一种三层复合小口径血管支架及其制备方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，具体地说，涉及一种人工血管支架，尤其是一种三层复合小口径血管支架及其制备方法。

背景技术：

近年来，心血管疾病的发病率逐渐增加，目前治疗心血管疾病的主要方法是血管移植，自体的静脉和动脉移植无疑是最佳选择，然而，由于患者自身条件的原因，严重限制了传统的移植手术。大口径的合成血管支架如Dacron公司对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和Gore公司生产的膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)已经被成功用于血液高速流动的主动脉上如胸、腹主动脉。然而，目前广泛使用的合成血管支架并不能满足小口径血管支架的需求。主要是由于其抗血栓能力差、新内膜增生造成的再狭窄等导致了移植的失败。

人体血管结构包含内膜、中膜和外膜三层。由于现有的纺织型人工血管支架大多为单层结构，存在着渗血的问题。因此，研究者们在尝试通过不同的方法来制备多层结构的血管支架来模拟与人体血管类似的结构。专利CN105457101A公开了一种三层结构小口径血管支架的制备方法。专利CN105031735A公开了一种三层复合结构小口径人工血管及其制备方法。专利CN102764171A公开了一种静电纺丝复合血管支架及其制备方法。Park等制备了双层结构的小口径血管支架。(参考文献1：Won Sup Choi,Yoon Ki Joung,Yunki Lee,Jin Woo Bae,Ki Dong Park,et al.Enhanced Patency and Endothelialization of Small-Caliber Vascular Grafts Fabricated by Coimmobilization of Heparin and Cell-Adhesive Peptides.ACS Appl.Mater.Interfaces,2016,8,4336-4346.)

目前，制备血管支架的方法有很多，主要有热致相分离、溶剂铸造微粒浸出技术、水凝胶、分子自组装等方法。但这些方法不仅操作复杂，且制备的血管支架结构、形貌、组成均不可控。通过静电纺丝法制备的纤维直径分布从几十纳米到几微米，同时具有孔隙率高、比表面积大、孔径分布较宽等优点，仿生天然细胞外基质的尺寸和结构，有利于细胞的粘附和生长。

技术实现要素：

本发明针对现有小口径血管支架的不足，采用静电纺丝法，成功的制备了三层复合结构且无细胞毒性的小口径血管支架，有望应用于临床诊断中。

本发明所提供的三层复合小口径血管支架是由微纳米纤维所构成的，纤维直径为200nm～2μm。纤维的直径可通过调节纺丝液浓度、纺丝电压以及纺丝距离等来控制。

本发明采用静电纺丝法制备三层复合小口径血管支架，具体步骤包括：

第一步，静电纺丝溶液的配置：

将水溶性聚合物A在室温下溶于溶剂A中，充分搅拌至完全溶解，即得到聚合物A的电纺液，溶液质量百分比浓度为8％～10％。将聚合物B在室温条件下溶于溶剂B中，充分搅拌至完全溶解，即得到聚合物B的电纺液，溶液质量百分比浓度为10％～13％。

第二步，水溶性模板纤维膜的制备：

将第一步得到的聚合物A的电纺液装入容量为2mL的注射器中，注射器前端连接内径为0.6～1.2mm的不锈钢针头。注射器针头与高压直流电源的正极相连，不锈钢针管作为收集极，与高压电源负极相连；所述不锈钢针管与旋转电机A的转轴之间形成“┤”字形连接。静电纺丝电压为8～20kV，不锈钢针头与不锈钢针管间的距离为10～25cm，静电纺丝得到聚合物A的基底纤维膜，即水溶性模板纤维膜。所述旋转电机A的转速为500～1000r/min。

第三步，三层结构血管支架中平行于轴向取向的内层纤维膜的制备：

以第二步制备的聚合物A的基底纤维膜为接收基底，将聚合物B的电纺液装入容量为2mL的注射器中，注射器前端连接内径为0.6～1.2mm的不锈钢针头。注射器针头与高压直流电源的正极相连，不锈钢针管作为收集极，与高压电源负极相连；所述不锈钢针管与旋转电机A的转轴之间形成“┤”字形连接。静电纺丝电压为8～20kV，不锈钢针头与不锈钢针管间的距离调为10～25cm，旋转电机A转速500～1000r/min，静电纺丝得到聚合物B的平行于不锈钢针管轴向取向的内层纤维膜。

