生物相容性多糖水凝胶和使用方法与流程
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本公开内容涉及多糖水凝胶及其组合物，以及其制备和使用方法。
背景技术：
作为身体中最大的器官，皮肤具有广泛的功能以支持和维持人类健康(schulziii等，annualreviewofmedicine，第51卷，第231-244页，2000；sun等，nanomedicine，2012)。皮肤表皮及其附属物(例如毛囊、皮脂腺和汗腺)能够对物理、化学和生物病原体的危害起到保护阻隔作用并且还防止脱水。然而，全厚度皮肤伤口愈合时通常皮肤的附属物不能再生，而是形成没有功能的疤痕性皮肤。疤痕皮肤的形成可导致严重的美容、功能和心理问题。美国和欧洲有超过8700万患者从疤痕减少疗法中受益(bush等，dermatologyresearchandpractice，第2010卷，2010；mak等，journalofdermatologicalscience，第56卷，第168-180页，2009)。尽管人们已经付出了巨大的努力来减少疤痕的形成，然而完美皮肤的再生仍然是一个挑战且是非常崇高的目标(martin，science，第276卷，第75-81页，1997)，故而成为伤口愈合的主要目的(heng，internationaljournalofdermatology，第50卷，第1058-1066页，2011；martin，science，第276卷，第75-81页，1997；sun等，jsmregenmed，第1卷，第1007页，2013)。
传统上，组织工程的主要做法是在体外构建受损组织的功能性替代物，然后将它们移植以修复和/或恢复损伤的器官。以对于急性深部伤口的治疗为例，首先在体外开发全厚度的人类皮肤等效物，然后移植到患者体内。然而，其愈合结果远远不能令人满意。近年来，众所周知的是各种活组织可能具有令人惊讶的再生能力，例如肝脏、骨骼和皮肤。组织工程中的一种新兴概念是，与其试图从体外重建复杂的活性组织，我们应着眼于开发合成材料，该材料与细胞建立关键的相互作用以解锁身体固有组织和自修复的能力(place等，natmater，第8卷，第457-470页，2009)。水凝胶是具有亲水性三维网状结构，类似于天然细胞外基质(ecm)。除了吸引人的仿生结构之外，水凝胶还具有独特的生物相容性、灵活的合成方法，广泛的成分以及所需的物理特性。因此，它们已成为再生医学中许多应用的所选材料(slaughter等，advancedmaterials，第21卷，第3307-3329页，2009；vantomme等，internationaljournalofpharmaceutics，第355卷，第1-18页，2008)。水凝胶可引入不同的功能团并保护生物活性分子不被改变，因此它们被用作智能药物递送系统(dds)(schillemans等，journalofcontrolledrelease，第150卷，第266-271页，2011；vantomme等，biomaterials，第26卷，第2129-2135页，2005)。同时，可将许多生物化学和物理性质引入水凝胶中以模拟体内微环境，由此作为确定的组织再生模板，从而提供诱导环境以将三维细胞组装形成功能组织或器官。
生物相容性是组织工程支架的一个重要考虑因素。这一点对伤口愈合尤为重要。成人中的过多炎症细胞会导致纤维化组织的形成(coolen等，woundrepairregen，第18卷，第291-301页，2010)。巨噬细胞是重要的炎症细胞。除了增强炎症响应之外，巨噬细胞还在增殖阶段刺激形成新组织，并在重塑阶段调节ecm合成。在受伤时，循环的单核细胞聚集到伤口部位，但在tgf-β的辅助下，单核细胞很快分化成巨噬细胞。在不同的刺激下，巨噬细胞可进一步极化成促炎巨噬细胞(m1)或抗炎巨噬细胞(m2)。