本发明涉及医药
技术领域：
：，具体地说，是阿帕替尼在制备brafv600e蛋白激酶抑制剂中的应用，以及阿帕替尼在制备治疗brafv600e突变肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：：甲磺酸阿帕替尼片(apatinibmesylatetablets，c24h23n5o·ch4o3s，以下简称阿帕替尼)是我国自主研制的1.1类新药，已于2014年批准上市，用于晚期胃腺癌或胃-食管结合部腺癌的三线或三线以后治疗。此外，阿帕替尼针对肺癌、乳腺癌和肝癌的临床试验研究表明，其对多种实体瘤均具有较好的疗效(参见文献：zhangh.apatinibformoleculartargetedtherapyintumor[j].drugdesign,developmentandtherapy,2015,9:6075-6081.)，提示阿帕替尼具有良好的应用前景。黑色素瘤是临床上常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率呈逐年增加的趋势。恶性黑色素瘤发病机制尚未清楚，且对常规治疗极为不敏感，死亡率高(参见文献：王馨苑,黄宁.恶性黑色素瘤细胞死亡与治疗研究进展[j].肿瘤研究与临床,2015,(6):426-429.)。结直肠癌是一种临床常见的肿瘤，其全球发病率、恶化死亡率分别位列恶性肿瘤中的第三位和第四位。结直肠癌的危险因素包括家族遗传、肠炎、吸烟、酗酒、肥胖等多种因素，且常为多种因素同时出现，为结直肠癌的治疗带来了巨大的困难。近年来，我国结直肠癌发病率和死亡率均呈现上升的趋势。(参见文献：brennerh,kloorm,poxcp.colorectalcancer[j].thelancet,2014,383(9927):1490-1502；chenw,zhengr,baadepd,zhangs,zengh,brayf,etal.cancerstatisticsinchina,2015[j].ca:acancerjournalforclinicians,2016,66(2):115-132.)。肺癌是发病率和致死率最高的恶性肿瘤，其中约80％-85％为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)。nsclc早期症状不明显，多数患者在确诊时已为不能手术的中晚期，需要进行药物治疗。阿帕替尼针对晚期非鳞非小细胞肺癌患者的ⅱ期临床研究显示，接受阿帕替尼治疗后，患者的缓解率(responserate,rr)较安慰剂组得到了显著提高(12.2％vs0.00％)，中位无进展生存期(medianprogression-freesurvival,mpfs)得到了显著延长(4.7mvs1.9m)。(参见文献：zhangl,shim,huangc,liux,xiongjp,cheng,etal.aphaseii,multicenter,placebo-controlledtrialofapatinibinpatientswithadvancednonsquamousnon-smallcelllungcancer(nsclc)aftertwoprevioustreatmentregimens.americansocietyofclinicaloncology.2012.)。目前研究表明，阿帕替尼主要通过高效抑制血管内皮细胞生长因子受体-2(vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，vegfr2)来抑制血管新生，从而发挥抗肿瘤活性(参见文献：tians,quanh,xiec,guoh,luf,xuy,etal.yn968d1isanovelandselectiveinhibitorofvascularendothelialgrowthfactorreceptor-2tyrosinekinasewithpotentactivityinvitroandinvivo.cancerscience,2011,102(7):1374-1380.)。