阿司匹林在制备预防和治疗EB病毒相关性鼻咽癌转移的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及阿司匹林在预防和治疗eb病毒相关性鼻咽癌的药物中的应用。

背景技术：

全球90％人类均能被eb病毒(eptein-barrvirus,ebv)感染，且长期处于潜伏感染状态。其与与鼻咽癌(npc))的发生发展密切相关。目前临床治疗上主要以放射、化疗治疗为主。只有在患者处于i、ii期时，放疗可获得较好的治疗效果。但实际情况是，鼻咽癌发病部位隐蔽，大部分患者就诊时，病情已经发展到晚期，放化疗效果不理想，而且容易发生转移。转移是导致晚期患者死亡的主要有原因。阿司匹林是一种历史悠久的解热镇痛药，现多用于预防血栓、心脏病等疾病，尚未有其关于转移方面的研究与应用。eb病毒潜伏膜蛋白1(lmp1)eb病毒的主要癌蛋白，能够诱导多种信号通路(如，nf-κb、mapkkinase(erk，p38和jnk)、jak/stat)，引起上皮细胞形态与表型的改变，促进上皮间质转换(emt)，导致肿瘤细胞侵袭转移。在低分化和未分化鼻咽癌组织中，eb病毒潜伏蛋白1(lmp1)几乎都能被检测到，且越来越多的研究结果表明，eb病毒的作用伴随着鼻咽癌的发生发展。前期研究发现，ebvlmp1与鼻咽癌转移呈正相关。

micrornas是一类高度保守的非编码小rna，主要通过与靶基因的3'末端非翻译区互补配对、从而抑制靶基因的转录和表达，抑制基因的表达，调控机体多种而复杂的生命活动进程。越来越多的证据表明mirnas表达异常参与肿瘤的发生发展有密切关系。发明人前期研究已证明,在ebv相关的鼻咽癌中，lmp1能够通过nf-κb的活化使mir-203低表达或表达缺失，促进肿瘤细胞emt。

外泌体是一类大小为30至150nm的胞外囊泡亚群。绝大多数细胞均能产生外泌体。外泌体包含各种生物大分子，包括dna，mirna，mrna，蛋白质和其他生物活性分子，其通过转移上述分子介导细胞与细胞间的通信，调控受体细胞各项复杂生命活动过程，是微环境中的一种重要介质。研究证明，从肿瘤细胞释放的外泌体能影响肿瘤的形成，生长，转移和耐药。现已观察到ebv阳性肿瘤细胞能够分泌含有lmp1的外泌体。某些蛋白或分子可在外泌体中富集，进入血液，从而比直接检测更容易。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出阿司匹林(asp)抑制ebv相关鼻咽癌的转移，为该类型患者提供转移方面的预防和治疗新策略。并结合检测血清外泌体中lmp1和mir-203的表达，辅助诊断患者转移发生的风险性，并及时给予asp的治疗，有效抑制肿瘤的转移，为鼻咽癌的抗转移治疗提供了新的策略。

我们研究表明，在鼻咽癌组织样本中，lmp1与mir-203表达呈负相关。asp处理肿瘤细胞，抑制nf-κb的活化，促进mir-203表达。并且，asp通过抑制ebv阳性细胞中lmp1的外泌并增加mir-203的外泌，抑制npc细胞的emt和转移。在外泌体中，lmp1和mir-203也存在负性关系。在裸鼠实验中，通过注射具有高转移性的npc细胞5-8f，并对实验组裸鼠给以asp治疗，对照组不进行asp处理。结果显示，与对照组相比，肿瘤细胞5-8f转移到肺组织的概率明显降低。这些研究结果提示，在ebv相关鼻咽癌中，asp能够作为抑制鼻咽癌患者转移的预防和治疗新药物(asp能够抑制具有高转移性鼻咽癌细胞系5-8f的转移)，并结合检测外泌体中lmp1和mir-203的表达，为鼻咽癌患者转移的诊断、预防和治疗提供新的方法。asp在eb病毒相关性鼻咽癌转移的治疗应用中，具有巨大潜力。

本发明中判定给予asp治疗的辅助性检测指标与方法，即为检测血清外泌体中lmp1和mir-203的表达。该检测方法流程为：(1)提取鼻咽癌患者血清外泌体47例，正常人血清11例，提取总rna；(2)以总rna为模板，逆转录为cdna；(3)以lmp1和mir-203特异性引物，荧光定量pcr检测lmp1和mir-203的表达，β-actin和u6分别为内参基因。定量δct＝待测基因lmp1与内参基因平均δct值的差值，判断δct是否小于过等与2.46，当δct≤2.46时，提示lmp1高表达，患者转移风险大，考虑给予患者asp治疗；或者定量δct＝待测基因mir-203与内参基因u6平均δct值的差值，判断δct是否小于或等于3.15，当δct≤3.15时，提示mir-203高表达，患者肿瘤转移风险小，不需要给予患者asp治疗。上述方法中，荧光定量pcr时，所用的lmp1的特异性引物为：正向：5'-tgaacaccaccacgatgact-3'(seqidno.1)