它们产生促炎细胞因子(例如il-1、il-6)和生长因子(例如pdgf、tgf-β、vegf、fgf和egf)(barrientos等，woundrepairandregeneration，第16卷，第585-601页，2008；delavary等，immunobiology，第216卷，第753-762页，2011)，因此巨噬细胞即可诱导组织再生(m2)或产生破坏作用(m1)(brancato等，americanjournalofpathology，第178卷，第19-25页，2011；martinez等，frontbiosci，第13卷，第453-461页，2008)。最近的研究表明，巨噬细胞响应与植入的ecm支架材料之间存在很强的相关性(brown等，actabiomaterialia，第8卷，第978-987页，2012)，有利的m2表型可促进结构性组织重塑。因此，巨噬细胞表型和ecm支架材料之间的相互作用可用于预测伤口修复的结果，并且在再生医学中需要具有高生物相容性且可将巨噬细胞诱导成m2表型的生物材料。因此，对于伤口愈合，特别需要不引起免疫反应或较少免疫反应的支架。尽管一些基于胶原的支架已为临床应用所接受，然而在临床研究中观察到炎症增加(moreirateixeira等，biomaterials，第33卷，第3651-3661页，2012；muangman等，journaloftraumaandacutecaresurgery，第61卷，第1212-1217页，2006)。
最近，dex-ae/pegda水凝胶于小鼠的三度烧伤模型上证明具有促进完整的表皮及其皮肤附属物再生功能。参见sun等，proceedingsofthenationalacademyofsciences，第108卷，第20976-20981页(2011)。然而，临床前猪模型中的伤口愈合并未显示完整再生(shen等，thejournalofinvestigationofdermatology，第135卷，第2519-2529页，2015)。在该水凝胶配方中，聚乙二醇(peg)含量(约20％)导致固定并排斥细胞附着和浸润，这可能破坏水凝胶的治疗益处和临床意义。
因此，需要更生物相容的可生物降解的水凝胶，其可增强先天的自我再生能力，触发或激活不同的信号通道，并诱导干细胞的增殖、分化、成熟和/或迁移以在受伤区域或其周围形成皮肤结构和其他功能组织。
发明简述
本公开内容的一个方面涉及一种组合物，其包含多糖、基本上由多糖组成，或者进一步由多糖组成，所述多糖包含第一重复单元和第二重复单元、基本上由第一重复单元和第二重复单元组成，或者进一步由第一重复单元和第二重复单元组成，其中第一重复单元具有式(i)结构：
第二重复单元具有式(ii)结构：
其中r1选自氢、–oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2和–o(ch2)nnh2，其中r'为氢或甲基，n不小于1，m不小于1，且p不小于1；其中r2选自氢、–oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2和–o(ch2)nnh2，其中r'为氢或甲基，n不小于1，m不小于1，且p不小于1；其中r3选自氢、-oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2和–o(ch2)nnh2，其中r'为氢或甲基，n不小于1，m不小于1，且p不小于1。在某些实施例中，第一重复单元与第二重复单元相同。
在另一方面中，本公开内容涉及使所述组合物形成水凝胶的方法，其包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将如权利要求1-28中任一项所述的组合物混合在溶液中足够的时间；并将溶液暴露于uv光下，曝光后在组合物中形成交联的聚合物网络结构。
