩合剂的作用下通过酯缩合反应得到式(II) 结构的高分子键合药。

在所述的制备方法中，有机碱为N，N-二甲基对氨基吡啶(DMAP)、三乙胺或吡啶。缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或其他类似的常见缩合试剂。所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜混合物，所述反应优选在无水条件下进行。反应结束后，将反应产物用过量乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，在纯水中透析24h～72h，透析过程中换水6～15次，通过超速离心除去未反应DMXAA固体并进一步通过220nm滤膜纯化，得到的透析液冷冻干燥，得到具有式(I)和(II)结构DMXAA高分子键合药的冻干粉。

本发明在制备具有式(VII)和(VIII)结构的嵌段共聚物过程中，以γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐为原料，对这种氨基酸-N-内羧酸酐来源没有特殊限制，可以参照以下方法制备：

L-天冬氨酸和苯甲醇在浓硫酸的作用下发生反应，经后处理得到γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯，所述γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯反应，得到γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐。

该药物组合物可以经多种途径施用，例如口服片剂，胶囊，粉针剂，口服液，注射剂和透皮制剂。根据常规的药物上的惯例，药学上可接受的载体包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、着色剂、调味剂或其它常规添加剂。典型的药学上可接受的载体包括例如微晶纤维素、淀粉、交连聚维酮、聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、麦芽糖醇，柠檬酸，十二烷基磺酸钠或硬脂酸镁等。

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明化合物至少一种药学上可接受的载体。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的嵌段共聚物和基于该共聚物的高分子键合药的制备方法进行详细描述，但是本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

向干燥的反应瓶内加入5.00g数均分子量为5000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与80mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于50mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.50gγ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应48h；然后提高温度到35℃，加入10mL乙酸酐继续反应24h。反应结束后，减压抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反应的乙酸酐，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到带有保护基的嵌段共聚物。对得到的带保护基的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图1，图1为实施例1制备的带有保护基的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯的聚合度为12，将该嵌段共聚物记为mPEG113-b-PBLA12。其结构如下：

取5.00g所述的带有保护基的化合物mPEG113-b-PBLA12在25℃下溶解于45mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入15mL乙醇胺，搅拌反应24h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式(VII)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图2，图2为实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明，实施例1得到的嵌段共聚物具有式(VII)结构，其中，R1为甲基，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(VII-a)；所述嵌段共聚物的产率为70％，其中，n＝113，m＝12，记为mPEG113-b-P(ASP-EI)12。

实施例2

向干燥的反应瓶内加入0.69g实施例1中制备的具有式(VII-a)结构的嵌段共聚物、DMXAA(0.37g)和DMAP(120mg)，抽真空12h。然后加入10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用注射器加入DIC(1.3g)，在室温、氮气保护条件下搅拌反应24h。反应结束后，用过量的乙醚进行沉降，洗涤，抽滤，干燥后，得到的高分子键合药粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后纯水中透析72h，透析过程中换水10次，透析液通过高速离心，然后通过220nm滤膜纯化。最后通过冷冻干燥得到具有式(I)结构的高分子键合药。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图3，图3为实施例2制备的高分子键合药以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图，结果表明，DMXAA成功键合到高分子上。实施例2得到的键合药具有式(I)结构，其中，R1为甲基，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(I-a)；产率为65％，该键合药记为PAED-1。

利用紫外-可见光谱在343nm的吸收测定实施例2得到的键合药中DMXAA的含量，通过以下公式计算键合药中的DMXAA的担载量(DLC)：

DLC＝(键合药中药物的质量/键合药的总质量)×100％

测定表明DMXAA的DLC＝12％。

复溶后，将PAED-1溶解于PBS(pH＝7.4)，浓度到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果参见图4，图4为实施例2制备的PAED-1的流体力学半径分布图，结果表明PAED-1胶束流体力学半径在12nm～30nm之间，粒径分布非常均匀。利用透射电子显微镜(TEM)观察该PAED-1胶束组装形貌，结果参见图5，图5为实施例2制备的键合药PAED-1胶束的透射电子显微镜照片，结果显示实施例2得到的键合药PAED-1胶束均为球形的自组装结构，粒径分布均匀。

实施例3

向干燥的反应瓶内加入5.00g数均分子量为5000的具有式(III)结构的聚乙二醇单甲醚，与80mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于50mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将5.48gγ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐溶解于60mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应48h；然后提高温度到35℃，加入10mL乙酸酐继续反应24h。反应结束后，减压抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反应的乙酸酐，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到带有保护基的嵌段共聚物。结果表明γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯的聚合度为20，嵌段共聚物记为mPEG113-b-PBLA20。

