替度鲁肽在促进幼龄反刍动物小肠发育中的应用的制作方法

本发明涉及胰高血糖素样肽-2(glp-2)的替代物替度鲁肽，具体涉及替度鲁肽在幼龄反刍动物上促进小肠发育中的应用。

背景技术：

幼龄反刍动物胃肠道的生长发育不但对动物各种生理功能的完善有重要的意义，而且对成年后的健康及生产性能具有重要的影响。近年来，营养与胃肠道健康一直是国内外营养学家关注的热点。但是，较多研究关注营养素对幼龄反刍动物例如犊牛和羔羊瘤胃发育及功能完善的调控作用，而对小肠发育的调控关注相对较少。许多研究发现小肠可消化淀粉转化为体脂肪的效率明显高于瘤胃淀粉，同时肠淀粉对体蛋白沉积有明显调控效应。因此，肠道的发育及其对营养物质的消化吸收效率可能是影响反刍动物生产性能的重要潜在因素。另外一方面，反刍动物的小肠也起着重要的屏障和免疫作用。基于此，通过相应调控手段促进幼龄反刍动物小肠的生长发育对保证其早期断奶后的肠道健康，降低腹泻率及提高成年后的生产性能具有重要的意义。

胰高血糖素样肽-2(glp-2)是一种由肠l内分泌细胞分泌的由33个氨基酸组成的肠上皮特异性生长因子，其分泌受肠道营养素和营养水平的调控。glp-2的功能包括促进肠道发育、增强肠道屏障功能、增加血液流量及抗炎症作用等，而其中最主要的功能就是特异性地促进肠粘膜生长与损伤后修复。l细胞分泌的glp-2氨基酸序列seqidno.1如下所示：

h-his-ala-asp-gly-ser-phe-ser-asp-glu-met-asn-thr-ile-leu-asp-asn-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-gln-thr-lys-ile-thr-asp-oh；

但是，glp-2被分泌后迅速地被glp-2的降解物(二肽基肽酶ⅳ)在n端的2位丙氨酸(ala)处切割，形成无活性的glp-2(3-33)。除了肾清除之外，glp-2(1-33)的这种快速酶降解导致该肽的半衰期为约7分钟。所以寻求一种持续高效的glp-2替代物代替glp-2发挥作用，对出生后到断奶前的幼龄反刍动物小肠发育具有十分重大的意义。

替度鲁肽做为一种新药，对短肠综合征肠衰竭而依赖静脉营养的患者有显著疗效。每日注射一次替度鲁肽可有助于提高肠道对液体和营养物质的吸收，降低肠外营养的频率以及供给量。目前还没有关于替度鲁肽用于促进幼龄反刍动物小肠发育的报道。

发明目的

技术实现要素：
：针对现有技术存在的问题，本发明提供替度鲁肽在促进幼龄反刍动物小肠发育中的应用。本发明提出了一种替度鲁肽的新功能，可以作为glp-2替代物促进幼龄反刍动物小肠发育，同时解决glp-2存在的稳定性、有效性不足等问题。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的替度鲁肽在促进幼龄反刍动物小肠发育中的应用。

进一步地，所述替度鲁肽作为胰高血糖素样肽-2替代物在在促进幼龄反刍动物小肠发育中的应用。

进一步地，所述幼龄反刍动物为羔羊或犊牛。

更进一步地，所述的动物的生长阶段为出生后到断奶前。

作为优选，所述替度鲁肽通过注射促进幼龄反刍动物小肠发育。

进一步地，所述替度鲁肽溶于牛血清白蛋白的按50-60ug/kg动物体重注射幼龄反刍动物腹腔皮下。即按幼龄反刍动物体重，每kg需要注射50-60ug替度鲁肽；优选按50ug/kg动物体重注射腹腔皮下。

本发明是所使用的的原料和仪器都是市售可得。

替度鲁肽由南京肽业生物科技有限公司合成

牛血清白蛋白(bsa)购自南京建成生物有限公司

便携式ph计(hi9024c；hannainstruments，美国)

血浆血糖试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司

glp-2荧光酶免疫试剂盒购自德国phoenixeuropegmbh

反转录试剂盒购自takara公司

q5real-timepcr仪(appliedbiosystems，美国)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提出了一种替度鲁肽的新功能，可以作为glp-2替代物促进幼龄反刍动物小肠发育，替度鲁肽的氨基酸序列的第二个氨基酸为gly，而glp-2氨基酸序列的同等位置氨基酸为ala，这个差异不但不会造成与glp-2功能的差异，而且还会避免被glp-2的降解物(二肽基肽酶ⅳ)降解，持续高效的发挥作用，并且具有稳定、高效的优势。glp-2注射到幼龄反刍动物体内半衰期是7min，1小时，药效就基本消失，而替度鲁肽半衰期可达到3-5小时，药效可持续15-25小时。