在一个方面中，本公开内容涉及合成大分子单体的方法，其包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：使包含-(ch2)p(coo)mcr’＝ch2、基本上由-(ch2)p(coo)mcr’＝ch2组成，或者进一步由-(ch2)p(coo)mcr’＝ch2组成的第一化合物与多糖的羟基反应，得到包含可聚合结构部分和可水解降解的连接基团、基本上由可聚合结构部分和可水解降解的连接基团组成，或者进一步由可聚合结构部分和可水解降解的连接基团组成的第一大分子单体，其中所述大分子单体为式ii；并使第一大分子单体与包含-(ch2)nnh2、基本上由-(ch2)nnh2组成，或者进一步由-(ch2)nnh2组成的第二化合物反应，该第二化合物与第一大分子单体的游离羟基反应以形成第二大分子单体，其中第二大分子单体为式iii。
在另一实施方案中，本公开内容涉及一种水凝胶形成体系，其中所述体系包含多糖、基本上由多糖组成，或者进一步由多糖组成，所述多糖包含式i的第一重复单元和式ii的第二重复单元、基本上由式i的第一重复单元和式ii的第二重复单元组成，或者进一步由式i的第一重复单元和式ii的第二重复单元组成，其中至少一种重复单元具有至少一个可聚合结构部分；其中所述体系在暴露于uv光之后聚合，由此形成三维聚合物网络。
在一个实施方案中，本公开内容还涉及减少疤痕形成的方法，所述方法包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：切除疤痕皮肤，并使用本公开内容的任一种组合物在疤痕皮肤区再生出皮肤。在另一实施方案中，本公开内容涉及促进皮肤伤口愈合或表皮和皮肤附属物再生的方法，所述方法包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将本公开内容的任一种组合物施用至一部分损伤皮肤区域上。
附图简述
图1显示了合成的具有高度生物相容且可生物降解的葡聚糖大分子单体的通用化学结构。
图2例示了生物相容性水凝胶前体的筛选。图2a显示了葡聚糖衍生的大分子的体外生物相容性，图2a(i)显示了48小时后在大分子单体存在时cos7细胞的活力，图2a(ii)显示了在0.05mg/ml培养基中大分子单体在hasc中的细胞毒性。图2b显示了具有生物相容性的dexieme的化学合成，其中将葡聚糖与甲基丙烯酸-2-异氰酸基乙酯(2-isocyanatoethylmethacrylate)(dexiem)反应，随后加入乙胺(dexieme)。显著性水平设定为：*p<0.05，**p<0.01，*＊*p<0.001。所示的值为平均值±sd。
图3显示了dexieme的表征。图3a显示了(i)葡聚糖，(ii)dexiem和(iii)dexieme的1hnmr谱。图3b显示了(i)葡聚糖，(ii)dexiem和(iii)dexieme的ftir谱(1和2：～1635cm-1；3：～1541cm-1；4：～1535cm-1)。
图4显示了巨噬细胞的分化和极化。图5a显示了单核细胞分化成巨噬细胞，随后进一步极化。图5b例示了大分子单体对(i)巨噬细胞分化的影响，并且进一步地对(ii)巨噬细胞极化成促炎(m1)和(iii)抗炎(m2)巨噬细胞的影响。
图5显示了大分子单体对巨噬细胞极化成m1和m2的影响。dexieme诱导较低的促炎m1，但促进较高的抗炎m2巨噬细胞表型。
图6显示了水凝胶的制备。图6a显示了dexieme水凝胶的合成，包括：(i)化学反应式和(ii)在irgacure2959存在下的光交联。图6b显示了水凝胶交联的优化，包括(i)水凝胶转化效率和(ii)不同浓度和时间下的溶胀比。
图7显示了以智能水凝胶作为急性皮肤损伤和异常伤口愈合的再生治疗方法。为了控制伤口以再生方式而不是修复方式愈合，开发了可与细胞建立密切相互作用的仿生支架以释放身体的先天再生能力。首先切除急性深部损伤(i)或疤痕皮肤(ii)，然后将可触发、激活不同信号通道且诱导内源性干细胞增殖、分化、迁移的智能水凝胶施用至受伤部位，从而使得皮肤干细胞可自组装成完整的皮肤结构。