但通过与已有文献比较，我们认为对该作用机制表示疑义，主要原因如下：1)作用于vegfr、pdgfr等的多靶点酪氨酸激酶抑制剂——索拉菲尼，其对晚期非鳞非小细胞肺癌患者的ⅲ期临床研究试验结果显示，索拉菲尼的客观缓解率(objectiveresponserate，orr)为4.9％，mpfs为2.8m(参见文献：paz-aresl,hirshv,zhangl,demarinisf,yangjc-h,wakeleeha,etal.monotherapyadministrationofsorafenibinpatientswithnon–smallcelllungcancer(mission)trial.journalofthoraciconcology,2015,10(12):1745-1753.)，该结果与阿帕替尼的ⅱ期临床试验结果(rr：12.2％，mpfs：4.7m)具有较大差距；2)不同种族患者对vegf/vegfr靶向抑制剂的敏感性差异较大，且亚洲人群对其响应较差(参见文献：parkdj,thomasnj,yoonc,yoonss.vascularendothelialgrowthfactorainhibitioningastriccancer.gastriccancer:officialjournaloftheinternationalgastriccancerassociationandthejapanesegastriccancerassociation,2015,18(1):33-42.；vancutseme,dehaass,kangyk,ohtsua,tebbuttnc,mingxuj,etal.bevacizumabincombinationwithchemotherapyasfirst-linetherapyinadvancedgastriccancer:abiomarkerevaluationfromtheavagastrandomizedphaseiiitrial.journalofclinicaloncology:officialjournaloftheamericansocietyofclinicaloncology,2012,30(17):2119-2127.)。braf是一个驱动基因，其v600突变多见于黑色素瘤、甲状腺乳头状癌、卵巢交界性肿瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌和多毛细胞白血病(参见文献：daviesh,bignellgr,coxc,stephensp,edkinss,cleggs,etal.mutationsofthebrafgeneinhumancancer[j].nature,2002,417(6892):949-954.)，并以v600e突变最常见(参见文献：hymandm,puzanovi,subbiahv,farisje,chaui,blayjy,etal.vemurafenibinmultiplenonmelanomacancerswithbrafv600mutations[j].thenewenglandjournalofmedicine,2015,373(8):726-736.)。目前尚未有文献报道阿帕替尼对brafv600e蛋白激酶的抑制作用，以及阿帕替尼对brafv600e突变肿瘤患者的治疗作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供阿帕替尼的新作用靶点和适应症，即其可以作为brafv600e蛋白激酶抑制剂，并通过抑制brafv600e蛋白激酶发挥治疗brafv600e突变肿瘤的作用。本发明从体外细胞培养、体内动物实验和临床研究三个方面研究了阿帕替尼对brafv600e突变的黑色素瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌的抑制作用。通过临床前实验发现，阿帕替尼能有效抑制brafv600e突变的黑色素瘤细胞系和结直肠癌细胞系的增殖，实验还表明，阿帕替尼主要作用机制为抑制braf下游mek、erk信号蛋白的活化，而非抑制vegfr2的磷酸化。体内实验发现，阿帕替尼能明显抑制a375和colo205肿瘤在裸鼠皮下的生长速度，且效果优于brafv600e靶向制剂维罗菲尼。本发明的第一方面，提供阿帕替尼在制备brafv600e蛋白激酶抑制剂中的应用。本发明发现了阿帕替尼能够明显抑制braf下游mek、erk蛋白的磷酸化，从而选择性抑制brafv600e蛋白激酶的活性，具体见实施例1和实施例3。本发明的第二方面，提供阿帕替尼在制备治疗brafv600e突变肿瘤药物中的应用。本发明发现了阿帕替尼通过抑制brafv600e活性发挥抗肿瘤作用，包括对brafv600e突变的黑色素瘤、结直肠癌细胞和非小细胞肺癌的治疗作用。