竹节参总皂苷在制备抑制肠道衰老的疾病上的应用的制作方法

本发明提供一种竹节参总皂苷在制备抑制肠道衰老的疾病上的应用。属于生物医药领域。
背景技术：
：随着人类寿命的不断提高，老龄化相关问题日益严重。作为机体能量的首要来源组织--肠道在衰老中的作用逐渐引起研究者的重视，近期相关研究提示机体衰老始于肠道的衰老。在机体衰老过程中肠道的衰老可有多种表现，其中最重要的表现之一是肠道炎症反应。在增龄过程中，肠道炎症反应可引起肠道黏膜屏障功能逐渐受到损害，导致机体处于慢性炎症反应状态，并进一步引发或加重其他炎症相关疾病，加速衰老。而抑制衰老过程中的肠道炎症反应可减轻肠道黏膜屏障功能障碍，甚至可能是延缓机体衰老的重要措施。但目前衰老过程中肠道炎症反应的机制尚未完全明确，亦缺乏有效的干预手段。因此，深入探讨衰老相关肠道炎症反应的机制，寻找有效的防治衰老过程中肠道炎症反应的药物具有重要的科学意义。肠道屏障由黏膜上皮、肠道菌群、肠道内分泌物等构成。肠道屏障功能障碍使肠道通透性增加，细菌、内毒素等外源性物质即可通过紧密连接进入体循环，触发全身炎症反应综合征或多器官功能不全综合征。而目前肠黏膜屏障功能障碍的机制尚不明确。机体衰老过程中存在肠道屏障功能障碍，其机制与肠道炎症反应密切相关。hollanderd、katzd和maty等给不同年龄段的大鼠灌胃大、中分子探针如聚乙二醇(peg)400、peg634、甘露醇等后，发现衰老大鼠尿液中各分子的排泄量较青年大鼠显著增加，提示机体衰老过程中肠道通透性增加。biagie等研究发现在老年人群体中存在低程度、无症状肠炎。在灵长类动物中也存在类似的表现。tranl等研究发现，衰老的狒狒肠道存在炎症反应，炎症因子il-1β、ifn-γ及il-6的表达增加，肠道黏膜屏障障碍。大量研究发现il-1β、tnf-α、ifn-γ等炎症因子可参与介导多种疾病中的肠黏膜屏障功能障碍，破坏细胞间紧密连接；而抑制促炎因子则可降低细胞的通透性，保护肠道屏障功能。mapk/nf-κb通路是肠道炎症反应的重要通路。目前研究最广泛的mapk信号通路包括p38mapk通路、jnk通路以及erk通路三条通路，三者均在炎症中发挥重要作用。研究发现细菌细胞壁的成分lps以及宿主来源的il-1β、tnf-α都可使肠上皮细胞活化mapk通路。mapk通路活性增强已在多种肠道炎症反应模型发现，包括dss结肠炎，炎症性肠病。在tnf-α诱导的ht-29细胞，erk信号通路活化。而p38抑制剂则可通过减少il-1β、tnf-α抑制dss诱导的炎症反应。抑制jnk的活化可抑制il-1β诱导的肠上皮细胞炎症反应。大量研究证实mapk可使nf-κb复合体中的tata结合蛋白发生磷酸化，从而调节nf-κb的转录活性，影响炎症反应的转归。大量研究发现nf-κb可参与多种肠道炎症疾病的发生发展过程，如dss诱导的结肠炎等多种肠道炎症模型。nf-κb通过调节各种炎性基因转录的核转录因子，可以引发炎症的瀑布式反应，在溃疡性结肠炎发病机制中起非常重要的作用，抑制nf-κb和mapk活性可以减轻肠道炎症反应，改善溃疡性结肠炎全身炎症状态及免疫应答，对溃疡性结肠炎发挥治疗作用。调节mapk/nf-κb通路对维持肠道粘膜屏障功能具有重要作用。研究显示p38mapk通路、jnk通路以及erk通路均可参与调节细胞间的紧密连接。elamine等研究志愿者参与的酒精诱导的肠道粘膜屏障功能障碍实验，发现mapk通路活化，磷酸化的mapk(包括p38、jnk以及erk)均增加，肠道通透性增加，细胞间紧密连接蛋白zo-1和occludin重排，zo-1与肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase,mlck)的mrna表达减少；而进一步体外实验给予mapk抑制剂则抑制酒精引起的caco-2单层细胞粘膜屏障功能障碍模型，表明mapk通路的活化是肠道粘膜屏障功能障碍的重要因素。mihaescua等研究证实，应用sb239063抑制p38mapk的活性可减轻放射线诱导结肠炎引起的肠道屏障功能障碍。costantinitw等也发现，p38mapk抑制剂sb203580可减轻烧伤引起的肠道屏障功能障碍。