本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病是呼肠弧病毒引起的一种雏鸡急性、接触性传染病。由于该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一。现在市场上法氏囊病毒的免疫有活疫苗和灭活疫苗两类疫苗。活疫苗毒力弱的免疫效果差，毒力较强的对法氏囊有伤害且影响免疫效果；灭活疫苗保留了完整的病毒结构在不影响免疫效果的同时大大提高了安全性能。
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。
禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。目前已经证明，禽I群腺病毒，特别是针对高致病性的FAV-4型可通过灭活疫苗进行有效防控，其中巴基斯坦采取感染鸡的肝脏匀浆制备的甲醛灭活疫苗防控心包积液-肝炎综合征获得了显著成功。
现有技术对禽I群腺病毒灭活疫苗的制备多采用鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肾细胞(CEK)、雏鸡肾细胞(CK)、鸡胚肝细胞(CEL)4种原代细胞分离和增殖病毒。但原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入CEF，不利于实验操作。
鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)是由一位日本学者在1981年所建立的。通过使用二乙基亚硝胺对雄性来航鸡长期进行诱导，导致鸡体产生肝癌，再从肝癌组织中分离细胞而得到的。LMH呈典型上皮细胞特征，该细胞系保持了鸡肝细胞分化的大量表型特征，主要用于重组腺病毒的构建。公开号为CN 105420198 A的中国专利申请“鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主的应用”以鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主，证明鸡肝癌细胞系适用于病毒培养。
目前没有利用LMH细胞系生产法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的相关报道。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法。
本发明提供的技术方案为如下：
本发明提供一种用LMH细胞系生产鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：
(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞单层，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接种；
(2)种毒繁殖：分别将鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒毒种按终体积为1:50～1:500接种到步骤(1)制备的单层细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液于37℃、5％CO2单独培养58±2小时，直至细胞病变CPE达80％以上，分别收获鸡传染性法氏囊细胞病毒液和禽腺病毒4型细胞病毒液；
(3)病毒收集、浓缩和纯化：分别将收获的鸡传染性法氏囊细胞病毒液和禽腺病毒4型细胞病毒液置于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，然后分别使用50K中空纤维柱进行浓缩，即为鸡传染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液；
(4)将上述两种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。
进一步地，上述步骤(1)中的DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
进一步地，上述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
进一步地，上述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
进一步地，所述步骤(2)的细胞维持液还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。
其中，上述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。
进一步地，上述步骤(2)中pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶。
进一步地，上述步骤(4)两种病毒的制苗病毒液在进行灭活前需进行病毒含量测定，具体为：将制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 5个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变CPE，计算TCID50。
本发明用于制备法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗的两种病毒的制苗病毒液的滴度必须满足以下条件，具体为：步骤(4)中两种病毒的制苗病毒液等体积混合后，使0.1ml水相中鸡传染性法氏囊含量≥108.0TCID50，禽腺病毒4型病毒含量≥108.2TCID50。
进一步地，所述步骤(4)中病毒的灭活采用福尔马林灭活，所述福尔马林在制苗病毒液的终浓度为0.1％。
进一步地，所述步骤(4)将疫苗抗原乳化制成乳剂型灭活疫苗具体为：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
(2)水相制备：取灭活后的鸡传染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份，加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
本发明人发现在LMH细胞单层分别进行鸡传染性法氏囊、禽腺病毒4型毒种接毒后，加入常规的细胞维持液，LMH细胞很快出现死亡，导致最终制得的病毒疫苗效价较低。本发明人通过大量的试验和筛选对细胞维持液的配方进行改进，发现在低含量新生牛血清的DMEM培养液中加入一定量的过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸，可显著改善LMH细胞的生长状态，避免LMH细胞过早出现死亡，从而获得较高病毒滴度的制苗病毒液。经接毒后的细胞培养58±2小时得到的法氏囊病毒液和禽腺病毒4型病毒液中病毒的含量均可稳定达到107.0-107.5/0.1mL，进一步经浓缩后，病毒的含量均高达108.0TCID50以上，取得了意料不到的技术效果。
此外，采用的LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，非常适用生物反应器进行大规模培养，符合未来疫苗生产趋势，并且细胞活性高，半抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)采用LMH传代细胞分别进行鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒增殖，利用Reed-Muench方法测定两者的TCID50，均可以稳定达到107.0-107.5/0.1mL，病毒滴度是常规鸡胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度届时可以达到100倍水平，并且得到的抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。
(2)本发明提供的二联灭活疫苗免疫动物后抗体产生快，效价高，降低了疫病的发生及蔓延，对鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保护作用，且安全性良好，未出现任何不良反应，稳定有效，保护期长。
(3)本发明通过优化细胞培养液的配方，创造性地添加过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸，使分别进行鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型病毒接毒后的LMH细胞在低含量新生牛血清的DMEM培养液中仍能保持良好的生长状态，避免细胞过早出现死亡，从而提高制毒疫苗的效价，并在较短的培养时间58±2小时，即可收获滴度较高的病毒液，大大节约了生产成本，提高生产效率。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1脂质体复合物的制备
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4含0.5％(m/v)过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。
实施例2鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制备和病毒含量测定
(1)制苗病毒液的制备：