第四步，三层结构血管支架中垂直于轴向取向的中层纤维膜的制备：

以第三步制备的平行轴向取向的内层纤维膜为接收基底，将聚合物B的电纺液装入容量为2mL的注射器中，注射器前端连接内径为0.6～1.2mm的不锈钢针头。注射器针头与高压直流电源的正极相连，不锈钢针管作为收集极，与高压电源负极相连；所述不锈钢针管平行于旋转电机B的转轴，形成“一”字形连接。旋转电机B的转速为500～1000r/min。静电纺丝电压为8～20kV，不锈钢针头与不锈钢针管间的距离调为10～25cm，静电纺丝得到聚合物B的垂直于不锈钢针管轴向取向的中层纤维膜。

第五步，三层结构血管支架中无规的外层纤维膜的制备：

以第四步制备的垂直于不锈钢针管轴向取向的中层纤维膜为接收基底，将聚合物B的电纺液装入容量为2mL的注射器中，注射器前端连接内径为0.6～1.2mm的不锈钢针头。注射器针头与高压直流电源的正极相连，不锈钢针管作为收集极，与高压电源负极相连；所述不锈钢针管平行于旋转电机B的转轴，形成“一”字形连接。旋转电机B转速100r/min。静电纺丝电压为8～20kV，不锈钢针头与接收基底(不锈钢针管)间的距离调为10～25cm，即可得到聚合物B的无规的外层纤维膜。

第六步，聚合物A的基底纤维膜的去除：

将第五步中制备结束得到的以聚合物A的水溶性模板纤维膜为基底，聚合物B的三层纤维膜为外层的复合纤维膜放入水中浸泡一段时间，水溶性模板纤维膜溶解，实现脱管，脱管后50℃烘干，得到的纤维管即为目标人造血管支架。

所述的聚合物A为聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、右旋糖酐、淀粉等水溶性高分子中的一种。所述的聚合物B为聚氨酯、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙醇酸、聚癸二酸丙三醇酯等高分子中的一种、两种或三种。

所述的溶剂A为水或乙醇。所述的溶剂B为丙酮、N-N，二甲基甲酰胺、四氢呋喃、三氯甲烷、甲醇中的一种或两种，当溶剂B为两种溶剂的混合溶剂时，两种溶剂的质量比为(4～1):(1～6)。

本发明所制备的人工血管支架内径为2～6mm，长度为3～6cm，人工血管支架中纤维直径为200nm～2μm。

本发明的优点或有益效果在于：

(1)与现有的技术效果相比，本发明设备简单、操作方便、成本低廉，能够实现大规模的生产，在生物医学领域中具有广泛的应用前景。

(2)采用该方法制备的血管支架，孔隙率较大且可控，有利于细胞粘附以及营养物质和新陈代谢废物的扩散。采用材料复合的方法，利于提高人造血管支架的力学性能。

(3)本发明所制备的人工血管支架具有一定的细胞相容性且具有较高的强度、弹性、孔隙率等，可以大规模生产，有望用于实际的临床诊断中。

附图说明

图1本发明所述旋转电机A和旋转电机B接收纤维的装置示意图。

图2本发明所述血管支架横截面示意图。

图3本发明所述的内层取向纤维表面放大10000倍的SEM图。

图4本发明所述的中层取向纤维表面放大10000倍的SEM图。

图5本发明所述的外层无规纤维表面放大10000倍的SEM图。

图中：

1.电机A；2.电机B；3.内层纤维膜；4.中层纤维膜；5.外层纤维膜。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了实现本发明的一种三层复合小口径血管支架的制备方法，首先提供两个旋转电机，分别为旋转电机A1和旋转电机B2，如图1所示，旋转电机A1的转轴与不锈钢针管成90°，并将不锈钢针管与电机转轴相连，转轴与不锈钢针管形成“┤”字形连接，旋转电机A1旋转可以得到平行于不锈钢针管轴向取向的纤维膜。旋转电机B2的转轴与不锈钢针管成180°，并将不锈钢针管与旋转电机B2的转轴相连，转轴与不锈钢针管形成“一”字形连接，旋转电机B的旋转可以得到垂直于不锈钢针管轴向取向的纤维膜。

