本发明涉及中药
技术领域：
，具体涉及一种具有促进白色脂肪细胞褐色化的中药组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：长期以来，一直被认为脂肪细胞的主要功能是储存能量。但随着对脂肪细胞的深入研究，脂肪细胞其它方面的功能也逐渐显露出来。研究表明脂肪细胞在免疫反应、高血压、肥胖、胰岛素抵抗等代谢疾病中都起着重要的作用。最初，脂肪细胞被分为两类：白色脂肪细胞与褐色脂肪细胞。但随着啮齿动物腹股沟脂肪部位的beige(brown-in-white,brite)细胞的发现，褐色脂肪细胞又可以被细分为两类：经典的褐色脂肪细胞与brite/beige脂肪细胞。白色脂肪细胞内含有一个巨大的圆形脂滴，细胞核呈扁平状且位于细胞边缘。脂滴几乎占据了细胞的99％的空间。白色脂肪细胞主要是通过甘油三酯和胆固醇的形式，将能量储存于脂滴当中。但是白色脂肪细胞不仅可以储存能量，它还可以分泌脂肪细胞因子如：脂联素、瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子α等等。这些脂肪细胞因子在能量代谢调节、免疫反应等多种生理现象中发挥着重要作用。褐色脂肪细胞的外形呈多边形，细胞核为圆形，且细胞内的脂滴呈多室分布于整个细胞中。褐色脂肪细胞含有大量的细胞质基质，并且细胞内的线粒体含量很高。因为线粒体内的细胞色素含有铁原子，所以含有大量线粒体的褐色脂肪细胞的颜色为褐色。褐色脂肪细胞不同于白色脂肪细胞的主要特征是：线粒体内膜上的解偶联蛋白1(UCP1)的表达量很高。所以，褐色脂肪细胞的主要功能就是通过UCP1来产热从而消耗能量而不产生ATP：即褐色脂肪细胞可以通过UCP1，将线粒体内的电子传递链与ATP合成解偶联，进而通过氧化磷酸化解偶联呼吸，将脂肪酸β氧化产生的能量以热量的形式散失掉。褐色脂肪细胞的非颤栗性产热功能，可以维持体温恒定，也可以以热能的方式消耗机体摄入的能量，从而降低肥胖发生的概率。两种褐色脂肪细胞的分布是不同的，经典的褐色脂肪细胞主要分布于啮齿动物的肩胛骨区域，而Beige脂肪细胞主要分布于腹股沟区域的皮下脂肪组织中。对于人类来说，褐色脂肪细胞主要存在于婴儿体内，但是目前研究发现，成年人的颈部、锁骨上也含有相当量的褐色脂肪细胞，且它们与啮齿动物的beige脂肪细胞相似。除了分布差异外，两种褐色脂肪细胞的来源也不同。经典的褐色脂肪细胞与肌肉细胞同源；但是beige脂肪细胞存于白色脂肪组织中。研究发现，在一定条件下，冷冻，特定基因的敲除或者视黄酸(retinoidacid，RA)，成纤维细胞生长因子21(FGF21)等药物的刺激，beige脂肪细胞可以由白色脂肪细胞转分化而来，例如专利CN104224780A和CN105287552A分别公开了哈尔明碱和阿西替尼均能够促进白色脂肪细胞褐色化。虽然对beige脂肪细胞的研究受到了广泛关注，但是相关药物的发现基本都属于西药，而西药副作用较大已经在人们观念中形成共识，长期用来治疗和预防肥胖以及相关代谢疾病对人体有一定损伤。中药相对于西药副作用较小，但现有技术中天然中草药多应用于美容瘦身、养生排毒、调理脾胃肠等，虽然有减肥的效果，但多是从调理脾胃肠方面来实现，并没有促进白色脂肪细胞褐色化的作用。因此，研发可以使白色脂肪细胞褐色化(即转分化为beige脂肪细胞)的天然中药药物对于人类肥胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有促进白色脂肪细胞褐色化的中药组合物及其制备方法和应用，使得所述中药组合物能够促进白色脂肪细胞褐色化，可应用于相关保健品、食品以及药品的制备中。本发明的另一个目的在于提供一种具有促进白色脂肪细胞褐色化的中药组合物及其制备方法和应用，使得所述中药组合物能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖，缓解胰岛素抵抗症状，并降解多余脂肪，可应用于预防或治疗肥胖及肥胖相关代谢疾病药物、保健品或食品的制备中。为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：一种具有促进白色脂肪细胞褐色化的中药组合物，黄芪、黑胡椒和甘草制成。本发明针对现有技术中缺乏促进白色脂肪细胞褐色化的天然中草药产品的问题，根据药物特性，以药食同源的天然原料制成了安全、有效的促进白色脂肪细胞褐色化中药产品，进而能够发挥其治疗/预防肥胖及其相关代谢疾病的作用。其中，本发明所述制成可通过中药提取领域中的醇提、水提等方式制备而成，在本发明具体实施中优选采用水提取方式。作为优选，本发明所述中药组合物以重量份计，由10-99份黄芪、1-80份黑胡椒和1-99份甘草制成，其中黑胡椒占三者总重的百分比不超过40％；进一步优选地，由10-55份黄芪、1-40份黑胡椒和1-35份甘草制成；更优选地，由20-45份黄芪、1-20份黑胡椒和1-25份甘草制成。