YAP1基因及抑制剂在增强膀胱癌干细胞化疗敏感性中的应用的制作方法

本发明属于生物化学领域，涉及膀胱癌干细胞化疗敏感性相关靶点的发现和靶点抑制剂的开发，具体涉及YAP1基因及抑制剂在增强膀胱癌干细胞化疗敏感性中的应用。

背景技术：

肿瘤干细胞是指肿瘤中具有无限自我更新能力并能产生出异质性肿瘤细胞的细胞。研究发现，这类细胞与肿瘤的生长、转移和复发具有密切联系。这类细胞的很多性质与干细胞类似，因此将其称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞理论认为，发生肿瘤的根源就是机体组织中形成了肿瘤干细胞，肿瘤治疗后的复发以及耐药性也都与肿瘤干细胞有关。肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞相比具有很高的体内成瘤能力，且不易被杀伤去除。

膀胱癌是我国泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈现不断增高的趋势。临床上70％左右的膀胱癌患者确诊时为非肌层浸润性膀胱癌，其主要治疗方法为经尿道膀胱肿瘤电切术，但术后复发率高是导致手术治疗失败的主要原因。目前预防非肌层浸润性膀胱癌患者术后复发及进展的最有效办法是在术后辅以膀胱灌注疫免抑制剂或化疗药物。尽管膀胱灌注在近期具有一定的疗效，但目前常用的灌注药物均存在不同程度的全身或局部毒副反应，包括骨髓抑制、过敏反应以及膀胱刺激征等。此外，仍有20％左右的患者虽经膀胱灌注但肿瘤仍会复发。患者一旦进展为转移性膀胱癌，治疗主要釆用以顺铂为主的化疗方案，尽管大多数膀胱癌患者对含顺铂的化疗方案比较敏感，但是其疗效却并不能持久，容易出现耐药性，从而化疗敏感性降低。鉴于目前膀胱癌灌注药物和化疗药物疗效的不稳定性，寻找安全而有效的膀胱癌治疗药物已经成为肿瘤治疗领域研究的热点和难点。

Hippo通路在人体发育和肿瘤形成过程中发挥重要作用，其通过调节细胞增殖和凋亡之间的动态平衡，调控发育过程中组织器官的大小和重量。最新研究表明，Hippo通路在细胞自我更新、干细胞扩增、组织特异性前体细胞再生和组织再生过程中亦起重要作用。Hippo通路由大量的上游信号通路分子激活，导致YAP1等下游转录因子磷酸化和功能抑制。YAP1即yes相关蛋白，是Hippo通路中重要的靶分子，以磷酸化的形式参与细胞内信号转导和下游靶分子的转录共激活。YAP1本身并不具有转录活性，其在肿瘤形成过程中的作用仍有争议。大量研究表明，YAP1在肿瘤形成过程中的不同作用可能具有组织和细胞特异性。一方面，YAP1能够联合p73诱导细胞凋亡应对DNA损伤，具有抑癌作用；另一方面，YAP1在一些恶性肿瘤如肝细胞癌中高表达，提示其具有促癌作用。YAP1作为转录共激活因子之一，可与癌基因或抑癌基因转录因子特异性结合，发挥相应的功能，并且结合靶点具有组织特异性。

目前尚未见YAP1基因及抑制剂在增强膀胱癌干细胞化疗敏感性方面的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供YAP1基因及抑制剂在增强膀胱癌干细胞化疗敏感性中的应用，以提高化疗药物对膀胱癌的治疗效果。

本发明上述目的是通过以下技术方案得以实现：

YAP1基因高表达作为靶点在制备增强膀胱癌干细胞化疗敏感性的药物中的应用。

一种增强膀胱癌干细胞化疗敏感性的药物，其有效成分为YAP1基因高表达的抑制剂。

优选地，所述抑制剂为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、小分子化合物、肽、抗体中的一种或多种。

优选地，小分子化合物为2-胺基苯并恶唑衍生物。

优选地，所述2-胺基苯并恶唑衍生物选自如下结构衍生物1-3中的一种：

衍生物1

衍生物2

衍生物3

一种增强膀胱癌干细胞化疗敏感性的复方药物，其有效成分为上述抑制剂以及化疗药物。

优选地，化疗药物为铂类药物或丝裂霉素C。

优选地，所述铂类药物为顺铂。

本发明的有益效果：

本发明证明YAP1基因与膀胱癌干细胞化疗敏感性有关，YAP1基因高表达的抑制剂可以通过下调YAP1基因表达提高膀胱癌干细胞对化疗药物丝裂霉素C和顺铂的化疗敏感性，提高化疗药物丝裂霉素C和顺铂对膀胱癌干细胞的抑制率。YAP1基因高表达的抑制剂可以为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、小分子化合物、肽、抗体中的任意一种或多种。

附图说明

图1为YAP1mRNA相对表达量；

图2为YAP1蛋白相对表达量；

图3为丝裂霉素C对膀胱癌干细胞的抑制率。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：膀胱癌干细胞的分选