图8例示了先前存在的疤痕的水凝胶治疗。图8a显示了在小鼠背部产生疤痕皮肤和用水凝胶进行局部治疗。图8a(i)显示了通过三度烧伤产生疤痕；图8a(ii)显示了部分切除疤痕皮肤；然后图8a(iii)显示了将水凝胶施用至伤口区域；图8a(iv)显示了5周后的伤口愈合结果。图8b显示了由三度烧伤切除的疤痕皮肤。图8c显示了在水凝胶处理后再生的新皮肤，图8c(i)显示了具有代表性的在疤痕皮肤处再生的新皮肤的苏木精和曙红(h&e)照片，虚线分别圈出了烧伤导致的疤痕皮肤和水凝胶治疗后再生的新皮肤；图8c(ii)显示了较高放大倍数下在原疤痕部位的完全再生皮肤；8c(iii)显示了较高放大倍数下由烧伤导致的未进行治疗的疤痕。比例尺＝200μm。图8d是对再生的新皮肤和疤痕皮肤之间的毛囊的定量分析。图8e显示了在皮层(ae13)、伴生层(companionlayer，k75)和外根鞘(ae13/ae15)中表达的新再生毛发。比例尺＝25μm。
图9显示了对疤痕皮肤局部治疗的照片，在dexieme处理后再生的新皮肤。图8d的定量分析是来自于这些实验的h&e照片。
图10显示了对先前存在的完整疤痕进一步进行水凝胶治疗。图10a显示了在小鼠背部产生疤痕皮肤和全水凝胶处理。图10a(i)显示了由三度烧伤疤痕切除的皮肤；图10a(ii)显示了将水凝胶置于完全切除的疤痕伤口上；图10a(iii)显示了在4周后再生的皮肤；图10a(iv)显示了皮肤的另外一面。图10b显示了水凝胶再生的完整皮肤结构。图10b(i)显示了由疤痕皮肤再生的皮肤，虚线从三个不同位置圈出了新生皮肤；图10b(i)、10b(ii)和10b(iii)是三个位置的放大图，其显示了新皮肤的形成。比例尺＝200μm。
图11显示了水凝胶治愈的猪皮的深部伤口。图11a显示了深切至皮下组织的完全皮肤切除的外科程序；图11a(i)水凝胶；图9a(ii)直径为2.5cm的圆形伤口；图11a(iii)显示了施用水凝胶以覆盖整个伤口；图11a(iv)显示了未进行水凝胶治疗和进行水凝胶治疗的伤口；图11(v)显示了在10周后愈合的伤口；图9a(vi)显示了在水凝胶治疗后愈合的伤口。图11b显示了不同时间点的伤口愈合的代表性h&e照片：(i)、(ii)和(iii)是未进行水凝胶治疗的伤口，(v)、(vi)和(vii)是进行水凝胶治疗的伤口愈合，(iv)和(viii)分别为对照组和水凝胶治疗的伤口的放大图。图11b(ii)和11b(vi)中的虚线是标识新形成的组织和正常皮肤之间的伤口界面。比例尺＝200μm。
图12是正常的猪皮肤。(a)正常猪皮肤结构的h&e染色组织切片和(b)其在较高放大倍数下的表皮层结构。比例尺＝100μm。
详细描述
应理解的是本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种属、化合物、聚合物和试剂，因此其可变化。还应理解的是本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附的权利要求限制。
本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如措辞“一个细胞”包括多个该细胞，且措辞“培养物”包括措辞一种或多种培养物以及本领域技术人员已知的其等同物等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义，除非另有明确说明。
任何本发明的方法、设备和体系的任何实施方案可由所述的步骤和/或特征组成，或者基本上由所述的步骤和/或特征组成，而不是包括/包含/含有/具有所述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由…组成”或“基本上由…组成”可被上文所述的开放式连接动词所替代，以便改变给定权利要求的范围，否则的话应该使用该开放式系动词。
