本发明涉及一种来自棉子糖乳球菌的活性化合物与三萜类化合物的联合应用，属于生物领域。
背景技术：
：天然产物是药物先导化合物发现的重要来源，近年来，越来越多的天然产物化学家把目光投向生物种类更加多样的微生物。香鳞毛蕨Dryopterisfragrans（L.）Schott．是一种野生多年生蕨类植物，系鳞毛蕨科鳞毛蕨属。其生境极其特殊，生于海拔700-2400米的林下或高寒地区的滑石坡、森林中的碎石坡上和火山周围的岩浆缝隙中。主要分布于黑龙江省五大连池地质公园内、塔河县白卡兽山、呼中的大白山的高山地带及小兴安岭北部地区。其中尤以生长于五大连池的香鳞毛蕨活性最强。民间流传香鳞毛蕨对银屑病、头皮炎、干癣、痤疮等多种皮肤病有良好的治疗效果。现有技术有人从中分离出具有下述结构式的化合物：经实验证明，该三萜类化合物可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加，该化合物可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段。本发明发现来自棉子糖乳球菌的活性化合物与三萜类化合物的联合应用具有令人惊讶的协同效果。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种来自棉子糖乳球菌的活性化合物与三萜类化合物的联合应用，具体而言，联合应用后可以大大增加对肿瘤的抑制程度，以及对酪氨酸酶的抑制程度。可见，在肿瘤和美白领域会有很好的应用前景。本发明人从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。=ATCC43920=CGMCC1.1935=DSM20443=NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，在MRS液体培养基中培养24-72h，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和ＲP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)经鉴定，化合物1的结构式为：本发明人还惊讶地发现，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。本发明的有益之处在于：本发明公开了一种来自棉子糖乳球菌的活性化合物与三萜类化合物的联合应用，具体而言，联合应用后可以大大增加对肿瘤的抑制程度，以及对酪氨酸酶的抑制程度。可见，在肿瘤和美白领域会有很好的应用前景。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1：本发明人从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。=ATCC43920=CGMCC1.1935=DSM20443=NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，在MRS液体培养基中培养24-72h，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和ＲP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，化合物1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)经鉴定，化合物1为淡黄色粉末，溶于二氯甲烷，分子式为C13H14O3;mp.60摄氏度，化合物1的结构式为：其核谱数据如下所示：经检索核实，和已知文献报告过的化合物一致（天然产物研究与开发NatProdＲesDev2014，26:159-161），但是该文献没有对该化合物的功能进行研究。实施例2：本发明人对实施例1的发酵方法进行改进，发现可以大幅提高该化合物的产量，为低成本工业化生产提供了可能性。本发明基于如下发现：特定浓度范围的甘草查尔酮B配合特定的温度曲线，可以令人惊讶地大幅提高该化合物的产量。甘草查尔酮B购自上海丽臣公司，纯度＞98%。从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。=ATCC43920=CGMCC1.1935=DSM20443=NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，接种进modified-MRS液体培养基中培养48h：前18h保持35摄氏度；第19-22h保持18摄氏度，第23-48h保持30摄氏度培养；所述modified-MRS液体培养基为MRS+0.002%甘草查尔酮B，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和ＲP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，化合物1(36.8mg)、化合物2(8.1mg)。实施例3：现有技术有人从中分离出具有下述结构式的化合物，下称化合物2：经实验证明，该三萜类化合物可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加，该化合物可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段。