一、实验材料

人膀胱癌T24细胞株，培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，培养箱温度37℃，CO2浓度5％，每2天换液1次。

细胞抑制率实验使用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒：根据说明书使用，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

细胞周期检测使用细胞周期即时检测试剂盒检测，然后流式细胞仪分析。

二、实验方法

1、化疗药物干预培养分选耐药膀胱癌细胞

在T75培养瓶中接种T24细胞5×10⁶个，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养24小时后，随机分为对照组和分选组。分选组加入丝裂霉素C至终浓度为2mg/mL，对照组加入等体积的PBS。干预24小时后测定细胞抑制率，收集耐药细胞备用。

2、细胞周期分析

将上述分选收集的耐药细胞用PBS重悬成1×10⁶/mL的细胞悬液，离心去上清，用细胞周期即时检测试剂盒检测对照组和分选组细胞的细胞周期，操作方法见试剂盒说明书。最后使用流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处红色荧光。

3、RT-PCR测定干细胞标志物OCT-4和NANOG表达

采用Trizol试剂盒提取上述耐药细胞的总RNA，紫外分光光度计测A260、A280值，计算RNA含量。采用特异性OCT-4逆转录引物(F：5’-TCAGCCAAACGACCATCTGC-3’；R：5’-TTCTCCAGGTTGCCTCTCAC-3’)、NANOG逆转录引物(F：5’-CAGCTGTGTGTACTCAAT GATAGATTT-3’；R：5’-ACACCATTGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3’)及GAPDH内参逆转录引物(F：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’；R：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’)进行逆转录，获取产物再行琼脂糖凝胶电泳，在灯下分析条带，计算相对表达量。

按试剂盒说明书和常规RT-PCR操作。

4、Western Blot测定干细胞标志物OCT-4和NANOG表达

用蛋白质裂解液裂解上述耐药细胞，匀浆后离心取上清，采用BCA试剂盒测蛋白含量。按50μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳。湿转印法将蛋白质转印至PVDF膜；50g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入OCT-4兔抗人单克隆抗体稀释液、NANOG兔抗人多克隆抗体稀释液及β-actin兔抗人多克隆抗体稀释液，室温摇床轻摇过夜；TBST洗膜，加入羊抗兔IgG的二抗，室温摇床轻摇1.5h；TBST充分漂洗，加入ECL显色液，自动凝胶分析仪照相，以相应蛋白条带灰度值除以内参β-actin灰度值校正得到相应蛋白的相对表达量。

三、实验结果

1、耐药膀胱癌细胞分选结果

分选组丝裂霉素C作用24小时后，T24细胞株的抑制率达90％以上。细胞周期分析显示，分选组有80％以上的细胞处于G0/G1期，S期占15％以下；而对照组有60％以上的细胞处于S期，G0/G1期占30％以下。结果说明，分选组获得的耐药细胞多数处于G0/G1期，符合干细胞的细胞周期特征。

2、干细胞标志物OCT-4和NANOG在耐药细胞中的表达情况

RT-PCR法测定结果表明，与对照组相比，分选组干细胞标志物OCT-4的表达增强26倍，干细胞标志物NANOG的表达增强32倍；Western Blot法测定结果显示同样的趋势，OCT-4和NANOG表达显著增强，分选组与对照组差异显著(P＜0.01)。

申请人还测试了经其他浓度丝裂霉素C干预获得的耐药细胞中干细胞标志物OCT-4和NANOG的表达，这两种标志物的表达均显著增强，且呈剂量依赖性。

上述结果证明，经丝裂霉素C干预后剩余耐药性细胞具有干细胞潜能，膀胱癌的耐药性可能与这些膀胱癌干细胞的存在有关。

实施例2：YAP1基因在膀胱癌干细胞中的表达及与化疗敏感性的关系

一、实验材料

人膀胱癌T24细胞株，培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，培养箱温度37℃，CO2浓度5％，每2天换液1次。

膀胱癌干细胞，采用实施例1方法分选得到耐药细胞。

靶向干扰YAP1的siRNA以及siRNA阴性对照由上海吉玛提供。

二、实验方法

1、细胞培养和转染

收集耐药细胞接种在培养板上，随机分为空白对照组、siRNA干扰组和siRNA阴性对照组。空白对照组不进行转染处理；siRNA干扰组转染干扰YAP1的siRNA；siRNA阴性对照组转染siRNA阴性对照。转染按照脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000说明书操作。

2、RT-PCR测定膀胱癌干细胞中YAP1表达

转染处理后收集各组耐药细胞，用PBS洗涤、离心弃上清，采用Trizol试剂盒提取上述耐药细胞的总RNA，紫外分光光度计测A260、A280值，计算RNA含量。以总RNA 1μg的上样量按照Taka逆转录试剂盒说明书进行逆转录，采用特异性YAP1逆转录引物(F：CAACTCCAACCAGCAGCAACA；R：GCAGCCTCTCCTTCTCCATCTG)及GAPDH内参逆转录引物进行逆转录，获取产物再行琼脂糖凝胶电泳，在灯下分析条带，计算相对表达量。