实施例1

将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于乙醇中配成质量分数为10％的溶液，作为聚合物A的电纺液，将聚氨酯(PU)、聚乳酸(PLA)二者的混合物溶于混合溶剂(混合溶剂中丙酮和N，N-二甲基甲酰胺的质量比为1:1)，配置成10％的溶液，作为聚合物B的电纺液。

首先，将聚合物A的电纺液置于配有直径1.2mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加8kV的电压在工作距离为15cm时进行静电纺丝，采用不锈钢管收集纤维。所述不锈钢管与旋转电机A的转轴之间“┤”字形连接，旋转电机A转速500r/min。得到聚合物A的基底纤维膜。

随之，将聚合物B的电纺液置于配有直径1.2mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加8kV的电压在工作距离为15cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(转速500r/min)收集纤维，得到聚合物B的平行于轴向取向的内层纤维膜，纤维膜的表面形貌如图3所示，具有良好的取向性。

继而，将旋转电机A上的不锈钢针管取下，将其连接到另一旋转电机B的转轴上，旋转电机B2的转轴与不锈钢针管形成“一”字形连接。并在此基础上，继续将聚合物B的电纺液在相同静电纺丝条件下，不锈钢针管收集纤维，旋转电机B的转速为600r/min，静电纺丝得到聚合物B的垂直于轴向取向的中层纤维膜，纤维膜的表面形貌如图4所示，取向性较好。

然后，继续将聚合物B的电纺液在相同的静电纺丝条件下，旋转电机B转速100r/min，与旋转电机B的转轴成“一”字形的不锈钢针管收集纤维，得到表面形貌如图5所示的聚合物B的无规取向的外层纤维膜。

最后，将复合纤维管放入水中浸泡10小时，50℃烘干，即得到三层复合小口径血管支架。所述的三层复合小口径血管支架中，长度为5cm，内径为6mm，纤维直径为200nm～900nm，具有三层纤维膜结构。如图2所示，上述方法制备得到的血管支架包括三层结构，分别为内层纤维膜3、中层纤维膜4和外层纤维膜5，其中，内层纤维膜3平行于轴向取向，中层纤维膜4垂直于轴向取向，外层纤维膜5无规取向。各层纤维膜中的膜厚度和纤维直径可通过调节纺丝液浓度、纺丝电压以及纺丝距离等来控制。

实施例2

将聚环氧乙烷(PEO)溶于去离子水中配成质量分数为8％的溶液，作为聚合物A的电纺液，将聚氨酯(PU)溶于混合溶剂(丙酮和N，N-二甲基甲酰胺的质量比为1:1)，配置成12％的溶液，作为聚合物B的电纺液。

首先，将聚合物A的电纺液置于配有直径0.8mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加12kV的电压在工作距离为18cm时进行静电纺丝，旋转电机A(800r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物A的基底纤维膜。

随之，将聚合物B的电纺液置于配有直径1.0mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加12kV的电压在工作距离为18cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(800r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的平行于轴向取向的内层纤维膜。

继而，将旋转电机A上的不锈钢针管取下，将其连接到旋转电机B，与旋转电机B的转轴形成“一”字形。并在此基础上，继续将聚合物B的电纺液在相同的静电纺丝条件下，采用旋转电机B(900r/min)上的不锈钢针管收集纤维，在内层纤维膜上制备得到聚合物B的垂直于轴向取向的中层纤维膜。

然后，继续将聚合物B的电纺液在相同的静电纺丝条件下，采用旋转电机B(100r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的无规取向的外层纤维膜。