在权利要求中使用术语“或”用来意指“和/或”，除非明确地指示其仅指代各选项，或者各选项是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代各选项和“和/或”的定义。
在本申请通篇中，术语“约”用于表示值包括因用于确定该值的设备或方法所导致的误差的标准偏差。
本文所用的术语“多个”意指多于一个。当表示值范围时，另一实施方案包括从一个具体值和/或至另一具体值。本文引用的所有参考文献通过引用并入，如同各自被单独并入一样。
本文所用的术语“处理”、“治疗”、“再生”等是指减少或改善疾病和/或与其相关的症状。应理解的是，尽管不排除，然而治疗疾病或病症不需要完全消除疾病、病症或与其相关的症状。
术语“改善”意指减少、降低、抑制、减轻、减小、阻止或稳定患病或受损皮肤的发展或进展。
本文所用的术语“交联组合物”意指能形成三维网络的组合物，并且所述网络可为固体或流体状凝胶。本领域技术人员通常能够区分固体水凝胶和流体状水凝胶。例如，“固体水凝胶”能在交联后保持其形状或具有足够的机械性能；而“流体状凝胶”即使在交联后也不能保持其形状，或者机械强度不足。然而，作为示例而非限制，可将流体状水凝胶视为具有提高的机械强度和松散的网络结构的水凝胶。
本文所用的术语“多糖”是指包含主要(至少90％)含单糖重复单元和/或衍生化的单糖重复单元的主链、基本上由其组成的主链，或者进一步由其组成的主链。非限制性实例包括淀粉、改性淀粉、支链淀粉、改性支链淀粉、直链淀粉、改性直链淀粉、脱乙酰壳多糖，甲壳质、瓜耳胶、改性瓜耳胶、刺槐豆胶、塔拉胶、魔芋胶、魔芋粉、葫芦巴胶、牧豆树胶、芦荟甘露聚糖、纤维素、改性纤维素(代表性实例包括羧烷基化纤维素和羧甲基纤维素)、氧化多糖、硫酸化多糖、阳离子多糖(例如但不限于脱乙酰壳多糖、多糖的季铵衍生物或胍基化的多糖(如加拿大专利2,519,417(berrada)所述)、果胶、阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄原胶，κ、ι或λ-角叉菜聚糖，琼脂、藻酸盐及其混合物。
本文所用的术语“重复单元”具有本领域技术人员理解的一般含义。在一些实施方案中，术语“重复单元”是指在至少两个位置连接到聚合物的另一重复单元或末端单元的聚合物部分。
本文所用的术语“水凝胶”在本文中用于指代在水中溶胀且包含一种或多种单体在有或没有交联剂下聚合的多孔三维大分子网络。在一些实施方案中，水凝胶可在没有交联剂的情况下形成(例如本发明的一些实施方案)。在一些实施方案中，形成水凝胶需要交联剂，例如dex-ae/pegda体系。
本文所用的术语“交联剂”在本文中以其常规含义使用，即当与适当的基础单体反应时可形成三维网络的分子。
本文所用的术语“交联”在本文中用于指代交联剂已与基础单体分子反应形成三维网络的时间点。
本文所用的术语“支架”是指具有或不具有机械强度以支持新组织形成的三维多孔聚合物结构。
本文所用的术语“葡聚糖”是指由连接到不同长度的链的葡萄糖分子组成的复杂支化多糖。其中葡聚糖中的天然葡聚糖已经被数个研究者证实由肠膜明串珠菌(l.mesenteroide)释放的酶作用在蔗糖上而酶促产生，此外还可由另一种细菌明串珠菌属(leuconostocsp.)产生。bixler等在industrialandengineeringchemistry，第692-705页，1953年4月中汇总了天然葡聚糖的生产，其全部内容通过引用并入本文。
术语“葡聚糖衍生物”是指具有经由酯键连接到大部分葡聚糖聚合物羟基上的乙酸酯、丙酸酯和/或琥珀酸酯基团的任意葡聚糖聚合物族。在一个实施方案中，葡聚糖聚合物衍生物可选自乙酸葡聚糖、丙酸葡聚糖、琥珀酸葡聚糖、乙酸丙酸葡聚糖、乙酸琥珀酸葡聚糖、丙酸琥珀酸葡聚糖、乙酸丙酸琥珀酸葡聚糖及其混合物。在另一实施方案中，葡聚糖聚合物衍生物为乙酸琥珀酸葡聚糖。在另一实施方案中，葡聚糖聚合物衍生物为丙酸琥珀酸葡聚糖。