3、Western Blot测定膀胱癌干细胞中YAP1表达

转染处理后收集各组耐药细胞，PBS洗涤后用蛋白质裂解液裂解耐药细胞，匀浆离心取上清，采用BCA试剂盒测蛋白含量。按50μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳。湿转印法将蛋白质转印至PVDF膜；50g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入YAP1和β-actin一抗稀释液，室温摇床轻摇过夜；TBST洗膜，加入二抗室温摇床轻摇2h；TBST充分漂洗，加入ECL显色液，自动凝胶分析仪照相，以相应蛋白条带灰度值除以内参β-actin灰度值校正得到相应蛋白的相对表达量。

4、丝裂霉素C对转染处理后的膀胱癌干细胞的抑制率

转染处理后，用不含胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤各组耐药细胞，然后以含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养4小时，加入丝裂霉素C至终浓度为2mg/mL，干预8小时后测定细胞抑制率。

三、实验结果

1、siRNA干扰结果

RT-PCR法测定结果表明，与空白对照组相比，siRNA干扰组YAP1的表达下调24倍，siRNA阴性对照组与空白对照组无显著差异；Western Blot法测定结果显示同样的趋势，siRNA干扰组YAP1表达显著下调，与空白对照组差异显著(P＜0.01)，siRNA阴性对照组与空白对照组无显著差异。siRNA对YAP1干扰成功。

2、丝裂霉素C对转染处理后的膀胱癌干细胞的抑制率

干预8小时后，丝裂霉素C对siRNA干扰组中膀胱癌干细胞的抑制率为90.5％，而对siRNA阴性对照组中膀胱癌干细胞的抑制率仅为18.6％。

实施例3：小分子化合物对膀胱癌干细胞化疗敏感性的影响

一、实验材料

相关实验材料同实施例1和实施例2。

二、实验方法

1、细胞培养和分组

收集耐药细胞，用含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养4小时后，随机分为空白对照组、实验组1-3，各组添加如表1所示结构和终浓度的增敏剂继续干预培养12小时。

表1各组增敏剂的化学结构和在培养基中的浓度

2、RT-PCR测定膀胱癌干细胞中YAP1表达

干预培养12小时后，收集空白对照组、实验组1-3的耐药细胞，PBS洗涤、离心弃上清，采用Trizol试剂盒提取上述耐药细胞的总RNA，紫外分光光度计测A260、A280值，计算RNA含量。以总RNA 1μg按照Taka逆转录试剂盒说明书进行逆转录，采用特异性YAP1逆转录引物(序列同前)及GAPDH内参逆转录引物(序列同前)进行逆转录，获取产物再行琼脂糖凝胶电泳，在灯下分析条带，计算相对表达量。

3、Western Blot测定膀胱癌干细胞中YAP1表达

干预培养12小时后，收集空白对照组、实验组1-3的耐药细胞，PBS洗涤，用蛋白质裂解液裂解，匀浆后离心取上清，采用BCA试剂盒测蛋白含量。按50μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳。湿转印法将蛋白质转印至PVDF膜；50g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加入YAP1和β-actin一抗稀释液，室温摇床轻摇过夜；TBST洗膜，加入二抗室温摇床轻摇2h；TBST充分漂洗，加入ECL显色液，自动凝胶分析仪照相，以相应蛋白条带灰度值除以内参β-actin灰度值校正得到相应蛋白的相对表达量。

4、丝裂霉素C对膀胱癌干细胞的抑制率

干预培养12小时后，用不含胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤各组耐药细胞，然后以含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养4小时，加入丝裂霉素C至终浓度为2mg/mL，干预8小时后测定细胞抑制率。

三、实验结果

1、增敏剂孵育对YAP1表达的影响

RT-PCR法测定结果表明，与空白对照组相比，实验组1-3中YAP1mRNA的表达显著下调(如图1所示)；Western Blot法测定结果显示同样的趋势，实验组1-3中YAP1蛋白的表达显著下调(如图2所示)。结果表明实验组1-3中的增敏剂可以显著下调YAP1基因表达。

2、丝裂霉素C对增敏剂处理后的膀胱癌干细胞的抑制率

干预8小时后，丝裂霉素C对各组膀胱癌干细胞的抑制率如图3所示。

结果表明，表1中2-胺基苯并恶唑衍生物通过下调膀胱癌干细胞YAP1基因的表达增强膀胱癌干细胞对化疗药物丝裂霉素C的敏感性，从而提高化疗药物对膀胱癌干细胞的抑制率。发明人用顺铂替代丝裂霉素C，结果YAP1下调的膀胱癌干细胞对顺铂的敏感性也显著提高。

本发明证明YAP1基因与膀胱癌干细胞化疗敏感性有关，YAP1基因高表达的抑制剂可以通过下调YAP1基因表达提高膀胱癌干细胞对化疗药物丝裂霉素C和顺铂的化疗敏感性，提高化疗药物丝裂霉素C和顺铂对膀胱癌干细胞的抑制率。YAP1基因高表达的抑制剂可以为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、小分子化合物、肽、抗体中的任意一种或多种。