本发明属水产养殖病害免疫防治
技术领域：
，具体涉及一种海水鱼弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗及规模化化制备技术。
背景技术：
：病原性弧菌是海水养殖动物最重要的细菌性病原，其引起的病害通常被称为“弧菌病”。哈氏弧菌是海水鱼养殖细菌性疾病的重要病原之一。研究人员在研制各类灭活疫苗的同时，也对外膜蛋白亚单位疫苗进行研发以对海水鱼养殖病害进行免疫防治。由于我国水产疫苗研制起步较晚，一些水产领域用于疫病防治的亚单位疫苗基本还处于实验室规模，目前尚未有亚单位疫苗可规模化生产与应用于海水鱼的疾病免疫防治。技术实现要素：为了解决现有技术中的诸多问题，本发明提供了一种弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗及规模化制备技术。本发明通过如下的技术方案来实现：一种哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗，所述疫苗包括以下组分：哈氏弧菌外膜蛋白ompk和montanideisa763a佐剂。优选的，所述哈氏弧菌外膜蛋白ompk与montanideisa763a佐剂的比例为2:3。优选的，所述哈氏弧菌外膜蛋白ompk的浓度高于1.5mg/ml。本发明还提供了一种哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术，该技术包括如下步骤：将哈氏弧菌外膜蛋白ompk溶液和montanideisa763a佐剂，按2:3比例混合搅拌均匀，乳化，无菌灌装，即得到疫苗成品。优选的，所述哈氏弧菌外膜亚单位佐剂疫苗的规模化制备技术包括如下步骤：将20l哈氏弧菌外膜蛋白ompk溶液，加入4lph7.0的无菌磷酸缓冲液，过滤除菌后加入油相罐，将灭菌后的montanideisa763a佐剂36l，缓慢加入，搅拌速度50-100r/min。在搅拌混合30min后，乳化30min，在无菌条件下，灌装制得疫苗成品。优选的，所述所述的哈氏弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗规模化制备技术，其特征在于，所述将哈氏弧菌外膜蛋白ompk溶液的制备包括如下步骤：(1)工程菌一级种子制备(2)工程菌二级种子制备(3)高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体获取(4)外膜蛋白的提取与浓缩。优选的，所述工程菌一级种子制备包括如下步骤：工程菌接种营养琼脂，30℃条件下培养24小时，挑菌苔接种300ml营养肉汤，在30℃，180r/min条件下，培养10小时，得到一级种子液。优选的，所述工程菌二级种子制备包括如下步骤：一级种子液,接种30l发酵培养基，在30℃条件下通气搅拌培养10h，得到二级种子。优选的，所述高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体获取，包括如下步骤：二级种子接种300l发酵培养基，30℃，200r/min，通气量250l/min培养，培养4小时后补料，6小时开始升温42℃诱导表达，每隔1h，取样，测定菌液a600值，直到菌液a600开始下降，停止发酵；测定工程菌体生物量和目标蛋白表达情况；培养得到的工程菌液利用管式离心机离心(13500r/min)收集菌体,称重、-20℃冻融12h以上。优选的，所述外膜蛋白的提取与浓缩包括如下步骤：外膜蛋白的提取与浓缩工程菌体融解、配制悬浮液，超声波破碎4个循环；离心收集包涵体；用100l洗涤液洗涤1次，离心收集沉淀；加入包涵体溶解液，在28℃条件下，裂解2h以上，随后离心收集上清液；切向流超滤收集浓缩液；脱盐、蛋白质复性；测定蛋白质浓度和外膜蛋白的纯度，-20℃保存。本发明提供的海水鱼弧菌病免疫防治的弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗规模化生产技术，其中哈维氏弧菌外膜蛋白ompk，是以哈维氏弧菌ecgs020802基因组dna为模板，克隆得到，并在大肠杆菌重组表达，得到工程菌，通过对工程菌逐级放大培养，在500l发酵罐进行高密度培养与诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体离心得到包涵体，经清洗包涵体，再裂解包涵体，离心得到裂解液，浓缩达一定体积后，进行多轮次脱盐、蛋白复性，最终得到外膜蛋白液，与montanideisa763a佐剂按照一定比例乳化制得外膜蛋白亚单位佐剂疫苗成品。本发明中的海水鱼弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗工厂化制备技术，可规模化生产，降低疫苗制备成本。疫苗可通过注射方式施用，免疫养殖海水鱼类，免疫效果良好，可有效预防弧菌引起的弧菌病，减少病害损失。