本发明属于药品技术领域，具体涉及一种具有降血糖活性老鹰茶叶黄酮提取物的制备方法。
背景技术：
老鹰茶含有黄酮、苷类、有机酸、香豆素和鞣质等成分，其中黄酮类是老鹰茶的主要成分，主要有山柰酚、山柰酚-葡萄糖菅及槲皮素-葡萄糖苷。研究结果表明老鹰茶能降低正常小鼠的血糖含量，提示其可通过刺激胰岛13细胞分泌胰岛素产生降糖作用。肾上腺素通过分解肝糖原使血糖升高，而老鹰茶降低肾上腺素性高血糖小鼠的血糖值，说明其可能具有抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原合成的作用，从而可减少血糖的来源，增加血糖的去路，明显降低代谢异常导致的血糖升高。四氧嘧啶和链脲佐菌素均为胰岛b细胞杀伤剂，可选择性地损伤胰岛b细胞，引起实验性糖尿病。在糖尿病小鼠和大鼠模型中，老鹰茶具有显著的降糖作用，同时对四氧嘧啶糖尿病小鼠血清中胰岛素的释放也具有促进作用。提示其主要通过保护胰岛p细胞或促进受损口细胞的修复以及促进胰岛素分泌、增加血清胰岛素含量而达到降低血糖的目的。
糖尿病是一种常见多发的代谢疾病，常伴有血脂的升高，而糖、脂代谢紊乱与糖尿病慢性并发症的发生发展密切相关。因此降低血脂对于阻止或延缓并发症、改善糖尿病患者的预后具有重大意义。毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,ce)是一种高效、快速和低耗的分离技术，非常适合分离一些在hplc上没有保留或难于分析的成分，而且样品预处理相对比较简单，甚至不需考虑柱的损害问题，可用于测定植物的有机酸类化合物。对于常见的没有紫外吸收基团的有机酸类化合物，一般采用间接紫外法(indirectuv,iuv)测定，ce-iuv测定有机酸类化合物是一种快速简便的方法。老鹰茶(litseacoreanalevel)又名豹皮樟，俗称白茶，分布于四川、贵州、云南、安徽等地，是我国南方各民族民间长期饮用的一种植物代用茶，具有解毒消肿、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效。本文以4,5–咪唑二羧酸(4,5-imidazolecarboxylicacid,idc)为背景电解质，建立了一种快速、灵敏的分析有机酸类化合物的ce-iuv方法，该法还应用于老鹰茶中7种有机酸类化合物和黄酮的分析。
本发明采用4,5-咪唑二羧酸(idc)为背景电解质，以20mmol/lidc-0.5mmol/l十六烷基三甲基溴化铵(cetytrimethylammoniumbromide,ctab)电泳溶液(ph12.1)，分离电压为–30kv，柱温为20℃，毛细管长95cm，分离测定了老鹰茶中七种有机酸类化合物(草酸、甲酸、柠檬酸、苹果酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸和乙酸)和黄酮的含量，该方法方法简便、快速、准确。
技术实现要素：
本发明提供了一种具有降血糖活性老鹰茶叶黄酮提取物的制备方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：
(1)将新鲜老鹰茶叶清洗、烘干后粉碎并过20目筛，获得老鹰茶叶粉末，将老鹰茶叶粉末与水以质量比1:8～10混合后，在室温下搅拌浸泡广5小时，然后升温至85～100℃下加热回流浸提2～3h，冷却至30～50℃后过滤，获得滤液，即老鹰茶叶水提物；
(2)在步骤(i)获得的老鹰茶叶水提物中搅拌加入絮凝剂，在室温下静置4～6小时，然后离心，弃去沉淀，获得上清液a；所述絮凝剂为海藻酸钠、壳聚糖或羧甲基纤维素；
(3)将步骤(2)获得的上清液a减压浓缩后加入乙醇水溶液使乙醇体积终浓度为70～90％，静置12小时后，取上清液b减压浓缩至浓缩物无乙醇味，获得浸膏；
(4)将步骤(3)获得的浸膏加水配成混合液，再将混合液用萃取剂在50～80℃条件下搅拌30～90分钟进行萃取，萃取完全后冷却至30～40℃，静置分层，获得上层萃取液和下层萃余液，将上层萃取液减压浓缩至混合液体积的0.3～0.5倍，即得老鹰茶叶黄酮粗提液；所述萃取剂由有机溶剂a和有机溶剂b以体积比为1000:1混合组成，有机溶剂a为乙酸乙酯或乙酸乙酯与异丙醇以体积比5～9:1的混合溶液；有机溶剂b为乙酸；
(5)以idc为背景电解质的毛细管电泳-间接紫外法测定老鹰茶中草酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、乙酸和黄酮的含量。
作为优选手段，步骤(2)所述絮凝剂以质量浓度1～5％絮凝剂水溶液的形式加入，絮凝剂水溶液与老鹰茶叶水提物体积比为1～5:1000。