所述的brafv600e突变肿瘤包括brafv600e突变黑色素瘤、甲状腺乳头状癌、卵巢交界性肿瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌和多毛细胞白血病。优选的，所述的阿帕替尼在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。更优选的，所述的阿帕替尼在制备治疗brafv600e突变的黑色素瘤药物中的应用。优选的，所述的阿帕替尼在制备治疗brafv600e突变的结直肠癌药物中的应用。优选的，所述的阿帕替尼在制备治疗brafv600e突变的非小细胞肺癌药物中的应用。优选的，所述的阿帕替尼在制备治疗brafv600e突变的肿瘤药物中的应用，所述的应用具体是，阿帕替尼在给药前，先检测肿瘤样本中braf基因是否发生v600e突变。本发明的第三方面，提供检测brafv600e突变的试剂在制备黑色素瘤、brafv600e突变的结直肠癌，或brafv600e突变的非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。本发明优点在于：本发明为阿帕替尼提供了新的靶点和适应症。本发明也为brafv600e突变的黑色素瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌等肿瘤的治疗提供了新的思路。附图说明图1：阿帕替尼对携带brafv600e突变的人黑色素瘤和结直肠癌细胞株在体外的生长具有明显的抑制作用；图2：阿帕替尼能明显抑制braf下游mek、erk蛋白的磷酸化，而对vegfr2的磷酸化几乎无影响；图3：阿帕替尼能明显抑制人黑色素瘤细胞株a375和结直肠癌细胞株colo205在裸鼠皮下的生长速度；其中，上图为阿帕替尼对a375细胞生长的抑制作用，下图为阿帕替尼对colo205细胞生长的抑制作用；图4：阿帕替尼能明显抑制人非小细胞肺癌细胞株hcc364在裸鼠皮下的生长速度；图5：阿帕替尼能选择性抑制brafv600e突变的人非小细胞肺癌细胞株hcc364在体外生长。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例1.阿帕替尼对多种激酶的体外抑制作用筛查取阿帕替尼用dmso配制100nm溶液，基于life公司的lanthascreenbinding和zlyte平台对138个蛋白激酶库进行筛查。结果显示，除对已知靶点vegfr2、kit外，阿帕替尼可以与brafv600e蛋白激酶结合，并对其具有较好的抑制活性，抑制率为51％。实施例2.阿帕替尼对人黑色素瘤和结直肠癌细胞株在体外生长的抑制作用取对数生长期的人黑色素瘤细胞(a375，sk-mel-28)和结直肠癌细胞(colo205，ht29)，胰酶消化法制备细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10％fbs的rpmi1640完全培养基(阿帕替尼终浓度分别为0，50，100，200，400，800nm)调整细胞密度至1×105个/ml，接种细胞到96孔细胞培养板，每孔添加100μl细胞悬液，轻晃培养板使其分布均匀，37和℃5％co2条件下培养细胞，并于接种后48小时采用cck-8法检测细胞活性。检测前，每孔细胞加入10μlcck-8溶液，轻晃使其分布均匀，37和℃5％co2继续培养4小时，酶标仪检测490nm波长细胞液的吸光度值，根据吸光度值制作细胞对数期生长曲线。所有实验均为5次独立生物学重复。结果如图1所示，阿帕替尼对4个细胞系的增殖均具有明显抑制作用，且随着阿帕替尼浓度的提高，阿帕替尼对brafv600e突变细胞系增殖的抑制作用逐渐增强，提示阿帕替尼对brafv600e突变的黑色素瘤和结直肠癌细胞系的体外增殖具有明显抑制作用。实施例3.阿帕替尼对mapk信号通路的抑制作用取对数生长期的人黑色素瘤a375细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10％fbs的rpmi1640完全培养基(阿帕替尼终浓度为50nm)调整细胞密度至1×105个/ml，接种细胞到6孔细胞培养板，每孔添加2ml细胞悬液，轻晃培养板使分布均匀，37和℃5％co2条件下培养，并于接种后3小时去掉培养基，向培养板中加入1mldpbs洗细胞两遍，去掉dpbs，每孔加入0.5ml细胞裂解液，按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白，bca法定量细胞总蛋白浓度。