具体实施方式下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。本实施例提供了一种海水鱼弧菌病免疫防治的弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗规模化生产技术，具体包括如下步骤：(1)一级种子制备工程菌接种营养琼脂，30℃，培养24小时，挑菌苔接种9瓶300ml营养肉汤/瓶，30℃，180r/min，培养10小时，得到2.7l摇瓶种子液。本实施例选择的大肠杆菌dh5α(pbvompk)，为重组菌，由本实验室制备。大肠杆菌dh5感受态购自大连宝生物公司(takara)。(2)二级种子制备2.7l摇瓶种子液,接种40l发酵培养基(50μg/ml氨苄青霉素，50l发酵罐，)，30℃，250r/min，通气量40l/min培养10h，得到二级种子液。(3)高密度培养诱导外膜蛋白表达与工程菌体获取二级种子液接种300l发酵培养基(500l发酵罐)，30℃，200r/min，通气量250l/min培养，在培养4小时后开始补料(补料培养基100l)，6小时开始升温诱导表达，每隔1h，取样，测定菌液a600值，直到菌液a600开始下降，停止发酵；测定工程菌体生物量和目标蛋白表达情况；培养得到的工程菌液利用管式离心机离心(13500r/min)收集菌体,称重、冰柜(-20℃)冻融12h以上。三批次的高密度诱导培养，工程菌生物量均超过25g/l，离心后收率80％以上(表1)。表1500l发酵罐高密度培养工程菌体得率(4)外膜蛋白的提取与浓缩工程菌体融解、配制悬浮液(湿菌体：无菌水＝1：30)，超声波破碎4个循环(菌悬液基本变清)；离心收集包涵体(13500r/min)；用100l洗涤液洗涤1次，离心收集沉淀；加入包涵体溶解液(包涵体：裂解液为质量体积比1:200)，28℃，裂解2h以上(反应罐，80-100rpm)，离心收集上清(13500r/min)；切向流超滤收集浓缩液(浓缩到一定体积，离心得到的上清液蛋白浓度而定)；脱盐、蛋白质复性(分6批次加入与浓缩液等体积的透析液，每次透析至原来浓缩的体积后再添加等体积的透析液，6次重复操作，最后收集透析过的浓缩液)；测定蛋白质浓度和外膜蛋白的纯度，-20℃保存；三批次外膜蛋白提取与浓缩，蛋白液浓度(折算为纯蛋白)2mg/ml(表2)表2外膜蛋白分离提取批次123浓缩后体积(l)202020浓缩蛋白浓度(mg/ml)5.953.136.25蛋白纯度(％)66.569.749.3外膜蛋白浓度(mg/ml)3.962.183.08折算收率(mg/l培养基)198109154(5)montanideisa763a佐剂疫苗制备(montanideisa763a佐剂：外膜蛋白液＝3:2)将外膜蛋白浓缩液20l，解冻，加入4l无菌磷酸缓冲液(ph7.0)，合计24l，除菌后加入油相罐，将灭菌后的montanideisa763a佐剂36l，缓慢加入，搅拌速度50-100r/min。在混合30min后，乳化30min，在无菌条件下，灌装保存(100ml塑料瓶),密封，置2～8℃保存。经检验测定，海水鱼弧菌外膜蛋白亚单位疫苗外观为均一的乳白色粘稠乳剂，稳定性、粘度、无菌检验合格。本发明制备的弧菌外膜蛋白亚单位佐剂疫苗的免疫效果如下所述：将健康斜带石斑鱼和鲫鱼(10-20g/尾)随机分成组，每组20-30尾。注射疫苗免疫组，每尾腹腔注射实施例一所制备的弧菌外膜蛋白亚单位疫苗0.1ml；对照组不注射疫苗。水温为24-28℃。在免疫28d后，分别用3×107cfu/ml的哈维氏弧菌ecgy020401株腹腔注射感染每组试验鱼，并饲养观察7天，记录各组试验鱼的发病和死亡情况。三批疫苗攻毒免疫保护效果实验结果表明，注射免疫组对哈维氏弧菌ecgy020401株的相对免疫保护率斜带石斑鱼和鲫鱼均在60％以上(见表3、4)。表3疫苗效力检验(石斑鱼)相对保护率(rps)＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率)×100％表4疫苗效力检验(鲫鱼)本实施例中培养基具有如下组分：lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10、酵母浸出物5、氯化钠10；发酵培养基(g/l)：酵母抽提物5、胰蛋白胨10、氯化钠lo、葡萄糖8、硫酸镁0.5、磷酸氢二钠4、磷酸二氢钠3、磷酸氢二钾4、硫酸铵1.2、ph7.4；补料培养基(g/l)：蛋白胨50、酵母膏100、硫酸镁5、葡萄糖100；所采用的溶液参数如下：尿素洗涤液：50mmtris-cl(ph8.5)2m尿素2.5mmedta2.5mmβ-巯基乙醇包涵体溶解液(变性液)：50mmtris-cl(ph8.0)8m尿素10mmedta10mmβ-巯基乙醇，透析液：50mmtris-cl(ph8.0)，20％甘油。本实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12