作为优选手段，步骤(2)所述絮凝剂以质量浓度1％絮凝剂水溶液的形式加入，絮凝剂水溶液与老鹰茶叶水提物体积比为2:1000。
作为优选手段，步骤(2)获得的上清液a体积减压浓缩至步骤(i)获得的老鹰茶叶水提物体积的l/20倍，加入体积浓度95％乙醇水溶液使乙醇体积终浓度为70～90％。
作为优选手段，步骤(4)中所述萃取剂由有机溶剂a和有机溶剂b以体积比为1000:2混合组成，有机溶剂a为乙酸乙酯或乙酸乙酯与异丙醇以体积比8:1的混合液；有机溶剂b为乙酸。
作为优选手段，步骤(4)中所述萃取剂的体积用量与混合液的体积比为2～5:1。
作为进一步的优选手段，步骤(5)按如下步骤进行：将步骤(4)获得老鹰茶叶黄酮粗提液精密量取2ml，与等量2ml乙腈混合，强力振摇，静置后取适量溶液于10000rpm转速离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，再适当稀释或直接进样测定。
具体实施方式
实施例1.线性关系考察
取系列不同浓度的混合有机酸对照品溶液，按以下方法测定：
石英毛细管每天使用前依次用1mol/l盐酸、水、1mol/l氢氧化钠和水清洗，最后用缓冲液平衡10min。两次电泳间歇用缓冲液冲洗10min，缓冲液使用4次后更换。电泳缓冲溶液：20mmol/lidc–0.5mmol/lctab(ph12.1)，毛细管柱：95cm×75μm，冷却液温度：20℃，进样：0.5psi×5s，分离电压：–30kv，检测波长：214nm。
以峰面积(a)为纵坐标、对照品浓度(c,μg/ml)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程及线性范围，草酸、甲酸、l-谷氨酸和乙酸的线性范围为20-1000μg/ml，柠檬酸和苹果酸的线性范围为20-500μg/ml，l-半胱氨酸的线性范围为50-1000μg/ml。根据3倍信噪比(s/n＝3)对应浓度确定检出限，草酸、甲酸、柠檬酸、苹果酸、l-谷氨酸和乙酸、黄酮的线性关系和检出限结果见表1。
表1.有机酸和黄酮的线性关系、检出限
实施例2.精密度试验
取200μg/ml混合对照品溶液，按照实施例1的测定方法，连续测定6次，计算7种有机酸和黄酮的峰面积相对标准偏差(rsd)，结果草酸、甲酸、柠檬酸、苹果酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、乙酸和黄酮的峰面积rsd分别为1.85％，1.67％，1.98％，2.03％，2.16％,1.71％,1.84％,6.75％，表明该方法精密度良好。
实施例3.重复性试验
分别称取1.0g老鹰茶样品6份，精密称定，按如下步骤配制样品溶液，测定7种有机酸的峰面积：
老鹰茶样品置真空干燥箱中于60℃烘干4h，研磨后过40目筛，精密称取细粉约1.0g，置于带塞锥形瓶中，加10ml水，超声1h，静置，过滤，用5ml水洗涤残渣，合并滤液，水浴浓缩后置于10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取2ml样品溶液，与等量2ml乙腈混合，强力振摇，静置后取适量溶液于10000rpm转速离心10min，上清液用0.45μm滤膜过滤，再适当稀释或直接进样测定。
结果草酸、甲酸、柠檬酸、苹果酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、乙酸和黄酮的峰面积rsd分别为2.03％、2.29％、2.95％、2.66％、2.34％、2.38％、2.16％、6.97％，表明此方法重复性良好。
实施例4.稳定性试验
按实施例3的方法配制样品溶液，分别于配置后0，3，6，12，24h进样，记录7种有机酸峰面积，结果草酸、甲酸、柠檬酸、苹果酸、l-半胱氨酸、谷氨酸、乙酸和黄酮的峰面积rsd分别为2.26％，2.15％，2.54％，2.67％，2.81％，2.32％，2.46％、6.88％，表明该方法在24h内稳定。
从以上实施例结果可以看出，采用idc为背景电解质，以ctab电泳溶液分离电压法测定的老鹰茶中七种有机酸类化合物(草酸、甲酸、柠檬酸、苹果酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸和乙酸)和黄酮的含量，该方法方法简便、快速、准确，且该制备方法操作简单，无需灭菌步骤，无需特殊设备，制备周期短，成本较低。
本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。