①传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用质量体积比为0.025％的胰酶-0.02％的EDTA消化分散传代，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)双抗和2.0％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞单层，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于鸡传染性法氏囊病毒和禽腺病毒4型接种。
②种毒繁殖：分别将鸡传染性法氏囊毒种按终体积1:100接种到步骤①制备的细胞，将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附35分钟后吸弃病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)谷氨酰胺、1.0％(v/v)双抗、2.5％(v/v)脂质体复合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，于37℃、5％CO2单独培养60小时，直至细胞病变CPE达80％以上，分别收获鸡传染性法氏囊细胞病毒液和禽腺病毒4型细胞病毒液。
③病毒收集、浓缩和纯化：分别将收获的鸡传染性法氏囊细胞病毒液和禽腺病毒4型细胞病毒液置于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min后收集上清液，然后分别使用50K中空纤维柱进行浓缩，即为鸡传染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液。
(2)病毒含量测定
分别将鸡传染性法氏囊制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 5个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变CPE，计算TCID50。
实施例3鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的灭活及灭活检验
(1)鸡传染性法氏囊/禽腺病毒4型的灭活：将病毒液导入灭活罐内，加入福尔马林溶液，充分混合，福尔马林溶液的最终浓度为0.1％，37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置6℃保存，应不超过1个月。
(2)鸡传染性法氏囊/禽腺病毒4型病毒灭活检验：取灭活检验的样品，用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上，判定为灭活检验合格。
实施例4二联灭活疫苗的配制
本发明可用于配制二联灭活疫苗的条件为：每0.1mL鸡传染性法氏囊病毒含量≥108.0TCID50，每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.2TCID50可用于制备疫苗，所述二联灭活疫苗的制备具体为：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；
(2)水相制备：取实施例2制得的灭活后的鸡传染性法氏囊抗原和禽腺病毒4型各48份，加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；
(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
对比例1、2、3鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制备和病毒含量测定
对比例1鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例2基本相同，区别在于，所述的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液含有过氧化氢酶，而不是过氧化氢酶脂质体，即将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中。
对比例2鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例2基本相同，区别在于，所述的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含过氧化氢酶脂质体。
对比例3鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例2基本相同，区别在于，所述的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含硫辛酸。
并观察按对比例1-3所述的方法制备鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液，不同时间收获的病毒液TCID50，并与实施例2的方法制备鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型制苗病毒液比较，见下表1和2。
表1不同时间收获的鸡传染性法氏囊病毒液TCID50
表2不同时间收获的禽腺病毒4型病毒液TCID50
由对比例1可知，将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中，LMH细胞在较短时间内出现病变，培养36h后，鸡传染性法氏囊CPE比例达到60％，48h后达到90％，而禽腺病毒4型CPE比例达到65％，48h后达到95％，两者的病毒含量远低于实施例2制得病毒液中病毒的含量。由对比例2可知，细胞维持液中不含过氧化氢酶脂质体，LMH细胞在最短时间内出现病变，培养36h后，鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型CPE均达到85％，两者收获病毒液的病毒的含量最低。由对比例3可知，细胞维持液中不含硫辛酸，LMH细胞出现病变的时间与对比例1相当，培养36h后，鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型CPE均达到60％，48h均达到85％，两者的病毒含量远低于实施例2制得病毒液中病毒的含量。以上结果表明在细胞培养液中加入过氧化氢酶脂质体和硫辛酸可显著改善LMH细胞接毒后的生长状态，延缓其出现细胞病变，提高病毒疫苗的效价。
实施例5二联灭活疫苗成品检验
(1)性状
①外观：为乳白色乳剂。
②剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。
③稳定性：吸取疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。
④粘度：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
(2)无菌检验：取成品接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
(3)安全检验：用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1mL，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
(4)甲醛含量测定：
①对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
②被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取被检品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。
③测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。
(5)装量检查：取供试品3个，使之恢复至室温，开启时注意避免损失。参照装量检查使用量取参考表，用经标化的吸管、注射器或量筒进行装量检查。
实施例6疫苗效力试验
取21日龄SPF鸡70只，将四批鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗分别以0.3mL/只胸肌注射，每批灭活疫苗15只SPF鸡，剩余10只作为对照组只注射生理盐水。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，连同对照组分别采血，测定其鸡传染性法氏囊中和抗体效价和21天、35天和49天禽腺病毒4型血清中和抗体效价，结果见下表3-4。
表3免疫后不同时间鸡传染性法氏囊抗体水平
表4免疫后不同时间禽腺病毒4型抗体水平
结果表明，采用本发明的LMH细胞载体能培养出高病毒滴度的鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型；从SPF鸡的免疫效力试验可知，采用本发明生产的鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗免疫SPF鸡不仅能产生高水平鸡传染性法氏囊中和抗体而且还能产生高水平的禽腺病毒4型中和抗体，本发明提供的二联灭活疫苗效力较佳。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。