本发明涉及纳米技术领域，具体为一种纳米技术在羊胚胎提取中的应用以及羊胚胎素的质量标准。
背景技术：
自1912年，瑞士科学家卡尔教授首次发现羊胚胎细胞中有一种能使细胞恢复活力的物质(称之为羊胚胎素)以来。羊胚胎中含有活化细胞、增强生命系统免疫功能、恢复人体精力的多种物质，这些物质对人类抗衰老、治疗和预防疾病得到了应用。随着人类对羊胚胎素用研究深入，羊胚胎素的提取与纯化技术，对羊胚胎素在人类应用中起决定性作用。具有高生物活性小分子羊胚胎素能快速被人体吸收利用，且安全、效果明显，它通过增强人体免疫功能，调节人体内分泌，加速细胞的分裂，修复受细胞，活化衰老细胞，使人体各细胞及组织达到年轻状态，人体各机能均被激活，达到真正意义上的延缓衰老，治疗和预防疾病。羊胚胎素包括细胞中含有蛋白质、核酸、糖类、磷脂类、维生素、酶等。按常规方法提取的羊胚胎素中的大分子物质多，成分复杂，过敏性高，活性低、生物利用率低。
羊胚胎素的生物活性高低和分子的大小能决定羊胚胎素是否可以达到上述效果。目前的提取方法主要以粉碎、生化提取、离心、微滤，整个生产过程中受热量和化学物质的影响，特别是细胞破碎后没有对生物活性物质保护，生物活性受到破坏较大，因此提取物中羊胚胎素的活性较低，其次在纯化时采用微滤，成分复杂，不易吸收，过敏源多，再提取出来的羊胚胎素无质量标准，不能保证其质量。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种纳米技术在羊胚胎提取中的应用以及羊胚胎素的质量标准，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种从羊胚胎中制备羊胚胎提取液的方法，从羊胚胎的选取及处理开始，经过组织破碎、细胞反复冻融、离心去杂、微滤，获得羊胚胎提取液，包括下述步骤：
(1)羊胚胎选取与处理：其羊胚胎为孕期6-8周，脱母体后浸泡在生理盐水中，30min内置-20℃储藏；
(2)组织破碎：去除羊胚胎肠胃杂质，碎成碎片，绞肉机2次后用4-6℃生理盐水制成肉浆，再用胶体磨研磨4次；
(3)细胞反复冻融：在-35±2℃和0℃反复冻融三次，每35±2℃时间冻融时间为12小时；
(4)离心去杂：采用冷冻离心机，确保离心室温度在-8—-10℃；
(5)微滤：离心上清液经滤纸过滤后，再经0.8um、0.2um过滤，得羊胚胎提取液。
作为本发明更进一步的技术方案，步骤(2)中所述生理盐水与羊胚胎重量比例为15：1。
2.一种从羊胚胎提取液中分离纯化得到羊胚胎素溶液的制备方法，通过不同纳米递度过滤，获得羊胚胎素溶液，包括下述步骤：
(1)纳滤：经过微滤后的羊胚胎提取液，在无菌条件下采用不同纳米递度过滤，去掉分子量大于6000道尔顿的物质(高分子物质、细菌、病毒等)和分子量小于100道尔顿物质(无机盐类等)；
(2)纳滤后的处理：纳滤后的溶液充氮后密封保存，确保储藏期因氧化导致生物活性降低，同时回收100道尔顿以下的液体循环利用，减少排放达到环保。
作为本发明更进一步的技术方案，在无菌条件下指的是B级洁净区内。
作为本发明更进一步的技术方案，不同纳米递度为10—100nm。
3.一种羊胚胎素溶液的质量标准，具体为：
性状：本品为无色或微黄色液体。
鉴别：取本品，加40％氢氧化钠溶液0.5ml，摇匀，再加1％硫酸铜溶液1ml,溶液显紫红色。
PH值：6.0～7.5；
蛋白质：取本品2ml，加20％磺基水杨酸溶液1ml，混匀，不得发生混浊或沉淀；
多肽含量：不得低于6mg/ml；
高分子物质：不得高于5.0％；
生物活性：不得低于30.0％；
贮藏：充氮密闭，-4℃以下保存；
有效期：24个月。
作为本发明更进一步的技术方案，多肽含量的测定方法为福林酚测定法。
作为本发明更进一步的技术方案，高分子物质的测定方法为高效液相色谱法。
作为本发明更进一步的技术方案，生物活性的测定方法为T细胞活性测定法-脱E受体法。
与现有技术相比，本发明提供了一种羊胚胎提取和纯化方法，解决了羊胚胎素中高分子物质多、成分杂、过敏源多、生物活性低的原因。同时本发明建立了羊胚胎素溶液质量标准，解决了羊胚胎提取后无标准检测的问题。
本发明提供的提取方法，从羊胚胎原料到提取过程，整个过程在低温(胚胎-20℃储藏、组织破碎4-6℃、细胞反复冻融在-35±2℃、离心去杂在-8—-10℃)和细胞生理环境(生理盐水环境下)条件下保证羊胚胎素的生物活性。本发明提供的纯化方法，采用不同纳米递度过滤，去除了高分子物质、细菌、病毒、无机盐类等，选择性留下100—6000道尔顿高生物活性物质，纳滤后的羊胚胎素溶液充入无菌氮气后密封保存，确保储藏期不会因氧化生物活性降低，同时回收100道尔顿以下的液体循环利用，减少排放达到环保。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
步骤一