本公开内容的一个实施方案涉及一种组合物，其包含多糖、基本上由多糖组成，或者进一步由多糖组成，所述多糖包含第一重复单元和第二重复单元、基本上由第一重复单元和第二重复单元组成，或者进一步由第一重复单元和第二重复单元组成，其中第一重复单元具有式(i)结构：
第二重复单元具有式(ii)结构：
其中，r1选自氢、–oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2和–o(ch2)nnh2，其中r'为氢或甲基，n不小于1，m不小于1，p不小于1；r2选自氢、–oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2和–o(ch2)nnh2，其中r'为氢或甲基，n不小于1，m不小于1，p不小于1；r3选自氢、-oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2和–o(ch2)nnh2，其中r'为氢或甲基，n不小于1，m不小于1，p不小于1。在一个实施方案中，多糖具有式(iii)结构：
其中x大于1且y大于1。在一些实施方案中，p＝2。在一些实施方案中，m＝1。在一个实施方案中，r'为甲基。在一个实施方案中，n＝2或3。在另一实施方案中，–o(ch2)nnh2为式(iv)结构：
在另一实施方案中，–o(ch2)nnh2具有式(v)结构：
在一个实施方案中，–oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2具有式(vi)结构：
在一些实施方案中，r1为式iv，r2为氢或式vi，且r3为氢或式vi；其中r1为氢或式vi，r2为式iv，且r3为氢或式vi；其中r1为氢或式vi，r2为氢或式vi，且r3为式iv；其中r1为式iv，r2为式iv或式vi，且r3为式iv或式vi；或者其中r1为式vi，r2为式iv，且r3为式iv。在一些实施方案中，r1具有式v，r2为氢或式vi，且r3为氢或式vi；其中r1为氢或式vi，r2为式v，且r3为氢或式vi；其中r1为氢或式vi，r2为氢或式vi，且r3为式v；其中r1为式v，r2为式v或式vi，且r3为式v或式vi；或者其中r1为式vi，r2为式v，且r3为式v。
在一个方面中，所述多糖包含葡聚糖、基本上由葡聚糖组成，或者进一步由葡聚糖组成。在一些实施方案中，葡聚糖的平均分子量为至少2,000至2,000,000道尔顿。在不同的实施方案中，葡聚糖的平均分子量为200,000道尔顿。在一个实施方案中，葡聚糖具有多于13个重复单元。在另一实施方案中，葡聚糖具有10、100、500、104或多于104个重复单元。葡聚糖衍生物的非排他性列表如表1所示。在一些实施方案中，重复单元包含胺基、基本上由胺基组成，或者进一步由胺基组成。在另一实施方案中，所述多糖包含至少一个可水解降解结构部分、基本上由至少一个可水解降解结构部分组成，或者进一步由至少一个可水解降解结构部分组成，其中所述可水解降解结构部分位于生物相容性葡萄糖重复单元和交联基团之间。在一个实施方案中，交联基团包括不饱和乙烯基、基本上由不饱和乙烯基组成，或者进一步由不饱和乙烯基组成。在另一实施方案中，可水解降解结构部分包括酯基，基本上由酯基组成，或者进一步由酯基组成。在一些实施方案中，胺基包括伯胺基、基本上由伯胺基组成，或者进一步由伯胺基组成。在一个实施方案中，胺基和交联基团可位于相同或不同的重复单元上。在一些实施方案中，所述多糖是交联的。在不同的实施方案中，所述组合物为水凝胶。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含生物活性剂，基本由生物活性剂组成，或者进一步由生物活性剂组成。
表1