而且segawas等研究发现益生菌可通过抑制p38mapk通路保护肠道屏障功能。nf-κb也是维持肠道屏障功能的重要信号分子。nf-κb由iκb激酶(iκbkinase,ikk)活化。gumam等发现肠上皮细胞特异性表达组成性活化的ikk的小鼠，其肠上皮细胞的nf-κb活化，并表达大量的炎症因子；这种小鼠更容易受外界刺激影响，肠道屏障功能更易受损，出现肠道上皮细胞的凋亡和细菌的移位，而且炎症反应依赖于mapk通路的活化。竹节参又名竹节三七、竹节人参、白三七等，系五加科人参属植物竹节参的干燥呈竹鞭状根茎，是我国西南地区民间常用中草药，被土家族、苗族居民视为“草药之王”。竹节参味甘、微苦，性温，归肝、脾、肺经，具有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮等功效，主要用于治疗痨嗽咯血、跌扑损伤、咳嗽痰多、病后虚弱等症，现代药理学研究发现竹节参对消化系统、中枢神经系统、心脑血管系统、免疫系统等具有广泛的药理作用。而且本项目前期研究发现：自然衰老大鼠肠道粘膜屏障功能障碍，肠道炎症反应增强，il-1β、cox2、il-18的表达增加，nf-κb核转位增多，而竹节参总皂苷可降低自然衰老大鼠肠道炎症反应，降低nf-κb核转位水平，但竹节参总皂苷能否通过影响mapk通路活性，减少nf-κbp65向细胞核内转移，从而降低衰老过程中肠道的炎症反应，改善衰老大鼠肠道粘膜屏障功能障碍还有待研究。机体衰老过程中存在肠道屏障功能障碍，而且其机制主要由肠道炎症反应引起。调节mapk/nf-κb通路对维持肠道粘膜屏障功能具有重要作用，其活化增强也是引起肠道炎症反应的重要因素。技术实现要素：在肠道衰老过程中mapk/nf-κb通路活性增强，导致肠道炎症反应，最终引起肠道屏障功能障碍；本发明提供一种竹节参总皂苷在制备抑制肠道衰老的疾病上的应用。具体为在制备抑制肠道炎症的疾病上的应用。本发明提供的竹节参总皂苷可通过降低mapk/nf-κb通路活性，减轻肠道炎症反应，进而保护肠道粘膜屏障以延缓肠道衰老。竹节参总皂苷竹节参经三峡大学医学院邹坤教授鉴定为五加科人参属植物竹节参panaxjaponicusc.a.mey.的干燥根茎。取竹节参干燥根茎粗粉，加入60％乙醇加热回流3次，合并滤液后浓缩干燥，得到竹节参总提物粉末，以人参皂苷re为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定竹节参总皂苷的含量为67.66％。动物spf级雄性sd大鼠60只，购于三峡大学实验动物中心，生产许可证号：scxk(鄂)2011-0061，分为成年组(6月龄)、衰老组(24月龄)及药物干预组(高、中、低剂量竹节参总皂苷干预24月龄大鼠)五组，每组12只大鼠。竹节参总皂苷高、中、低剂量分别为10，30，60mg.kg-1。大鼠自18月龄开始灌胃给药，每天一次，每周给药6次，共给药6个月。给药6个月结束后，大鼠禁食24h后10％水合氯醛麻醉处死，沿腹正中线进入腹中自回盲部取结肠新鲜组织，过液氮后放-80°低温冰箱保存。试剂d-乳酸试剂盒购自biovision公司，rna逆转录试剂盒购自takara公司，tnf-α、il-1β、β-actin引物序列由生工生物工程(上海)有限公司提供(表1)。p-p38、p38、p-jnk、jnk、p-erk、erk、nf-κb抗体购自cellsignalingtechnology公司，claudin1、occludin、il-1β、β-actin抗体购自santacruz公司，tnf-α抗体购自abcam公司。化学发光剂ecl，碧云天生物技术研究所。d-乳酸试剂盒检测大鼠血清d-乳酸水平大鼠麻醉后腹动脉取全血，静置30分钟后800r/min离心6分钟后取血清-80°冰箱保存待用。实验前将-80°保存的血清取出，完全解冻后取适量体积血清按照d-乳酸试剂盒说明书进行操作，在450处测od值，计算血清d-乳酸水平。rt-pcr检测炎症因子基因表达按照rna提取试剂盒说明书，提取组织中的总rna，用核酸测定仪检测rna的浓度和od260/od280比值，重复测定1次，测得的od260/od280比值在1.8-2.0范围内。