取5.00g所述的带有保护基的化合物mPEG113-b-PBLA20在25℃下溶解于45mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入25mL乙醇胺，搅拌反应24h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式(VII)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例1得到的嵌段共聚物具有式(VII)结构，其中，R1为甲基，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(VII-a)；所述嵌段共聚物的产率为70％，其中，n＝113，m＝20，记为mPEG113-b-P(ASP-EI)20。

实施例4

向干燥的反应瓶内加入0.83g实施例3中制备的具有式(VII-a)结构的嵌段共聚物、DMXAA(0.55g)和DMAP(180mg)，抽真空12h。然后加入15mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用注射器加入DIC(2.0g)，在室温、氮气保护条件下搅拌反应24h。反应结束后，用过量的乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到的高分子键合药粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后纯水中透析72h，透析过程中换水10次，透析液通过高速离心，然后通过220nm滤膜纯化。最后通过冷冻干燥得到具有式(I)结构的高分子键合药。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，DMXAA成功键合到高分子上。实施例4得到的键合药具有式(I)结构，其中，R1为甲基，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构为(I-a)；产率为65％，该键合药记为PAED-2。

利用紫外-可见光谱在343nm的吸收测定实施例4得到的键合药中DMXAA的含量，通过实施例2中公式计算键合药中的DMXAA的担载量(DLC)，测定表明DMXAA的DLC＝15％。

复溶后，将PAED-2溶解于PBS(pH＝7.4)，浓度到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果表明PAED-2胶束流体力学半径在18nm～60nm之间，粒径分布非常均匀。利用透射电子显微镜(TEM)观察该PAED-2胶束组装形貌，结果显示实施例4得到的键合药PAED-2胶束均为球形的自组装结构，粒径分布均匀。

实施例5

向干燥的反应瓶内加入10.00g数均分子量为10000的具有式(V)结构的聚乙二醇单甲醚，与80mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于80mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将6.0gγ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐溶解于50mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应48h；然后提高温度到35℃，加入20mL乙酸酐继续反应24h。反应结束后，减压抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反应的乙酸酐，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到带有保护基的嵌段共聚物。对得到的带保护基的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯的总聚合度为20，此时嵌段共聚物记为PBLA10-b-PEG227-b-PBLA10。其结构如下：

取5.00g所述的带有保护基的化合物PBLA10-b-PEG227-b-PBLA10在25℃下溶解于45mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入15mL乙醇胺，搅拌反应24h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式(VIII)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例5得到的嵌段共聚物具有式(VIII)结构，其中，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(VIII-a)；所述嵌段共聚物的产率为60％，其中，n＝227，m＝10，记为P(ASP-EI)10-b-PEG227-b-P(ASP-EI)10。

实施例6

向干燥的反应瓶内加入0.80g实施例5中制备的具有式(VIII-a)结构的嵌段共聚物、DMXAA(0.40g)和DMAP(130mg)，抽真空12h。然后加入12mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用注射器加入DIC(1.5g)，在室温、氮气保护条件下搅拌反应24h。反应结束后，用过量的乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到的高分子键合药粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后纯水中透析72h，透析过程中换水10次，透析液通过高速离心，然后通过220nm滤膜纯化。最后通过冷冻干燥得到具有式(II)结构的高分子键合药。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，DMXAA成功键合到高分子上。实施例6得到的键合药具有式(II)结构，其中，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(II-a)；产率为65％，该键合药记为PAED-3。

利用紫外-可见光谱在343nm的吸收测定实施例6得到的键合药中DMXAA的含量，通过实施例2中公式计算键合药中的DMXAA的担载量(DLC)，测定表明DMXAA的DLC＝13％。

复溶后，将PAED-3溶解于PBS(pH＝7.4)，浓度到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果表明PAED-3胶束流体力学半径在12nm～55nm之间，粒径分布均匀。利用透射电子显微镜(TEM)观察实施例6制备的键合药PAED-3胶束均为球形的自组装结构，粒径分布均匀。

实施例7

向干燥的反应瓶内加入10.00g数均分子量为10000的具有式(V)结构的聚乙二醇单甲醚，与80mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于80mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将11gγ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-内羧酸酐溶解于100mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应48h；然后提高温度到35℃，加入20mL乙酸酐继续反应24h。反应结束后，减压抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反应的乙酸酐，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到带有保护基的嵌段共聚物。对得到的带保护基的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯的总聚合度为40，嵌段共聚物记为PBLA20-b-PEG227-b-PBLA20。其结构如下：

取5.00g所述的带有保护基的化合物PBLA20-b-PEG227-b-PBLA20在25℃下溶解于45mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入25mL乙醇胺，搅拌反应24h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式(VIII)结构的嵌段共聚物。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例7得到的嵌段共聚物具有式(VIII)结构，其中，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(VIII-a)；所述嵌段共聚物的产率为61％，其中，n＝227，m＝20，记为P(ASP-EI)20-b-PEG227-b-P(ASP-EI)20。