用于本文所述的可溶性水凝胶和/或组合物中的生物活性剂的实例包括但不限于：药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或病的物质；或证明身体结构或功能的物质；或前药，其在置于预定的生理环境中后变得具有生物活性或更有活性。在一些实施方案中，生物活性剂包括但不限于：生长因子，例如转化生长因子(tgf)基因族(例如tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3)的成员，成纤维细胞生长因子(fgf)，血小板衍生化的生长因子(pdgf)，表皮生长因子(egf)，结缔组织活性肽(ctap)，成骨因子，骨形态发生蛋白(例如bmp-1、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8、bmp-9)；肝素结合生长因子(例如成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)，血小板衍生化的生长因子(pdgf)、胰岛素样生长因子(igf))；抑制素(例如抑制素a、抑制素b)；生长分化因子(如gdf-1)；和激活素(例如激活素a、激活素b、激活素ab)，血管内皮生长因子(vegf)；激素，例如但不限于胰岛素、胰高血糖素和雌激素；治疗剂或药物，例如但不限于伤口愈合剂、抗炎类固醇和化学治疗剂；抗微生物剂；麻醉剂以及这些生长因子的生物活性类似物、片段和衍生物；及其任何组合。
在一些实施方案中，生物活性剂可为药物活性剂。药物活性剂的非限制性实例可包括(1)非甾体抗炎药(nsaid)，镇痛药，包括但不限于双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬和萘普生；(2)阿片激动剂镇痛药，包括但不限于可待因、万古霉素、头孢他啶、芬太尼、氢吗啡酮和吗啡；(3)水杨酸盐镇痛药，包括但不限于阿司匹林(asa)(或肠溶衣asa)；(4)h1阻滞剂抗组胺药，包括但不限于氯马斯汀和特非那定；(5)h2阻滞剂抗组胺药，包括但不限于西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和雷尼替丁；(6)抗感染药，包括但不限于莫匹罗星；(7)抗厌氧菌抗感染药，包括但不限于氯霉素、甲硝唑和克林霉素；(8)抗真菌抗生素抗感染药，包括但不限于两性霉素b、克霉唑、氟康唑和酮康唑；(9)大环内酯抗生素抗感染药，包括但不限于阿奇霉素和红霉素；(10)各种β-内酰胺抗生素抗感染药，包括但不限于氨曲南和亚胺培南；(11)青霉素抗生素抗感染药，包括但不限于萘夫西林、苯唑西林、青霉素g和青霉素v；(12)喹诺酮抗生素抗感染药，包括但不限于环丙沙星和诺氟沙星；(13)四环素抗生素抗感染药，包括但不限于多西环素、米诺环素和四环素；(14)抗结核分枝杆菌的抗感染药，包括但不限于异烟肼(inh)和利福平；(15)抗原虫抗感染药，包括但不限于阿托伐醌和氨苯砜；(16)抗疟原虫的抗感染药，包括但不限于氯喹和乙胺嘧啶；(17)抗逆转录病毒的抗感染药，包括但不限于利托那韦和齐多夫定；(18)抗病毒的抗感染剂，包括但不限于阿昔洛韦、更昔洛韦、干扰素α和金刚乙胺；(19)烷基化抗肿瘤剂，包括但不限于卡铂和顺铂；(20)亚硝基脲烷基化抗肿瘤剂，包括但不限于卡莫司汀(bcnu)；(21)抗代谢抗肿瘤剂，包括但不限于甲氨蝶呤；(22)嘧啶类似物抗代谢抗肿瘤剂，包括但不限于氟尿嘧啶(5-fu)、吉西他滨、奥昔单抗(orceftazidime)、aminoglycodimeroperium或替卡西林和妥布霉素；(23)激素类抗肿瘤药，包括但不限于戈舍瑞林、亮丙瑞林和他莫昔芬；(24)天然抗肿瘤药，包括但不限于阿地白介素、白细胞介素-2、多西他赛、依托泊苷(vp-16)、干扰素α、紫杉醇和维a酸(atra)；(25)抗生素天然抗肿瘤药，包括但不限