反向：5'-gtgcgcctaggttttgagag-3'(seqidno.2)

所用内参基因β-actin引物序列为：

正向：5’-tcaccaactgggacgacatg-3’(seqidno.3)

反向：5’-gtcaccggagtccatcacgat-3’(seqidno.4)

mir-203和u6特异性引物购买于锐博生物公司。

总之，鼻咽癌是一种恶性上皮性肿瘤，具有高度转移性。转移是晚期鼻咽癌治疗失败和患者死亡的主要原因。eb病毒(ebv)与鼻咽癌的发生发展密切相关，是公认的致瘤病毒。在我们的研究中发现，ebv编码的癌蛋白lmp1能够通过活化的nf-κb下调上皮特异性mir-203的表达，促进肿瘤细胞上皮间质转换(emt)。上皮间质转换是发生转移的前奏。阿司匹林(asp)能够通过抑制nf-κb的活性，促进mir-203的表达，进而抑制鼻咽癌肿瘤细胞的emt。而且，asp抑制ebv阳性细胞中lmp1(ebv编码的潜伏膜蛋白1)的外泌，促进被lmp1抑制的mir-203的上调并被装配到外泌体中，将mir-203传递到临近或远处转移的癌细胞中，从而抑制肿瘤细胞emt和转移的发生。这就提示，可以通过检测待测患者血清中外泌体中lmp1和mir-203的表达，预测病人发生转移的风险，并以此来判定是否给予鼻咽癌患者asp的治疗及疗效的评估。检测血液外泌体中lmp1和mir-203的表达，既方便，又不会对患者造成创伤。asp应用于鼻咽癌转移抑制治疗是该药物的一种新用途，检测血液外泌体中lmp1和mir-203的水平决定用药和疗效评估。本发明可以定量检测各人群中血清样外泌体样本中lmp1和mir-203的表达情况，从而预测鼻咽癌患者发生转移的可能性，以及对患者进行治疗的新策略。

附图说明

图1：肿瘤组织中检测lmp1和mir-203的表达图；在鼻咽癌患者肿瘤组织中，lmp1高表达，mir-203低表达，并且lmp1与mir-203的表达呈负相关；normal代表正常人鼻咽组织样本，tumors代表鼻咽癌患者鼻咽部组织样本；

图2：asp抑制ebv阳性肿瘤细胞的emt；a和b，分别用asp处理ebv阳性细胞系(c666-1和c2089)，抑制npc重要信号通路nf-κb的活化(p-p65)，促进mir-203以及emt的上皮标志分子e-cadherin的表达，抑制间质标志分子n-cadherin，slug，snail和vimentin的表达；dmso为阴性对照；

图3：asp处理后裸鼠肺组织中的肿瘤细胞转移；a.对照组发生肺转移的he染色，箭头所指的为肿瘤细胞；b.为实验组发生肺转移的he染色，箭头所指的为肿瘤细胞。c.正常肺组织，无转移灶。d.asp处理组裸鼠体重明显比对照组要高，dmso是药物溶解剂。e.asp处理组的转移灶，显著少于对照组，dmso是药物溶解剂；

图4：asp抑制lmp1外泌；a.asp处理ebv阳性细胞系(c666-1和c2089)，asp抑制lmp1的外泌，促进mir-203的外泌；dmso为阴性对照。cd63为外泌体的标志分子；

图5：鼻咽癌肿瘤患者血清样本中，lmp1和mir-203的表达情况；提取鼻咽癌患者和正常人血清样本中rna，rt-qpcr检测lmp1和mir-203的表达。结果显示，在ebv相关性的鼻咽癌血清外泌体组织样本中lmp1高表达，mir-203低表达，且两者存在负相关。normal代表正常人样本，tumors代表鼻咽癌患者血清样本。

具体实施方式

研究表明，lmp1抑制mir-203的表达，且lmp1与鼻咽癌转移呈正相关。在鼻咽癌肿瘤组织中，lmp1与mir-203的表达呈负相关，如图1所示。asp处理ebv阳性细胞系(c666-1和c2089)，抑制nf-κb的活化，促进mir-203和emt的上皮标志分子e-cadherin的表达，抑制间质标志分子n-cadherin，slug，snail和vimentin的表达，进而抑制emt，如图2所示。