逆转录，pcr扩增和电泳成像分析。pcr反应体系总体积为25ul：10.5μldepc水，12.5μlpcrmastermix(2x),加入tnf-α、il-1β引物上下游各0.5μl，最后加入cdna模板1μl。使用β-actin作为内参。扩增条件是94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，goto2，35times，72℃5min，4℃低温保存。产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，利用凝胶成像仪拍照，测定电泳条带吸光度值，用imagej软件计算tnf-α、il-1β与actin吸光度比值。表1pcr引物序列引物上游下游tnf-αtcagcctcctctctgccatccaatgactccaaagtagacctgccil-1βtgcctcgtgctgtctgacggtgggtgtgccgtctttcβ-actintgaccgagcgtggctacagcagggaggaagaggatgcgwesternblot法检测相关蛋白表达称取50-100mg的结肠组织按蛋白裂解液：磷酸蛋白酶抑制剂：pmsf＝100∶1∶1的比例提取总蛋白后，bca法蛋白定量，将定量的蛋白样品于95℃变性5-10min后分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按湿转法将电泳产物转移到pvdf膜，5％的脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜，tbst洗3次，辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1h，ecl显色，利用image-proplus6.0软件进行分析。免疫组织化学检测相关蛋白表达将保存的石蜡标本，连续横断切片，每只大鼠取5张切片，厚4μm，制备石蜡切片。切片常规脱蜡至水后，置于抗原修复液水浴煮沸30min。自然冷却后加3％双氧水封闭过氧化物酶10min，pbs冲洗3次每次5min，之后加bsa封闭30min，然后加入相关一抗4℃孵育，过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，dab显色，苏木素复染5min，盐酸酒精分化，脱水封片。于显微镜下观察，利用image-proplus7.0图像分析系统拍片。附图说明图1为各组大鼠血清d-乳酸表达水平，adult：青年组大鼠(6月龄)aging：自然衰老大鼠(24月龄)与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图2为不同月龄及给予spj干预后大鼠结肠组织occludin免疫组织化学染色，a：6月龄；b：24月龄；c:spj治疗组(10mg/kg/day)；d：spj治疗组(30mg/kg/day)；e：spj治疗组(60mg/kg/day)；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图3为不同月龄及给予spj干预后大鼠结肠组织occludin免疫组织光密度分析，a：6月龄；b：24月龄；c:spj治疗组(10mg/kg/day)；d：spj治疗组(30mg/kg/day)；e：spj治疗组(60mg/kg/day)；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图4为不同月龄及给予spj干预后大鼠结肠组织claudin-1免疫组织化学染色，a：6月龄；b：24月龄；c:spj治疗组(10mg/kg/day)；d：spj治疗组(30mg/kg/day)；e：spj治疗组(60mg/kg/day)；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图5为不同月龄及给予spj干预后大鼠结肠组织claudin-1免疫组织光密度分析，a：6月龄