羊胚胎的选择和处理：经发明人的反复试验，原料的选择与前期处理对产品的生物活性很重要，孕期6-8周羊胚胎，其胚胎生长最快时期，其胚胎各组织细胞中含生物活性物质最高，脱母体后浸泡在生理盐水中，30min内置-20℃储藏，对生物活性物质没有任何影响。
步骤二
组织破碎：先将羊胚胎解冻，解冻后清洗干净，去除肠胃，剁成碎片，放入绞肉机中绞碎，重复2次，再用4-6℃生理盐水(纯化水加氯化钠配制成0.9％生理盐水，再灭菌好备用)，制成肉浆(生理盐水与羊胚胎重量比例为15：1)。肉浆经胶体磨研磨，重复4次，变成肉糊状，前两次胶磨应快(30min/100kg羊胚胎)，后两次胶磨稍慢(45min/100kg羊胚胎)，这样胶磨产生的热量，基本不会对溶液温度产生影响，不会影响生物活性。反复胶磨使组织破碎。
步骤三
细胞反复冻融：将步骤二中的肉糊装入5cm厚的容器中，密闭置于冷冻池中，-35±2℃时间12小时后，再解冻至0℃，重复三次。通过反复冻融，细胞破裂，活性物质被冻出。盛装容器不能过厚，否则反复冻融时中心温度达到时太长且延长了反复冻融时间。
步骤四
离心去杂：将步骤三的冻融物解冻至4—6℃，搅拌30min，便于活性物质均匀分散溶液中。离心时必须采用冷冻离心机，冷冻离心机设置温度不得高于-12℃，这样才能确保离心室工作温度在-10℃左右，离心时间6min，离心速度4200转/分钟，使悬浮大颗粒全部沉淀。这样离心出来的上清液中不影响微滤，如果离心时间过短或转速偏小，微滤中滤膜很容易堵塞，微滤时间过长，影响生物活性。
步骤五
微滤：将步骤四中的上清液先经滤纸过滤，再先后经0.8um、0.2um微孔滤芯过滤，过滤过程中一定要注意溶液温度，控制在4—6℃之间，温度过高会影响生物活性，过滤过程中也应按孔径大小先后顺序过滤，否则时间过滤较长。
步骤六
分离纯化：经过微滤后的提取液，在无菌条件下(B级洁净区)采用不同纳米递度过滤(10—100nm)，先后去年掉10万道尔顿、1万道尔顿、6000道尔顿的高分子物质、细菌、病毒等，再去掉分子量小于100道尔顿物质(无机盐类等)，最终获得100—6000道尔顿小分子高活性的羊胚胎素溶液。再将此溶液充无菌氮气后-4℃密封保存。低温和充氮能确保储藏期生物活性降低。同时回收100道尔顿以下的液体，下批提取时可当作部分提取水，循环利用减少排放，达到环保。
本发明实施的质量检测标准：
检测标准一
性状：本品为无色或微黄色液体。
检测标准二
鉴别：取本品，加40％氢氧化钠溶液0.5ml，摇匀，再加1％硫酸铜溶液1ml,溶液显紫红色。
检测标准三
PH值：用pH计测量，pH应为6.0～7.5。
蛋白质：取本品2ml，加20％磺基水杨酸溶液1ml，混匀，不得发生混浊或沉淀。
多肽含量(福林酚测定法)：取本品适量，加水制成每1ml中含多肽0.15mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取1.0ml，照福林酚测定法(附二)测定，从回归方程中求出多肽含量。多肽不得低于6mg/ml。
高分子量物质：
(1)色谱条件与系统适用性试验：用凝胶色谱柱(如TSK GEL 2005SWx1 7.8mm×300mm，5um)；流动相为三氟醋酸-乙腈-水(0.05：10：90)；检测波长为214nm。理论板数按胰岛素峰计算应不得低于3000。
(2)对照品溶液的制备：取胰岛素(分子量5800)适量，用流动相制成每1ml中含1mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取本品，加流动相稀释成每1ml中含多肽1mg的溶液，作为供试品溶液。
(4)测定法：取对照品溶液和供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于胰岛素峰保留时间的峰视为高分子量物质，按面积归一化法计算，含高分子量物质的量不得过5.0％。
生物活性：取本品适量，照T细胞活性测定法-脱E受体法测定，供试品管的E玫瑰花结百分率与对照管的E玫瑰花结百分率之差应不低于30.0％。
贮藏：充氮密闭，-4℃以下保存。
有效期：24个月。
质量标准检测方法：
T细胞活性测定法-脱E受体法
本法系根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其E受体功能，从而反映转移因子的生物活性。
试剂：
(1)Hank’s液：将0.3％磷酸二氢钾溶液，0.76％磷酸氢二钠溶液，2％氯化钾溶液及20％氯化钠溶液依次按20：20：20：40比例混合，加葡萄糖1g，溶解混匀，用水稀释至1000ml，并用4％碳酸氢钠溶液调节PH值至7.2～7.3(临用时配制)。
(2)阿氏液：取氯化钠0.420g，枸缘酸0.055g，枸缘酸钠0.766g。葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100ml，灭菌。
