本发明涉及一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法及应用。
背景技术：
马勃别名灰包、马粪包，是一类担子菌门的真菌通称，分布广泛，始载于《名医别录》，其干燥子实体可入中药，具有止血、抗菌、抗癌等功效。从20世纪60年代以来，由于马勃特殊的药理作用，使其倍受医药界的关注。中国药典2005版规定灰包科脱皮马勃、大马勃和紫色马勃的干燥子实体做为药用马勃正品。
马勃最早应用于外伤出血，被称为止血良药。出血是导致创伤后早期死亡的重要原因，因此创伤后止血发挥越来越大的作用，有效的止血是救治的前提。近年来，随着现代科学技术的高速发展，止血敷料的研究取得了非常快的进展。以天然中草药为主体研发的止血药具有很大的前景，很可能成为止血领域的朝阳产业。中草药是中国的瑰宝，源远流长。我国地域广阔，拥有世界上最丰富的中草药资源，品种众多，比起其它国家具有得天独厚的条件。
马勃作为传统中草药，不但具有止血活性，而且具有抗菌活性，在创伤发生后，可以先抑制细菌感染，再止血。特别是在野外、战场等恶劣环境下，由于伤口易化脓和感染，更是无法发挥其止血作用。而目前临床所用的马勃止血药主要为马勃孢子粉、马勃菌丝海绵或直接将马勃粉碎。针对当前对出血的治疗情况来看，如何进行有效、快速地止血，预防感染，开发马勃促凝血有效成分冻干提取物这种止血新产品，对提高平、战时伤员的救治水平具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种能有效、快速止血，抑菌的马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法及应用。
本发明的一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法如下：
一、将马勃进行自然阴干，然后使用粉碎机进行粉碎，粉碎后置于干燥环境中备用，得到粉碎后马勃；
步骤一中所述的自然阴干是指在阴凉条件下自然风干；
二、向步骤一得到的粉碎后马勃中加入溶剂，在温度为85～95℃的条件下煎煮3～5次，每次1.5h～2.5h，将各次煎煮液过滤后合并，对过滤后合并得到的煎煮液进行减压浓缩，浓缩至密度为1.050g/cm3～1.200g/cm3，得到马勃浸膏；
步骤二中所述粉碎后马勃的质量与溶剂的体积的比为1g：3ml～20ml；
三、将步骤二得到的马勃浸膏在温度为-80～-88℃、真空度为5pa～100pa的条件下冷冻干燥20h～40h，得到冻干粉，即马勃促凝血有效成分冻干提取物。
本发明的一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的应用如下：
将马勃促凝血有效成分冻干提取物应用于医学领域，用于制备止血抑菌纸巾或止血抑菌纱布；
具体方法如下：
向马勃促凝血有效成分冻干提取物中加入浓度为45％的食品级乙醇，配制成马勃促凝血有效成分冻干提取物质量浓度为3％～5％的马勃混悬浸渍液，然后将纸巾或纱布浸没于马勃混悬浸渍液中，2min～10min后取出，挤出液体后，在温度为62～65℃的条件下干热消毒30min～40min，得到止血抑菌纸巾或止血抑菌纱布。
本发明的有益效果：
本发明用溶剂提取法对马勃促凝血有效部位进行筛选，然后将粗提物采用真空冷冻干燥机干燥，得到马勃促凝血有效成分冻干提取物，本发明制备的马勃促凝血有效成分冻干提取物具有优异的促进血液凝固的作用，当每毫升蒸馏水中马勃促凝血有效成分冻干提取物含量为5mg时，血液凝聚时间最短可达201s，促进血液凝固优异。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法如下：
一、将马勃进行自然阴干，然后使用粉碎机进行粉碎，粉碎后置于干燥环境中备用，得到粉碎后马勃；
二、向步骤一得到的粉碎后马勃中加入溶剂，在温度为85～95℃的条件下煎煮3～5次，每次1.5h～2.5h，将各次煎煮液过滤后合并，对过滤后合并得到的煎煮液进行减压浓缩，浓缩至密度为1.050g/cm3～1.200g/cm3，得到马勃浸膏；
步骤二中所述粉碎后马勃的质量与溶剂的体积的比为1g：3ml～20ml；