在本发明的具体实施过程中，所述中药组合物可按照如下重量份原料药制成：(1)20份黄芪、25份黑胡椒、20份甘草；(2)30份黄芪、5份黑胡椒、10份甘草；(3)45份黄芪、1份黑胡椒、1份甘草；(4)45份黄芪、10份黑胡椒、10份甘草；(5)10份黄芪、25份黑胡椒、40份甘草；(6)55份黄芪、20份黑胡椒、25份甘草；(7)55份黄芪、35份黑胡椒、40份甘草；(8)45份黄芪、25份黑胡椒、20份甘草.本发明所述中药组合物无论在体内还是在体外均可以促进白色脂肪细胞褐色化，降解多余的脂肪，帮助肥胖小鼠抵抗高脂饮食诱导的肥胖和缓解其胰岛素抵抗症状，同时对小鼠的进食不造成影响。基于本发明记载的各实验效果，本发明提出了所述中药组合物在制备促进白色脂肪细胞褐色化药物、保健品或食品中的应用，以及在制备预防或治疗肥胖及肥胖相关代谢疾病药物、保健品或食品中的应用。作为优选，所述肥胖相关代谢疾病为糖尿病、脂肪肝、胰岛素抵抗或代谢综合征。此外，本发明还提供了所述中药组合物的制备方法，即称取黄芪、黑胡椒、甘草三种药材进行水提取，提取液浓缩，获得所述中药提取物。具体实施过程中，称取黄芪、黑胡椒、甘草三种药材水提取两次，第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h，两次提取液合并，浓缩，获得所述中药提取物。由以上技术方案可知，本发明选择药食同源的中药组分制备成一种纯天然的促进白色脂肪细胞褐色化的产品，弥补了在此研究领域天然原料产品的空白，在具备安全性的基础上可发挥治疗/预防肥胖及其代谢相关疾病的作用，如降解多余脂肪、抵抗高脂饮食诱导的肥胖和缓解其胰岛素抵抗症状等，同时对正常饮食无不良影响，可应用于相关药物、食品和保健品中。附图说明图1所示为本发明所述中药组合物对Ucp1表达的影响的实验流程图；具体实施方式本发明公开了一种具有促进白色脂肪细胞褐色化的中药组合物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述中药组合物及其制备方法和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的中药组合物、制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下就本发明所提供的一种具有促进白色脂肪细胞褐色化的中药组合物及其制备方法和应用做进一步说明。实施例1：制备本发明所述中药组合物1、原料药20份黄芪、25份黑胡椒、20份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例2：制备本发明所述中药组合物1、原料药30份黄芪、5份黑胡椒、10份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例3：制备本发明所述中药组合物1、原料药45份黄芪、1份黑胡椒、1份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例4：制备本发明所述中药组合物1、原料药45份黄芪、10份黑胡椒、10份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例5：制备本发明所述中药组合物1、原料药10份黄芪、25份黑胡椒、40份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例6：制备本发明所述中药组合物1、原料药55份黄芪、20份黑胡椒、25份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例7：制备本发明所述中药组合物1、原料药55份黄芪、35份黑胡椒、40份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例8：制备本发明所述中药组合物1、原料药45份黄芪、25份黑胡椒、20份甘草2、制备方法按组方配方量分别称取药材，水提取两次：第一次10倍量水，保沸2h，第二次8倍量水，保沸1.5h。两次提取液合并，浓缩，得到所述中药提取物。实施例9：本发明所述中药组合物对Ucp1表达的影响腹股沟的白色脂肪组织是白色脂肪细胞褐色化的主要部位，因此分离此处的细胞用于进行白色脂肪细胞褐色化实验，整个实验流程图见图1。1、实验动物敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的C57小鼠置于SPF级动物房饲养、繁殖。饲养室采用12小时亮灯/12小时黑暗的自动控制体系，饲养室温度始终维持在23℃。小鼠饲喂广东省医学实验动物中心提供的标准饲料(10％kJ脂肪,20％kJ蛋白质,70％kJ碳水化合物)。