本发明通过注射替度鲁肽调节幼龄反刍动物细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的表达推动细胞周期进程促进小肠上皮的发育、增强小肠屏障功能；从而防护肠道上皮屏障来预防羔羊等幼龄反刍动物腹泻的发生，提高羔羊等幼龄反刍动物的成活率，有利于幼龄反刍动物断奶前期肠道发育，减弱断奶应激。

附图说明

图1为替度鲁肽注射对羔羊体重变化的影响关系图；

图2为替度鲁肽注射对羔羊小肠上皮细胞周期蛋白mrna相对表达量的影响关系图；

图3为替度鲁肽注射对羔羊小肠上皮gcg、glp-2r、igf-1及igf-1rmrna相对表达量的影响关系图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

试验选择10只体况良好，胎次一致，体重相近的新生羔羊(湖羊)，随机分为对照组和替度鲁肽处理组，每组5只。10日龄时，羔羊开始补饲精料补充料，自由饮水，自由采食苜蓿和燕麦干草，每周监测羔羊体重变化。羔羊28日龄时试验开始，将4mg替度鲁肽溶于50ml含有0.5％的牛血清白蛋白溶液中(0.5％bsa溶液是按质量体积比将bsa溶于生理盐水mg/ml)配制成80ug/ml的替度鲁肽溶液，处理组羔羊按替度鲁肽比羔羊体重为50μg/kg将替度鲁肽溶液注射腹腔皮下；对照组羔羊腹腔皮下注射等体积的不含替度鲁肽的0.5％牛血清白蛋白溶液，每隔12小时注射1次，连续注射14天。试验开始前，两组羔羊的体重没有显著差异(6.18±0.47vs.5.80±0.26kg，p＝0.504)。替度鲁肽由南京肽业生物科技有限公司合成，牛血清白蛋白(bsa)购自南京建成生物有限公司。精料补充料开食料依据湖羊开食料营养需要标准(ny/y816-2004；中国农业部,2004)设计开食料配方，组成见表1。

表1试验开食料组成与营养水平

实施例2

实施例2采用是相同的试验方法，不同之处在于试验对象为体重相近的新生犊牛，处理组按替度鲁肽比犊牛体重为60μg/kg将实施例1制备的替度鲁肽溶液注射到犊牛腹腔皮下。

实施例3

试验期间每周监测实施例1的对照组和试验组羔羊体重变化，结果如图1所示。在整个试验期间两组羔羊体重无显著差异。

实施例4

取实施例1的羔羊42日龄时，早晨饲喂两小时后进行屠宰，屠宰前颈静脉采血，血液在1000g4℃离心15min储存在-20℃用于血常规检测。屠宰后立即分离瘤胃和小肠并称重，收集有代表性的瘤胃内容物测定ph值，测定完ph值后的瘤胃内容物四层纱布过滤收集瘤胃液，-20℃保存待测挥发性脂肪酸浓度。采集具有代表性的十二指肠、空肠和回肠组织在冰的磷酸缓冲溶液里清洗3次后，剪成0.5cm×0.5cm的小碎块装入冻存管置于液氮保存，用于后续rna的提取。

实施例5

检测替度鲁肽注射对羔羊各器官重量的影响：

在羔羊42日龄时屠宰采样，羔羊屠宰后立即分离各器官并称重，结果如表2所示。

表2替度鲁肽注射对羔羊各器官重量的影响

注：数据以平均值±标准误形式表示，n＝5

由表2可知，与对照组羔羊相比，试验组羔羊空肠重和回肠重有升高的趋势，而瘤胃湿重、瘤胃干重、瓣胃湿重、瓣胃干重、十二指肠重、盲肠重、结肠重及肝脏重与对照组相比差异不显著。上述结果表明，替度鲁肽可促进了羔羊空肠和回肠的发育。

实施例6

对实施例4的血液进行血常规检测以及瘤胃内容物测定ph值，考察替度鲁肽注射对羔羊瘤胃和血液参数的影响，结果如表3所示。

血常规分析的血浆血糖试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；glp-2荧光酶免疫试剂盒购自德国phoenixeuropegmbh。血糖和glp-2试剂盒的测量范围分别是3.89～6.11mmol/l和0-10000pg/ml。