三、将步骤二得到的马勃浸膏在温度为-80～-88℃、真空度为5pa～100pa的条件下冷冻干燥20h～40h，得到冻干粉，即马勃促凝血有效成分冻干提取物。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中自然阴干72h～120h。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述的溶剂为食品级乙醇。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中所述的食品级乙醇浓度为0～95％。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述的在温度为90℃的条件下煎煮3次，每次2h。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中对过滤后合并得到的煎煮液进行减压浓缩，浓缩至密度为1.140g/cm3，得到马勃浸膏。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中所述的粉碎后马勃的质量与溶剂的体积的比为1g：15ml。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中所述的将步骤二得到的马勃浸膏在温度为-80℃、真空度为100pa的条件下冷冻干燥30h，得到冻干粉。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的应用，其特征在于将马勃促凝血有效成分冻干提取物应用于医学领域，用于制备止血抑菌纸巾或止血抑菌纱布。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是将马勃促凝血有效成分冻干提取物应用于制备止血抑菌纸巾或止血抑菌纱布的具体方法如下：
向马勃促凝血有效成分冻干提取物中加入浓度为45％的食品级乙醇，配制成马勃促凝血有效成分冻干提取物质量浓度为3％～5％的马勃混悬浸渍液，然后将纸巾或纱布浸没于马勃混悬浸渍液中，2min～10min后取出，挤出液体后，在温度为62～65℃的条件下干热消毒30min～40min，得到止血抑菌纸巾或止血抑菌纱布。其他步骤及参数与具体实施方式九相同。
用以下试验验证本发明的有益效果
试验一、本试验的一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将马勃进行自然阴干，然后使用粉碎机进行粉碎，粉碎后置于干燥环境中备用，得到粉碎后马勃；
步骤一中自然阴干120h；
二、向200g步骤一得到的粉碎后马勃中加入3000ml蒸馏水，在温度为90℃的条件下煎煮3次，每次2h，将各次煎煮液过滤后合并，对过滤后合并得到的煎煮液进行减压浓缩，浓缩至密度为1.140g/cm3，得到马勃浸膏；
三、将步骤二得到的马勃浸膏在温度为-80℃、真空度为90pa的条件下冷冻干燥30h，得到冻干粉，即马勃促凝血有效成分冻干提取物。
试验二、本试验的一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将马勃进行自然阴干，然后使用粉碎机进行粉碎，粉碎后置于干燥环境中备用，得到粉碎后马勃；
步骤一中自然阴干120h；
二、向200g步骤一得到的粉碎后马勃中加入3000ml浓度为45％的食品级乙醇，在温度为90℃的条件下煎煮3次，每次2h，将各次煎煮液过滤后合并，对过滤后合并得到的煎煮液进行减压浓缩，浓缩至密度为1.140g/cm3，得到马勃浸膏；
三、将步骤二得到的马勃浸膏在温度为-80℃、真空度为90pa的条件下冷冻干燥30h，得到冻干粉，即马勃促凝血有效成分冻干提取物。
试验三、本试验的一种马勃促凝血有效成分冻干提取物的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将马勃进行自然阴干，然后使用粉碎机进行粉碎，粉碎后置于干燥环境中备用，得到粉碎后马勃；
步骤一中自然阴干120h；
二、向200g步骤一得到的粉碎后马勃中加入3000ml浓度为95％的食品级乙醇，在温度为90℃的条件下煎煮3次，每次2h，将各次煎煮液过滤后合并，对过滤后合并得到的煎煮液进行减压浓缩，浓缩至密度为1.140g/cm3，得到马勃浸膏；
三、将步骤二得到的马勃浸膏在温度为-80℃、真空度为90pa的条件下冷冻干燥30h，得到冻干粉，即马勃促凝血有效成分冻干提取物。
验证试验
促凝血实验
1、实验对象：6只体重为2000-2500g的雄性健康家兔(哈长耳白，购于哈尔滨医科大学动物实验中心)
2、实验仪器：秒表(型号：k61，上海星钻秒表有限公司)、天平(型号：fa1004上海精科天平)、水浴锅(型号：cs501-sp重庆四达实验仪器厂)、离心机(型号ldz4-0.8a北京医用离心机厂)、10ml离心管、50ml离心管、10ml一次性注射器、50ml一次性注射器、8mm*10ml一次性试管、6孔白陶瓷板和大头针(国营天津市文教用品一厂)