2、受试物1)上述实施例1所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方1；2)上述实施例2所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方2；3)上述实施例3所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方3；4)上述实施例4所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方4；5)上述实施例5所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方5；6)上述实施例6所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方6；7)上述实施例7所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方7；8)上述实施例8所得的提取物按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为组方8；9)黄芪经上述提取方法按原药材量计算浓缩为0.9g/ml，为黄芪提取物；10)黑胡椒经上述提取方法按原药材量计算浓缩为0.6g/ml，为黑胡椒提取物；11)甘草经上述提取方法按原药材量计算浓缩为0.6g/ml，为甘草提取物；3、原代脂肪间充质干细胞的提取与脂肪细胞的诱导分化1)取一只敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的小鼠，断颈处死，在75％的酒精中浸泡5分钟，然后转移到操作台中，取出腹股沟的白色脂肪；2)用PBS清洗3次，用剪刀将脂肪组织剪碎，1g脂肪组织加入10ml胶原酶I溶液(用D-Hanks溶液配制，100ml加入0.1g胶原酶I)，放置37℃消化40分钟；3)用250μm滤膜过滤，加入细胞培养液，然后转移到离心管中，1000rpm离心3分钟；4)第一次离心后的底部细胞为脂肪间充质细胞，弃除上清后，用新鲜的培养液悬起，铺到培养板中，第二天换液。5)获得的脂肪间充质细胞在添加10％胎牛血清(Hyclone)高糖的DMEM(Hyclone)的培养液生长至80％汇聚度时，传代至24孔培养板中直至长满；6)更换培养液为添加了MDIR(0.5mM异丁基黄嘌呤，1μM地塞米松，87nM胰岛素和0.5μM罗格列酮:IBMX+Dex+Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，培养2天。7)2天后，培养液更换为只添加IR(87nM胰岛素和0.5μM罗格列酮:Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，每两天更换一次，直到细胞完全分化为脂肪细胞。4)将培养基更换为正常的培养基(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，同时添加中草药刺激两天。两天后，裂解细胞，检测荧光素酶活性。4、细胞的荧光素酶信号检测将完全分化的脂肪细胞更换为正常的培养基(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，同时分别添加各受试物刺激两天。两天后，裂解细胞，检测荧光素酶活性，检测方法如下：1)以24孔细胞板的1孔为例，将细胞的培养液移除，然后用300微升的PBS清洗一遍，然后尽量移除干净PBS；2)加入100μL荧光素酶信号检测缓冲液(150mMKCl，20mMHEPES，5mMMgcl2，1mMEGTA。NaOH调节pH至7.0)，放置冰上裂解半小时。随后刮离细胞，转至1.5ml的EP管中。3)低温4℃，13rpm离心20分钟。4)取上清15μL，高糖DMEM培养基15μL和30μLSteady-试剂(Steady-LuciferaseAssaySystem，Promega)混合加入CulturPlateTM-96白色实底96孔板(PerkinElmer)的孔中。5)震荡10分钟。6)荧光照度计上进行测量读数。结果见表1。由表1结果可知，组方1至组方8可以有效地促进解偶联蛋白1的表达，且组方1至组方8均呈剂量依赖性的促进解偶联蛋白1的表达，结果说明组方1至组方8可在体外参与白色脂肪细胞褐色化过程。组方1至组方8不同剂量的相对荧光素酶活性显然高于同等剂量下的单方黑胡椒组，即，组方1至组方8促进解偶联蛋白1的表达活性明显优于单方黑胡椒组。表1各组方及单方不同浓度的相对荧光素酶活性(n＝3)注：与对照组(不加药组)相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；实施例10：本发明所述中药组合物体内促进白色脂肪细胞褐色化实验为了进一步证实实施例1-8八组中药组合物在体内也能促进白色脂肪细胞褐色化并能抵抗高脂饲料引起的肥胖发生，本实施例进行多项验证实验。C57野生型小鼠置于饲养笼中喂养。饲养室采用12小时亮灯/12小时黑暗的自动控制体系，饲养室温度始终维持在23℃。