瘤胃生理参数测定，用便携式ph计(hi9024c；hannainstruments,美国)测定瘤胃ph值。气相色谱测定(gc-14b,岛津,日本；毛细管柱:30m×0.32mm×0.25mm膜厚度)vfa浓度，参照秦为琳(应用气相色谱测定瘤胃挥发性脂肪酸方法的研究改进.南京农业大学学报,1982(4):110-116.)的方法(柱温＝110℃,汽化室温度＝180℃,检测器＝180℃)。

表3替度鲁肽注射对羔羊瘤胃参数和血液参数的影响

如表3所示，体外注射替度鲁肽显著提高了羔羊血浆中glp-2浓度；但对羔羊瘤胃ph值、总vfa浓度、乙酸浓度、丙酸浓度、丁酸浓度、其他vfa浓度、乙丙比及血浆血糖浓度没有显著影响。上述结果说明体外皮下注射的glp-2替代物替度鲁肽被羔羊吸收入血，通过血液运输到达胃肠道进而发挥作用，但对羔羊瘤胃发酵及机体对葡萄糖的吸收无显著性影响。

实施例7

替度鲁肽注射对羔羊小肠上皮mrn相对表达量的影响。

rna的提取和cdna的合成：提取实施例4得到小肠上皮总rna，使用nanodrop分光光度计检测rna的浓度和纯度。所有样品的吸收比例(260/280nm)都在1.8～2.0之间，证明rna纯度较高。用1.4％的琼脂糖胶检测rna的完整性。将所有的rna浓度调整到1μg/μl，置于-80℃冰箱保存备用。利用购自takara公司含基因组rna酶的反转录试剂盒进行cdna的合成。

引物的合成和实时定量pcr：利用q5real-timepcr仪(appliedbiosystems，美国)对目的基因及内参基因gapdh、18srrna进行定量，gapdh引物序列参照wang等(wanga,guz,heidb,etal.identificationandcharacterizationofthebovinegprotein-coupledreceptorgpr41andgpr43genes1[j].journalofdairyscience,2009,92(6):2696-2705.)，实时定量pcr分析所用引物采用primer5.0软件自行设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物sqeidno.2-29，如表4所示。sybr购自takara公司，反应条件为：95℃30s预变性，95℃5s，60℃30s，重复40个循环，95℃，15s；60℃，1min；95，15s。反应体积20μl：10.4ulsybr，10umol/l上下游引物各0.4ul，2ul样品cdna以及6.8ul无菌水。所有样品设3个重复。目的基因的相对表达量以管家基因gapdh作为内参进行校正，数据分析采用2^-△△ct的方法。

表4扩增引物序列

结果以平均值±标准误(means±se)进行表示。数据采用spss20.0中的独立样本t检验进行显著性分析。采用graphpadprism6.01(www.graphpad.com)软件分析目的基因的mrna表达量。p<0.05表示差异显著。

替度鲁肽注射对羔羊小肠上皮细胞周期蛋白mrna相对表达量的影响：细胞周期的推进主要受细胞周期蛋白(cyclins)及其相关的激酶(cdks)的调控，所以cyclins和cdks的表达情况会影响细胞周期进程。两组羔羊小肠上皮细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的实时定量pcr结果如图2所示，与对照组相比，替度鲁肽试验组显著升高了十二指肠cyclinb、cyclind1、cdk1及cdk6的mrna表达量；空肠cyclina,cyclinb1,cdk1,cdk4和cdk6的mrna表达量；回肠cyclina、cyclind1、cdk2和cdk4的mrna表达量。上述结果说明，体外注射glp-2替代物替度鲁肽促进了小肠上皮相关细胞周期蛋白和相关依赖性激酶的mrna表达，一定程度上推动了细胞周期进程，促进了小肠上皮的增殖。

替度鲁肽注射对羔羊小肠上皮gcg、glp-2r、igf-1及igf-1rmrna相对表达量的影响：如图3所示，与对照组相比，试验组显著升高了十二指肠gcg和igf-1r；空肠gcg、igf-1、igf-1r和glp-2r；回肠gcg、igf-1、igf-1r和glp-2r的mrna表达量；但对十二指肠igf-1和glp-2r的表达没有显著影响。上述研究结果表明：体外注射glp-2替代物替度鲁肽促进了羔羊小肠上皮glp-2受体的表达，同时促进了igf-1和igf-1受体的表达，暗示glp-2是通过igf-1信号通路调控细胞周期进程，促进了小肠上皮的增殖。同时采用实施例2犊牛为实验对象，结果与上述实施例结果类似。

sequencelisting

<110>南京农业大学

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