3、实验试剂：云南白药(云南白药股份有限公司，规格：4g，批号：zda1602购于哈尔滨联想亿百大药房连锁有限公司)、无菌蒸馏水(哈尔滨市蒸馏水厂)、枸橼酸钠(天津市科密欧化学试剂有限公司，规格：500g)、生理盐水(吉林省广春药业有限公司，规格：500ml)、氯化钙溶液：精密量取无水氯化钙1.38g，加蒸馏水至500ml的容量瓶中定容。
4、家兔饲养：购进家兔配方饲料、无菌蒸馏水喂食适应性饲养2天，
5、实验条件：22±5℃，相对湿度60～70％
6、家兔心脏血处置：①用10ml一次性注射器在家兔清醒状态下快速穿刺取心脏血(兔心血液)，备用；②另取20ml步骤①得到的兔心血液置于预先加入0.5ml3.8％枸橼酸钠溶液的10ml离心管中摇匀，备用；③取10ml步骤②得到的抗凝兔心血，3500rpm离心10分钟，分离血浆，4℃保存，备用。
7、样品液配置：精确称取试验一、二和三得到的马勃促凝血有效成分冻干提取物(下称马勃提取物)0.5g，分别置于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，振摇溶解，然后用孔径为0.45μm的水膜过滤，滤液备用。
8、实验操作：
瓷板针挑法：在白瓷板的凹坑内，分别加入各样品液0.1ml，再分别加入氯化钙溶液0.1mll，用大头针把样品液与氯化钙溶液混匀，最后分别同时加入步骤6-②中的抗凝兔心血0.5ml，立即计时，迅速用大头针搅拌混匀且搅拌次数一致。以云南白药为阳性对照，并设空白对照(不加样品液加生理盐水)。以后每30s用大头针穿过血液轻挑1次，当出现血丝时为开始凝血，当推动血块时，露出瓷板白底即算血液完全凝固。从加入抗凝血液到血液完全凝固时间为凝血时间。每个样品液重复实验3次，取其平均值。结果采用平均值和标准偏差表示，采用graphpadprism软件进行统计学分析。测定结果见表1。
表1马勃提取物促凝血实验结果(抗凝兔心血液瓷板针挑法)
*p＜0.05**p＜0.01
马勃提取物抗凝兔心血瓷板针挑法实验结果(表1)表明。马勃提取物与空白对照组均有不同程度地差异，可以表明试验各批样品能有效的缩短兔心血液凝聚时间。
试管法：
取内径为8mm，长10cm的玻璃洁净试管，每管分别加入上述各样品液0.1ml，再分别加入氯化钙溶液0.1ml，摇匀，在37℃水浴温浴1min，然后于各管内同时加入步骤6-①的兔心血液0.5ml，以云南白药为阳性对照，并设生理盐水空白对照，盖紧，倒转3次，立即计时，在37℃的水浴箱中观察，每隔30s轻轻倾斜试管1次，角度为30°，观察血液是否流动，直至倾斜到90°血液不再流动而完全凝固于试管底为止，即为凝血时间，每组重复实验3次，取其平均值。结果采用平均值和标准偏差表示，采用graphpadprism软件进行统计学分析。测定结果见表2。
表2马勃提取物促凝血实验结果(兔心血试管法)
*p＜0.05**p＜0.01
马勃提取物兔心血试管法实验结果(表2)表明。3组马勃提取物和云南白药阳性对照组，均与空白试验组有明显差异(p＜0.01、p＜0.05)。
复钙时间的测定：
取内径为8mm，长10cm的玻璃洁净试管，每管分别加入上述各药液0.1ml，加入的氯化钙溶液0.1ml，摇匀，在37℃水浴温浴1min，再于各管内同时加入0.1ml步骤6-③中的血浆，同时开动秒表计时，每隔15s倾斜试管1次，在混合液中开始出现弥漫的白色颗粒纤维蛋白丝时，即为复钙时间。以云南白药为阳性对照，并设空白对照，每种药物重复3次，取其平均值。结果采用平均值和标准偏差表示，采用graphpadprism软件进行统计学分析。测定结果见表3。
表3马勃提取物促凝血实验结果(兔心血浆复钙时间测定法)
*p＜0.05**p＜0.01
马勃提取物兔心血浆复钙时间测定法结果表明(表3)，3组马勃提取物与空白对照组均有不同程度地差异，可以表明试验各批样品能有效的缩短兔心血液凝聚时间。
结论：通过对3组马勃提取物凝血实验研究证实：马勃提取物和云南白药均能有效的缩短兔心血液凝聚时间，起到促进血液凝固的作用，其中45％乙醇提取物效果最佳。
试验四、将试验二得到的马勃促凝血有效成分冻干提取物应用于医学领域，用于制备止血抑菌纸巾或止血抑菌纱布。
具体方法如下：
向马勃促凝血有效成分冻干提取物中加入浓度为45％的食品级乙醇，配制成马勃促凝血有效成分冻干提取物质量浓度为4％的马勃混悬浸渍液，然后将纸巾浸没于马勃混悬浸渍液中，10min后取出，挤出液体后，在温度为64℃的条件下干热消毒35min，得到止血抑菌纸巾。
向马勃促凝血有效成分冻干提取物中加入浓度为45％的食品级乙醇，配制成马勃促凝血有效成分冻干提取物质量浓度为4％的马勃混悬浸渍液，然后将纱布浸没于马勃混悬浸渍液中，10min后取出，挤出液体后，在温度为64℃的条件下干热消毒35min，得到止血抑菌纱布。