未满8周龄的小鼠饲喂广东省医学实验动物中心提供的标准饲料(15.9kJ/g,10％kJ脂肪,20％kJ蛋白质,70％kJ碳水化合物)。8周龄后的小鼠饲喂来自于ResearchDiet公司的D12492配方配制的60％热量脂肪含量的高脂饲料(21.9kJ/g,60％kJ脂肪,20％kJ蛋白质,20％kJ碳水化合物)。8周龄的C57小鼠喂食高脂饲料8周后，体重达到40g左右，即为饮食诱导肥胖小鼠。开始对这些肥胖小鼠每天进行中草药灌胃处理(灌胃时间为8周，各组合物受试物用量为1.5mg/g小鼠，单方黄芪为1.5mg/g小鼠，单方黑胡椒和甘草分别为1mg/g小鼠)。1、小鼠体重和进食量在灌胃的8周内，每周进行体重和进食测量，结果见表2-3。与对照小鼠相比，所有受试物组方的小鼠的体重低于对照组小鼠的体重，并有显著性差异。和对照小鼠相比，所有受试物小鼠每日进食量没有明显区别(表3)。表2各组方及单方小鼠体重，g(n＝10)注：与对照组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；表3各组方及单方小鼠平均进食量，g/天/小鼠(n＝10)2、小鼠主要部位的脂肪组织重量测定分离小鼠主要部位的脂肪组织进行重量测定(BAT：褐色脂肪组织，Epi：附睾周围白色脂肪组织；Ing：腹股沟白色脂肪组织)。结果见表4，其中灌胃组方1-8及单方黑胡椒和甘草组小鼠的附睾周围白色脂肪组织重量低于对照小鼠，并有显著性差异；其中灌胃组方1-8及单方黄芪和甘草组小鼠的腹股沟白色脂肪组织重量低于对照小鼠，并有显著性差异，其中组方1、组方2和组方4组小鼠腹股沟脂肪组织重量显著性低于单方甘草组；由此结果可知，黄芪、黑胡椒和甘草复方促进白色脂肪组织褐色化的效果优于单方。所有灌胃小鼠和对照小鼠的褐色脂肪组织重量没有显著性差异。表4不同实验组小鼠的脂肪组织称重，g(n＝10)注：与对照组相比，*表示P<0.05；与黄芪组相比，★表示P<0.05；与黑胡椒组相比，#表示P<0.05；与甘草组相比，△表示P<0.05。3、小鼠葡萄糖及胰岛素耐受实验用生理盐水配制10％的葡萄糖溶液，然后按照1g/kg体重的剂量，腹腔注射经12小时禁食(晚上9点-次日早上9点)的小鼠。以血糖仪监测注射前(0分钟)以及注射后小鼠在不同时间点的血糖浓度(15分钟、30分钟、60分钟、120分钟)，时间误差控制在5秒以内。胰岛素耐受实验所用胰岛素剂量为0.5单位/kg体重。但是禁食时间为6小时(早上9点-下午3点)，其余操作方法与葡萄糖耐受实验一致。实验结果见表5-6。结果显示灌胃组方1-8及单方黄芪、黑胡椒和甘草组的小鼠的胰岛素敏感性高于对照小鼠。说明组方1-8及单方黄芪、黑胡椒和甘草均可以改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性和糖尿病症状(表5-6)。表5各组方实验组小鼠不同时间的GTT，(n＝10)表6各组方实验组小鼠不同时间的ITT，(n＝10)4、小鼠血液leptin和Ghrelin测定小鼠血清leptin和Ghrelin测定分别采用R&D和Millipore的ELISAKit。具体步骤如下：1)按照说明书，配置洗涤缓冲液成工作浓度。将包被板用洗涤液洗涤1次。2)先加入matix，然后再加入10μl待测的血清样品和标准品、质量监控样品。其中标准品和质量监控样品加入和血清相应体积的matrixsolution。3)每孔添加检测酶标抗体80ul。封口、振摇孵育2小时。然后用洗涤液300μl/次洗涤3次。每次洗涤后将液体彻底倾倒干净。4)每孔添加酶溶液100μl。封口、振摇孵育半小时。洗涤液300μl/次洗涤5次。5)加入显色底物100μl。封口、振摇孵育15分钟。6)加入终止液100μl终止反应，酶标仪读数OD450和OD590。7)根据标准品绘制标准曲线。计算质量监控样品浓度是否在指定区间。计算待测样品的浓度。ELISA分析各实验组小鼠血液中leptin和ghrelin浓度变化，各实验组之间没有区别(结果见表7)。这与小鼠每日进食量结果一致。表7各组方实验组小鼠血液中leptin和ghrelin，ng/ml(n＝10)leptinghrelin对照组22.70±2.34117.86±9.10组方123.07±2.17120.13±10.09组方222.72±2.91123.82±9.38组方322.32±1.43119.65±9.42组方422.91±3.11118.54±11.31组方521.34±2.75119.33±12.34组方622.64±1.65122.09±11.21组方722.54±1.74121.45±10.07组方821.33±1.78116.67±10.14黄芪21.77±2.90122.31±10.41黑胡椒22.68±4.08115.89±10.09甘草21.93±1.02126.67±11.31以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3