最后，将复合纤维管放入水中浸泡10小时，50℃烘干，即得到三层复合小口径血管支架。

所述的三层复合小口径血管支架中，长度为2cm，内径为4mm，纤维直径为320nm～950nm，具有三层纤维膜结构。

实施例3

将右旋糖酐溶于去离子水中配成质量分数为10％的溶液，作为聚合物A的电纺液，将聚氨酯(PU)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)二者的混合物溶于混合溶剂(四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺的质量比为1:1)，配置成10％的溶液，作为聚合物B的电纺液。

首先，将聚合物A的电纺液置于配有直径0.6mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加10kV的电压在工作距离为12cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(1000r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物A的基底纤维膜。

随之，将聚合物B的电纺液置于配有直径0.6mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加10kV的电压在工作距离为12cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(1000r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的平行于轴向取向的内层纤维膜。

继而，将旋转电机A上的不锈钢针管取下，将其连接到旋转电机B，与旋转电机B的转轴形成“一”字形连接。并在此基础上，继续将聚合物B的电纺液在相同静电纺丝条件下，采用旋转电机B(750r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的垂直于轴向取向的中层纤维膜。

然后，继续将聚合物B的电纺液在相同静电纺丝条件下，采用旋转电机B(100r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的无规取向的外层纤维膜。

最后，将复合纤维管放入水中浸泡10小时，50℃烘干，即得到三层复合小口径血管支架。

所述的三层复合小口径血管支架中，长度为4cm，内径为6mm，纤维直径为250nm～1.5μm，具有三层纤维膜结构。

实施例4

将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于去离子水中配成质量分数为10％的溶液，作为聚合物A的电纺液，将聚己内酯(PCL)溶于混合溶剂(三氯甲烷和甲醇的质量比为4:1)，配置成10％的溶液，作为聚合物B的电纺液。

首先，将聚合物A的电纺液置于配有直径0.6mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加18kV的电压在工作距离为20cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(900r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物A的基底纤维膜。

随之，将聚合物B的电纺液置于配有直径0.6mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加18kV的电压在工作距离为20cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(900r/min)上连接的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的平行于轴向取向的内层纤维膜。

继而，将旋转电机A上的不锈钢针管取下，将其连接到旋转电机B上，与旋转电机B的转轴形成“一”字形连接。并在此基础上，继续将聚合物B的电纺液在相同静电纺丝条件下，采用旋转电机B(800r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的垂直于轴向取向的中层纤维膜。

然后，继续将聚合物B的电纺液在相同静电纺丝条件下，采用旋转电机B(100r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的无规取向的外层纤维膜。

最后，将复合纤维管放入水中浸泡10小时，50℃烘干，即得到三层复合小口径血管支架。

所述的三层复合小口径血管支架中，长度为6cm，内径为2mm，纤维直径为200nm～850nm，具有三层纤维膜结构。

实施例5

将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于去离子水中配成质量分数为9％的溶液，作为聚合物A的电纺液，将聚氨酯(PU)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)三者的混合物溶于混合溶剂(四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺的质量比为1:1)，配置成13％的溶液，作为聚合物B的电纺液。

首先，将聚合物A的电纺液置于配有直径0.8mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加8kV的电压在工作距离为25cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(850r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物A的基底纤维膜。

随之，将聚合物B的电纺液置于配有直径0.8mm不锈钢针头的2mL的注射器中，施加20kV的电压在工作距离为25cm时进行静电纺丝，采用旋转电机A(850r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的平行于轴向取向的内层纤维膜。

继而，将旋转电机A上的不锈钢针管取下，将其连接到旋转电机B的转轴上，与旋转电机B的转轴形成“一”字形连接。并在此基础上，继续将聚合物B的电纺液在相同的静电纺丝条件下，采用旋转电机B(700r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的垂直于轴向取向的中层纤维膜。

然后，继续将聚合物B的电纺液在相同的静电纺丝条件下，采用旋转电机B(100r/min)上的不锈钢针管收集纤维，得到聚合物B的无规取向的外层纤维膜。

最后，将复合纤维管放入水中浸泡10小时，50℃烘干，即得到三层复合小口径血管支架。

所述的三层复合小口径血管支架中，长度为3cm，内径为4mm，纤维直径为250nm～2μm，具有三层纤维膜结构。