定量后的细胞总蛋白，每组10μl进行垂直电泳，sds-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为10％，经110v电压90分钟电泳后，立春红染色观察蛋白条件是否完整，400ma电流转膜90分钟，转膜后5％的脱脂牛奶封闭2h，4℃一抗过夜孵育，p-mek，mek，p-erk1/2，erk1/2，p-vegfr2，vegfr2和betaactin一抗稀释(tbst)比分别为1:300,1:300，1:400，1:600，1:500和1:800；tbst洗膜3次，加入二抗孵育2h，羊抗鼠二抗稀释比为1:4000；tbst洗膜2次，添加化学发光液反应底物，暗室曝光，扫描曝光底片，统计目的条带光密度值并比较蛋白磷酸化水平变化。实验进行3次独立生物学重复。实验结果如图2所示，经阿帕替尼对a375处理3小时后，braf下游信号蛋白mek，erk1/2的磷酸化明显减弱，而vegfr2的磷酸化几乎不变，提示阿帕替尼通过抑制braf发挥对brafv600e突变细胞株的抑制作用。实施例4.阿帕替尼对a375和colo205细胞株体内生长的抑制作用将1×106a375和colo205细胞分别接种于雌性裸鼠(6周龄，购自南京大学模式动物研究所)皮下，待肿瘤长至100-150mm3时，将裸鼠随机分为空白溶剂对照组、维罗菲尼对照组(125mg/kg，bid)和不同剂量阿帕替尼处理组(32,65,100mg/kg，qd)，每组各6只，给药21天后处死。测量并记录肿瘤体积大小(肿瘤体积大小的计算公式为：体积＝1/2×肿瘤长径×短径2)。结果如图3所示，经阿帕替尼处理后，a375和colo205细胞在小鼠皮下的生长速度均明显减慢。阿帕替尼浓度的提高和作用时间的延长，阿帕替尼对a375和colo205细胞在小鼠皮下的生长抑制作用逐渐增强，且抑制效果优于brafv600e靶向制剂维罗菲尼，进一步证明了阿帕替尼对这两种细胞系在小鼠体内的成瘤能力具有较好的抑制作用。实施例5.阿帕替尼对brafv600e突变的肺癌患者治疗作用采用braf检测试剂盒，1名晚期非小细胞肺癌患者经检测为brafv600e突变阳性，服用阿帕替尼(750mg/d)8周后，胸部ct示患者靶病灶较用药前减少大于30％，评估病情为部分缓解。实施例6.阿帕替尼对hcc364细胞株体内生长的抑制作用将1×106hcc364细胞接种于雌性裸鼠(6周龄，购自南京)皮下，待肿瘤长至100-150mm3时，将裸鼠随机分为空白溶剂对照组、维罗菲尼对照组(125mg/kg，bid)和不同剂量阿帕替尼处理组(32,65,100mg/kg，qd)，每组各6只，给药26天后处死。每周2次测量肿瘤体积大小(肿瘤体积大小的计算公式为：体积＝1/2×肿瘤长径×短径2)。结果如图4所示，经阿帕替尼处理后，hcc364细胞在小鼠皮下的生长速度均明显减慢。随着阿帕替尼浓度的提高和作用时间的延长，阿帕替尼对hcc364细胞在小鼠皮下的生长抑制作用逐渐增强，且抑制效果优于brafv600e靶向制剂维罗菲尼，证明阿帕替尼对brafv600e突变的非小细胞肺癌细胞系在小鼠体内的成瘤能力具有较好的抑制作用。实施例7.阿帕替尼对非小细胞肺癌hcc364和hcc827细胞株的体外生长抑制作用取对数期人非小细胞肺癌hcc364和hcc827细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10％fbs的rpmi1640完全培养基(阿帕替尼终浓度分别为0，25，50，100，200，400，800，1600nm)调整细胞密度至1×105个/ml，接种细胞到96孔细胞培养板，每孔添加100μl细胞悬液，轻晃培养板使其分布均匀，37℃和5％co2条件下培养细胞，并于接种后48小时采用cck-8法检测细胞活性。检测前，每孔细胞加入10μlcck-8溶液，轻晃使其分布均匀，37℃和5％co2继续培养4小时，酶标仪检测490nm波长细胞液的吸光度值，根据吸光度值计算细胞抑制率并计算ic50。所有实验均为5次独立生物学重复。结果如图5所示，hcc364和hcc827细胞的ic50值分别为84.1nm和1024.1nm，提示阿帕替尼对brafv600e突变的人非小细胞肺癌细胞株hcc364的生长抑制作用具有较强的靶向性。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。当前第1页12当前第1页12