对14只balb/c裸鼠中，注射相同数量的，具有高转移性鼻咽癌细胞系5-8f。实验组(裸鼠7只)给予asp治疗(按裸鼠体重给药100mg/kg溶解于饮水中，以口服的方式进行)，对照组(裸鼠7只)不给予asp治疗。结果显示，实验组，发生肺转移的裸鼠数量为4只，转移率为50％，而明显小于对照组转移率(86％)。而且，对照组发生肺转移形成的多个转移病灶和病灶大小，明显多于给予asp治疗的实验组，通过统计，对照组肿瘤细胞发生转移的百分比达到86％，而实验组肿瘤细胞下降到50％，并且对照组裸鼠体重明显轻于asp处理组(图3a-3e)。即表明asp有明显抑制鼻咽癌肿瘤细胞的转移的作用。在图4中，asp处理ebv阳性细胞后，抑制lmp1的外泌，促进mir-203外泌，进而抑制emt。通过提取鼻咽癌患者血清外泌体，检测血清外泌体组织样本中lmp1和mir-203的表达，结果如图5所示，lmp1高表达，mir-203低表达，且两者存在负相关。normalsamples代表正常人血清样本，tumorsserumsamples代表鼻咽癌患者血清样本。这些结果都表明asp能够抑制肿瘤细胞的转移，并能通过检测血清中外泌体中lmp1和mir-203给予辅助性诊断。

(一)组织样本rna提取(trizol)：

利用血清外泌体提取试剂盒，提取每1ml血清样本中的外泌体。提取外泌体rna。将提取的外泌体置于无菌无酶ep管中，加入1mlrnatrizol；也可在液氮中碾磨组织后加入到1mlrnatrizol中。室温放置10-20分钟，加入氯仿0.2ml于ep管中，冰上放置5分钟，4℃离心，12000rpm，15分钟；小心区分上层水相于新的ep管中，可重复氯仿抽提步骤；加入预冷的0.5ml异丙醇，混和均匀，放置冰上15分钟，4℃，12000rpm离心，10分钟后，弃去上层清液；加入75％乙醇，4℃离心，7600rpm，5分钟；室温干燥5-10分钟后，加入20ul-50uldepc水。在仪器nanodrop2000中，测定rna浓度，od260/280比值在1.7-2.0之间并进行eb胶电泳检测rna质量，-80℃保存。

(二)逆转录

对上述提取的总rna进行逆转录，逆转录的反应体系参照thermoscientificrevertaidfirststrandcdnasynthesiskit说明书，进行配置(20ul)：

water,nuclease-free补至20ul总体系

程序：42℃，60分钟；70℃，5分钟；反应结束。

mir-203逆转录特异性引物由长沙锐博省公司设计。

(三)real-timeqpcr

将逆转录产物稀释五倍后，以逆转录产物为模板，pcr反应体系(25ul)：

lmp1引物：

正向：5'-tgaacaccaccacgatgact-3'(seqidno.1)

反向：5'-gtgcgcctaggttttgagag-3'(seqidno.2)

mir‐203realtimepcr长沙锐博生物公司设计完成。

所用内参基因β-actin引物序列为：

正向：5'-tcaccaactgggacgacatg-3'(seqidno.3)

反向：5'-gtcaccggagtccatcacgat-3'(seqidno.4)

realtimepcr反应体系参照thermoscientificmaximasybrgreenqpcrmastermix(2x)说明书，进行配置(25ul):

2×sybrgreenqpcrmastermix(2x)12.5ul

上下游引物2ul

模板cdna2ul

water,nuclease-free补至25ul总体系。

pcr程序：95℃，10分钟；①95℃，30秒；②58℃30秒；③72℃30秒；①②③进行45个循环，终止反应。

(四)判定δct

指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，以lmp1或者mir-203作为判定指标，或者两者结合同时判定。β-actin作为内参基因，利用软件graphpadprism5进行分析。分析发现，与lmp1在正常鼻咽组织中的表达相比，47例鼻咽癌患者中lmp1的表达上调，其δct≤2.46时，(p≤0.05)，提示lmp1高表达，患者转移风险大，考虑给予患者asp治疗；或者当δct≤3.15时，(p≤0.05)，提示mir-203高表达，患者肿瘤转移风险小，不需要给予患者asp治疗。

(五)实施案例举例

以上述方法，检测正常人10例和40例疑似鼻咽癌患者(新入院初始病人，手术治疗前)血清样本中，lmp1和mir-203表达与正常人相比，表达升高，当δct≤2.46时，提示lmp1高表达，患者转移风险大，考虑给予患者asp治疗；或者当δct≤3.15时，提示mir-203高表达，患者肿瘤转移风险小，不需要给予患者asp治疗。

以上研究表明，阿司匹林抑制ebv相关鼻咽癌的转移，并且外泌体中lmp1和mir-203可以作为鼻咽癌转移发生的诊断和治疗的分子标志物。检测患者外泌体中lmp1或mir-203的表达，具有很好的稳定性，操作简便，可以应用于ebv相关鼻咽癌患者诊断和治疗。

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