(3)分离液：为淋巴细胞分离液。
(4)羊血：取绵羊静脉血5ml，加入5ml阿氏液中，冰箱保存。
(5)固定液：取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氢钠溶液及Hank’s液依次按1：1：38比例混合。
(6)姬姆萨染色液原液：取姬姆萨染料0.5g，加甘油33ml，55～60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33ml甲醇，室温放置24小时后，用滤纸过滤，滤液即为原液。密封室温保存。
(7)染色液：取姬姆萨染色液原液2ml，加Hank’s液6ml，摇匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液待用。
操作法：
(1)脱E受体胸腺T细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，加入少量Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2005转离心20分钟，小心吸出中间层的胸腺细胞，放入另一离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入适量Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)。以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，再加入适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心3～5分钟，弃去上清液，用Hank’s液洗涤三次(操作同前)，最后用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1ml中3×106～5×106个细胞。
(2)绵羊红血球悬液的制备：取适量羊血，用适量Hank’s液洗三次(同前)，弃去上清液，加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺T细胞悬液浓度的8～10倍。
(3)供试品溶液的制备：取供试品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。
(4)测定：取小试管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加供试品溶液0.1ml作测定管，每管中各加脱E受体胸腺T细胞悬液0.2ml，37℃保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得结花百分率，取平均值。即为供试品管或对照管的平均值。
样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率。
福林酚测定法
试剂：
(1)碱性铜试液：取氢氧化钾10g，碳酸钠50g,加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g,加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。临用前，合并两液，并加水至500ml。
(2)福林酚试液：取福林酚试剂1ml，加水稀释至16ml，临用前配制。
(3)对照品溶液的制备：取牛血清白蛋白对照品1支，精密称取适量，加水溶解并稀释成每1ml中含0.3mg的溶液，即得。
(4)供试品溶液的制备：精密量取本品1ml置50ml容量瓶中，用水稀释至刻度。
标准曲线的制备：
精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml,分别置具塞试管中，各加水至1.0ml,再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液4.0ml,立即摇匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白，以吸收度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标设置标准曲线参数。
精密量取供试品溶液1.0ml,做平行试验2份，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依次测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即得。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。