多肽SPKP‑XI在制备心肌钠通道工具试剂中的应用的制作方法

本发明涉及一种活性多肽在制备离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi（简写为spkp-xi）在制备电压门控钠通道工具试剂-心肌钠通道抑制剂中的用途。

背景技术：

电压门控钠通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钠通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钠通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钠离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钠通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钠通道的活性成分。它们通过与钠通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钠通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钠通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi在制备电压门控钠通道工具试剂-心肌钠通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi（简写为spkp-xi），其氨基酸序列为：

nh2-glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcyscysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrpaspglythrphe-nh2

其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi作为单一有效活性组份用于制备心肌钠通道抑制剂。

所述的一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钾肽-xi在制备电压门控钠通道工具试剂-nav1.5型钠通道抑制剂中的应用，其特征在于，所述的蜘蛛抑钾肽-xi的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该蜘蛛抑钾肽-xi作为单一有效活性组分用于制备心肌钠通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成心肌钠通道工具试剂。

蜘蛛抑钾肽-xi在制备心肌钠通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为5μmol/l。

蜘蛛抑钾肽-xi抑制心肌钠通道的半数有效作用剂量ic50为1.28μmol/l，是一种较好的心肌钠通道工具试剂。

附图说明

图1是空白对照下的心肌钠通道电流。

图2是5μmol/lspkp-xi对心肌钠通道的影响。

图3是spkp-xi作用于心肌钠通道的浓度-效应关系曲线。

图4是spkp-xi对心肌钠通道电流-电压关系的影响。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用原代心肌细胞模型来说明蜘蛛抑钾肽-xi的心肌钠通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1大鼠心肌细胞(cardiacmyocytes)的分离和培养

心肌细胞也是目前常用于电生理领域研究的一种细胞，特别是应用于研究药物对受损心脏治疗效果的机制，如缺血、缺氧等。与drg细胞相比，其上分布的离子通道种类少、简单。钠通道主要是ttx-r型（nav1.5）。含有l-型高阈值激活和t-型低阈值激活钙通道，但不含n-型钙通道。

1.1.1组织溶液

含ca²⁺台氏液:nacl143mm；kcl5.4mm；mgcl20.5mm；hepes5mm；nah2po40.33mm；glucose10mm；cacl21.8mm；用naoh调ph=7.4；

无ca²⁺台氏液:nacl143mm；kcl5.4mm；mgcl20.5mm；hepes5mm；na2hpo40.33mm；glucose10mm；用naoh调ph=7.4；

kb液(l-glutamicacid70mm；kcl25mm；taurine20mm；kh2po410mm；mgcl23mm；egta0.5mm；glucose10mm；hepes10mm；用koh调ph=7.3)；

酶解液:30ml无钙台氏液中加入胶原酶4.5mg和牛血清白蛋白9mg。

以上溶液均用0.22微米孔径的滤膜过滤，实验前于37℃水浴恒温，充以95%的o2和5%的c02混合气体10min至饱和。

1.1.2分离程序

首先在直径10cm培养皿中盛放20ml含ca²⁺台氏液，并用台氏液先灌满langendorff灌流装置，关闭装置并向装置中充氧。在其后的整个灌流过程中不停充氧，且保持心脏内部温度始终在37℃左右。

取体重250g左右大鼠，雌雄不拘，断头，打开胸腔，夹住心尖向上提起，剪断血管，迅速取出心脏，注意保持心脏的完整，免受损伤。将心脏放入盛有台氏液的培养皿中，冼去一部分凝血，如果心脏上部附有较多的脂肪等组织，可稍修剪。找到主动脉（血管壁粗厚，直立），将主动脉穿入langendorff灌流装置的下部的针尖上，用棉线固定，用37℃有ca²⁺台氏液灌流，可以看到心脏复跳，且搏动越来越强，血液不断流出，心脏壁上的血丝逐渐被洗去，至流出液体无血色，透明，换用无ca²⁺台氏液冲洗。随着ca²⁺的稀释，心脏搏动渐趋微弱，心脏变硬并扩大，灌流至心脏完全停止跳动，用酶解液冲洗（30ml反复利用）6min，心脏颜色逐渐呈半透明，流出液体呈拉丝状，稍变浑浊。换用kb液冲洗，洗净心脏中的酶液，至心脏颜色由红变白，由硬变软，取下心脏，剪取下部心室部分，剪碎（酶解作用好的心脏内部已呈粘稠状），放入盛有10mlkb液的指管中，于37℃恒温箱中振荡5-8min。取细胞悬液于500转/分离心2min，取离心沉淀，用kb液分装入35mm培养皿中，置于培养箱中培养2小时后细胞贴壁。在显微镜下挑选合适细胞进行膜片钳记录。

1.2膜片钳电生理活性实验

膜片钳实验均在室温（25±1℃）进行，采用全细胞膜片钳技术。挑选质膜光滑可见、胞质均匀的细胞作为实验细胞。电流记录通过全细胞膜片钳技术利用epc9放大器(heka公司,german)在电脑上进行。计算机记录和分析系统采用pulse+pulsefit8.0软件。玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管（南京泉水教学实验器材厂）。玻璃电极两步拉制而成，经抛光仪(narishige,japan)抛光后电极尖端直径约为3µm，充灌电极液后电极电阻为1-3mω。膜片钳实验要在室温条件下进行，整个实验过程中温度的变动最多上下不超过2℃。采用sigmaplot9.0软件分析实验结果。

2、实验结果与分析

2.1spkp-xi对大鼠心肌细胞的钠通道的影响

心肌细胞上所表达的钠离子通道以ttx-不敏感型，即nav1.5为主，尽管也有报道认为心肌细胞含有其他类型的钠离子通道，但是其表达量非常低，因此，spkp-xi对心肌细胞的钠离子通道的影响可以被看作是对nav1.5通道的影响。由图1和2可见，心肌钠通道电流在加入5mm的spkp-xi之前和之后有明显变化，表现为峰值电流减小以及失活变得较为缓慢。

在全细胞记录电压钳模式下，将细胞钳制在-80mv时，分别给予一组测试电压，其变化范围为-80～+50mv，步幅为+10mv，持续时间为50ms，可在心室肌细胞上得到ttx不敏感型钠通道的激活电流-电压（i-v）关系曲线图（图4），并能揭示出通道的激活阈值、逆转电位和最大激活峰值电流电压大小。在空白对照条件下，ttx不敏感型钠通道的起始激活电压为-50mv，最大峰值电流激活电压为-30mv左右，逆转电位为+35mv左右。

2.2spkp-xi对心肌电压门控钠通道激活状态的影响

由图4可见，5mmspkp-xi能够在-60mv到+50mv之间的测试电压范围内明显抑制电流的失活相以及峰值电流，并在-20mv左右抑制比例最大；且能使通道始激活电压和峰值电流激活电压向去极化方向漂移超过+10mv，但反转电位变化不明显，说明毒素不影响通道对钠离子的选择透过性。同时，spkp-xi对钠通道的影响具有浓度依赖性(图3)，其抑制钠通道电流的ic50值为1.28mm。有意思的是，spkp-xi对心肌钠通道的失活也有影响，能明显延缓心肌钠通道的失活(图4)。在图4中，i10ms代表在去极化10ms时测得的电流幅度值，在空白情况下，这一数值应该为0，表示钠通道已进入正常的失活相，而在加入5mmspkp-xi的情况下，i10ms在-20mv仍有25±4%不能正常失活。这表明spkp-xi可以延缓心肌钠通道的失活。

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<110>长沙沁才生物科技有限公司

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