黑色素为高分子生物色素，主要由2种醌型的聚合物组成，分别是真黑素(eumelanin)和褐黑素(pheomelanin)。黑色素的生物合成首次由Raper和Mason阐明，近年来Cooksey和Schallreuter对其进行了完善。皮肤黑色素的形成过程包括黑色素细胞的迁移、分裂成熟、黑色素小体(melanosome)的形成、黑色素颗粒的转运以及黑色素的排泄等一系列生制生化过程。黑色素的合成必须有3种物质参与：合成黑色素的主要原料酪氨酸（tyrosine，Tyr）；催化酪氨酸转变为黑色素的主要限速酶酪氨酸酶（tyrosinase，Tyr）以及参与此催化过程的氧元素①在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化为多巴醌；②多巴醌自动氧化生成多巴和多巴色素，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌。③多巴色素的反应产物5，6-二羟基吲哚（DHI）和5，6-二羟基吲哚羧酸（DHICA）经一系列的氧化反应生成真黑素，其为皮肤的色素主要组分。④在半胱氨酸或者谷胱甘肽存在的条件下，多巴醌会转变成半胱氨酰多巴，最后生成褐黑素，目前褐黑素在皮肤中的功能尚无文献报道。具有以上6种作用机制的化合物中，只有特异性的酪氨酸酶灭活剂和特异性的酪氨酸酶抑制剂能直接作用于酪氨酸酶，它们的抑制作用相对较强，而其他几类化合物都是间接作用于酪氨酸酶，抑制作用相对较弱。酪氨酸酶抑制剂根据抑制类型可分为竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和混合型（竞争性/非竞争性）抑制剂3类。酪氨酸酶是一种多活性酶，实验原理是通过测定催化多巴氧化成多巴醌过程中的多巴化酶活性求得酪氨酸酶的抑制效果。在96孔细胞培养板上以密度为3×104细胞/孔接种人黑色素细胞悬液培养24h，用PBS洗涤细胞两次，再加入含有曲通100的PBS溶液，添加L-多巴和待测物多巴。继续培养1h后，计算反应前后的475nmA的差值，结果除以细胞数，作为评价酪氨酸酶活性高低的指标。结果以半数抑制量IC50表示，结果越小，表明美白物质的抑制作用越大。经测定，化合物1的IC50为8.3μM。化合物2不具备酪氨酸酶抑制活性。将化合物1和2按照质量比1:1混合时，IC50为5.3μM。将化合物1和2按照质量比2:1混合时，IC50为4.6μM。将化合物1和2按照质量比1:2混合时，IC50为1.6μM。可见，化合物1和2联合使用，大大增强了酪氨酸酶的抑制活性，尤其是当将化合物1和2按照质量比1:2混合时，IC50仅仅为1.6μM。实施例4：MTT（四唑盐）法测定对人肿瘤细胞的杀伤作用。肿瘤细胞类型：人肝癌HepG-2细胞和人胃癌BGC-823细胞。实验具体操作方法：肿瘤细胞培养于RPMI1640基质中（含有10%L-谷氨酰胺的胎牛血清，100μg·mL−1盘尼西林，100μg·mL−1链霉素）。取处于对数生长期的肿瘤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，以浓度为10×104个mL-1，取180μL的细胞悬液置于96孔板中，每组均设3个平行孔，另设空白孔和对照孔，空白孔未接种细胞，对照孔为不含药物的培养液。于37℃、5%CO2条件下培养24h后，在培养液中加入待测样品（样品溶解于DMSO中，用培养基逐步稀释，加入细胞中药液的DMSO终浓度低于1%），使药物终浓度为0、5、25、50、75、100μM。溶液继续在37℃5%CO2培养箱中共同培养48h。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，溶解于PBS中，继续培养4h后，终止培养。小心吸弃上清液，每孔加入150μLDMSO，摇床上震荡10min，使结晶物完全充分溶解。用酶标仪在570nm处测每孔的吸光值（A），计算出细胞存活抑制率：细胞存活抑制率%=[1-(实验组A-空白组A)/（对照组A-空白组A）]×100%。数据使用SPSS软件分析系统进行处理。实验结果：不同浓度该新化合物对肿瘤细胞的存活抑制率实验数据见下表。化合物1对肿瘤细胞的抑制作用：药物浓度人肝癌HepG-2细胞抑制率（%）人胃癌BGC-823细胞抑制率（%）5μM0025μM0050μM2.356.52100μM5.987.39化合物2对肿瘤细胞的抑制作用：药物浓度人肝癌HepG-2细胞抑制率（%）人胃癌BGC-823细胞抑制率（%）5μM3.22.925μM10.915.850μM22.930.8100μM35.946.7化合物1+化合物2按照质量比1:1联合使用时对肿瘤细胞的抑制作用：药物浓度（化合物1+2的总浓度）人肝癌HepG-2细胞抑制率（%）人胃癌BGC-823细胞抑制率（%）5μM35.940.125μM55.960.750μM75.879.9100μM90.190.3结果表明，化合物1+2联合使用物对上述肿瘤细胞均有显著的生长抑制作用具有显著的协同作用。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3