；b：24月龄；c:spj治疗组(10mg/kg/day)；d：spj治疗组(30mg/kg/day)；e：spj治疗组(60mg/kg/day)；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图6为spj对衰老大鼠结肠炎症因子il-1β、tnf-αmrna水平的影响，adult：6月龄；aging：24月龄；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图7为spj对衰老大鼠结肠组织tnf-α、il-1β的蛋白表达的影响，adult：6月龄；aging：24月龄；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图8为spj对衰老大鼠结肠炎症相关蛋白cox-2蛋白表达水平的影响，adult：6月龄；aging：24月龄；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图9为spj对衰老大鼠结肠p-p38、p38蛋白表达的影响，adult：6月龄；aging：24月龄；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图10为spj对衰老大鼠结肠p-erk、erk蛋白表达的影响，adult：6月龄；aging：24月龄；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图11为spj对衰老大鼠结肠jnk、p-jnk蛋白表达的影响，adult：6月龄；aging：24月龄；与6m组比较，*p﹤0.05,**p﹤0.01；与24m组比较，#p﹤0.05,##p﹤0.01。图12为spj对衰老大鼠结肠nf-κb蛋白表达的影响。具体实施方式自然衰老大鼠血清d-乳酸水平的变化及竹节参总皂苷的调节作用用d-乳酸试剂盒检测青年组、自然衰老组、竹节参总皂苷低、中、高剂量干预组的血清d-乳酸的水平。与青年组比较，自然衰老大鼠血清d-乳酸水平显著升高，说明自然衰老大鼠肠粘膜屏障功能发生障碍，肠粘膜通透性增高，而给予竹节参总皂苷提前干预后，血清d-乳酸水平与自然衰老组比较，竹节参总皂苷高剂量组显著性下降，低中剂量组有所下降，但无显著性差异。结果见图1。自然衰老大鼠结肠紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达水平的变化及竹节参总皂苷的调节作用用免疫组化法检测结肠紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达水平，occludin和claudin-1蛋白主要分布在结肠上皮细胞浆中，其中occludin在细胞核中也有分布。与青年组比较自然衰老大鼠结肠occludin和claudin-1表达水平显著下降，而竹节参总皂苷提前干预组occludin和claudin-1表达水平与自然衰老组比较显著升高。结果见图2-5。rt-pcr法检测各组大鼠结肠炎症因子il-1β、tnf-αmrna水平结果显示自然衰老大鼠结肠炎症因子il-1β、tnf-αmrna水平与青年组比较，显著升高，而竹节参总皂苷提前干预组il-1β、tnf-αmrna水与自然衰老组比较显著降低。见图6。westernblot法检测结肠炎症因子il-1β、tnf-α和cox-2的蛋白表达水平的变化及竹节参总皂苷的调节作用结果显示自然衰老大鼠结肠炎症因子il-1β、tnf-α和cox-2蛋白水平与青年组比较，显著升高，而竹节参总皂苷提前干预组子il-1β、tnf-α和cox-2蛋白水平与自然衰老组比较显著降低。见图7、图8。westernblot法检测结肠mapk/nf-kb通路相关蛋白表达水平的变化及竹节参总皂苷的调节作用结果显示自然衰老大鼠mapk/nf-κb相关信号分子p-p38、p-erk、p-jnk、jnk和nf-κb蛋白水平与青年组比较，显著升高，而竹节参总皂苷提前干预组相应蛋白分子表达水平与自然衰老组比较显著降低。见图9、图10、图11、图12。当前第1页12