实施例8

向干燥的反应瓶内加入0.82g实施例7中制备的具有式(VIII-a)结构的嵌段共聚物、DMXAA(0.54g)和DMAP(180mg)，抽真空12h。然后加入18mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用注射器加入DIC(2.0g)，在室温、氮气保护条件下搅拌反应24h。反应结束后，用过量的乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到的高分子键合药粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后纯水中透析72h，透析过程中换水10次，透析液通过高速离心，然后通过220nm滤膜纯化。最后通过冷冻干燥得到具有式(II)结构的高分子键合药。

对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，DMXAA成功键合到高分子上。实施例8得到的键合药具有式(II)结构，其中，R2为-NH-，R3为乙酰基，此时结构记为(II-a)；产率为67％，该键合药记为PAED-4。

利用紫外-可见光谱在343nm的吸收测定实施例8得到的键合药中DMXAA的含量，通过实施例2中公式计算键合药中的DMXAA的担载量(DLC)，测定表明DMXAA的DLC＝16％。

将PAED-4溶解于PBS(pH＝7.4)，浓度到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果表明PAED-4胶束流体力学半径在15nm～65nm之间，粒径分布均匀。利用透射电子显微镜(TEM)观察实施例8制备的键合药PAED-4胶束均为球形的自组装结构，粒径分布均匀。

实施例9

取5mg的实施例2制备的PAED-1键合药溶解在5mL 0.01M的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至截留分子量为3500的透析袋，用45mL相应pH值的缓冲液进行透析，透析在温度为37℃、转速为100的恒温振荡箱中进行，每隔特定时间取样4mL，并补充相应量的缓冲液；利用紫外-可见光谱在343nm的吸收测定释放液的浓度，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图6所示。释放表明该键合药在正常的生理条件下可以持续缓慢的释放药物，可以保护药物在血压循环中稳定性，等到达肿瘤组织和细胞，在其中酶的参与下，快速释放活性药物成分，发挥抑瘤效果。

实施例10

我们采用MTT细胞毒性试验对制备的嵌段共聚物材料和以此为基础制备的高分子键合药的毒性进行考察，具体的实验步骤如下：

1、收集对数期A549非小细胞肺癌细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～7000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h；

2、24h后弃去培养液，用培养基将实施例1制备的mPEG113-b-P(ASP-EI)12稀释到不同浓度，加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h；

3、48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度的嵌段共聚物的细胞存活率。

结果参见图7，图7为实施例1制备的键合药前体材料mPEG113-b-P(ASP-EI)12对A549细胞的毒性考察结果图，结果表明，在各浓度的嵌段共聚物下细胞存活率均在80％以上，由此证明本发明制备的嵌段共聚物具有良好的安全性。

实施例11

1、收集对数期MCF-7人乳腺癌细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～7000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h；

2、24h后弃去培养液，用培养基将实施例1制备的mPEG113-b-P(ASP-EI)12稀释到不同浓度，加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h；

3、48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度的嵌段共聚物的细胞存活率。

结果参见图8，图8为实施例1制备的键合药前体材料mPEG113-b-P(ASP-EI)12对MCF-7细胞的毒性考察结果图，结果表明，在各浓度的嵌段共聚物下细胞存活率均在80％以上，同样证明本发明制备的嵌段共聚物具有良好的生物相容性。

实施例12

1、收集对数期A549癌细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～7000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h；

2、24h后弃去培养液，用培养基将实施例2制备的PAED-1和DMXAA纯药稀释到不同浓度，加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h；

3、48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度的嵌段共聚物的细胞存活率。

结果参见图9，图9为实施例2制备的高分子键合药PAED-1和DMXAA纯药对A549细胞的毒性考察结果图，结果表明，高分子键合药PAED-1和DMXAA纯药均无明显的癌细胞杀伤效果，这和文献报道的结果是一致的，DMXAA本身没有明显的细胞毒性，其对肿瘤的抑制能力来源于其对肿瘤新生血管的破坏。键合药PAED-1由于本身使用的材料没有毒性且键合的药物没有毒性，因而也没有明显的细胞毒性。

实施例13

1、收集对数期MCF-7癌细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL(～7000个)细胞；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养24h；

2、24h后弃去培养液，用培养基将实施例2制备的键合药PAED-1和DMXAA纯药稀释到不同浓度，加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5％CO2细胞培养箱中培养48h；

3、48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度的嵌段共聚物的细胞存活率。

结果参见图10，图10为实施例2制备的高分子键合药PAED-1和DMXAA纯药对MCF-7细胞的毒性考察结果图，结果表明，高分子键合药PAED-1和DMXAA纯药均无明显的癌细胞杀伤效果，与实施例12的结果是一致的。这些结果表明该高分子键合药有良好的生物相容性。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。