于博来霉素、放线菌素、柔红霉素、多柔比星和丝裂霉素；(26)长春花生物碱天然抗肿瘤药，包括但不限于长春碱和长春新碱；(27)自主神经药，包括但不限于尼古丁；(28)抗胆碱能自主神经药，包括但不限于苯扎托品和苯海索；(29)抗毒蕈碱性抗胆碱能自主神经药，包括但不限于阿托品和奥昔布宁；(30)麦角生物碱自主神经药，包括但不限于溴隐亭；(31)胆碱能激动剂拟副交感神经药，包括但不限于毛果芸香碱；(32)胆碱酯酶抑制剂拟副交感神经药，包括但不限于吡啶斯的明；(33)α-阻滞剂抗交感神经药，包括但不限于哌唑嗪；(34)β阻滞剂抗交感神经症，包括但不限于阿替洛尔；(35)肾上腺素能激动剂拟交感神经药，包括但不限于沙丁胺醇和多巴酚丁胺；(36)心血管药物，包括但不限于阿司匹林(asa)，波立维(硫酸氢氯吡格雷)等；(37)β阻滞剂抗心绞痛药，包括但不限于阿替洛尔和普萘洛尔；(38)钙通道阻滞剂抗心绞痛药，包括但不限于硝苯地平和维拉帕米；(39)硝酸酯抗心绞痛药，包括但不限于硝酸异山梨酯(isdn)；(40)强心苷抗心律不齐药，包括但不限于地高辛；(41)i类抗心律不齐药，包括但不限于利多卡因、美西律、苯妥英、普鲁卡因胺和奎尼丁；(42)ii类抗心律不齐药，包括但不限于阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔和噻吗洛尔；(43)iii类抗心律不齐药，包括但不限于胺碘酮；(44)tv类抗心律不齐药，包括但不限于地尔硫卓和维拉帕米；(45)α阻滞剂抗高血压药，包括但不限于哌唑嗪；(46)血管紧张素转化酶抑制剂(ace抑制剂)抗高血压药，包括但不限于卡托普利和依那普利；(47)β阻滞剂抗高血压药，包括但不限于阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔和普萘洛尔；(48)钙通道阻滞剂抗高血压药，包括但不限于地尔硫卓和硝苯地平；(49)中枢作用的肾上腺素能抗高血压药，包括但不限于可乐定和甲基多巴；(50)利尿剂抗高血压药，包括但不限于阿米洛利，呋塞米，氢氯噻嗪(hctz)和螺内酯；(51)外周血管扩张剂抗高血压药，包括但不限于肼屈嗪和米诺地尔；(52)抗高血脂药，包括但不限于吉非贝齐和普罗布考；(53)胆汁酸螯合剂抗高血脂药，包括但不限于考来烯胺；(54)hmg-coa还原酶抑制剂抗高血脂药，包括但不限于洛伐他汀和普伐他汀；(55)心肌收缩力增强剂(inotropes)，包括但不限于氨力农，多巴酚丁胺和多巴胺；(56)强心苷心肌收缩力增强剂，包括但不限于地高辛；(57)血栓溶解剂或酶，包括但不限于阿替普酶(tpa)、阿尼普酶、链激酶和尿激酶；(58)皮肤病药，包括但不限于秋水仙碱、异维a酸、甲氨蝶呤、米诺地尔、维a酸(atra)；(59)皮肤病学皮质类固醇抗炎药，包括但不限于倍他米松和地塞米松；(60)抗真菌局部感染药，包括但不限于两性霉素b，克霉唑，咪康唑和制霉菌素；(61)抗病毒局部感染药，包括但不限于阿昔洛韦；(62)局部抗肿瘤药，包括但不限于氟尿嘧啶(5-fu)；(63)电解质和肾脏用药，包括但不限于乳果糖；(64)髓袢利尿剂，包括但不限于呋塞米；(65)保钾利尿剂，包括但不限于氨苯蝶啶；(66)噻嗪类利尿剂，包括但不限于氢氯噻嗪(hctz)；(67)促尿酸尿药，包括但不限于丙磺舒；(68)酶，包括但不限于rna酶和dna酶；(69)免疫抑制剂，包括但不限于环孢菌素、类固醇、甲氨蝶呤、他克莫司、西罗莫司、雷帕霉素；(70)止吐药，包括但不限于丙氯拉嗪；(71)水杨酸酯胃肠消炎药，包括但不限于柳氮磺吡啶；(72)胃酸泵抑制剂抗溃疡剂，包括但不限于奥美拉唑；(73)h2阻滞剂抗溃疡剂，包括但不限于西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和雷尼替丁；(74)助消化剂，包括但不限于胰脂肪酶；(75)促胃肠动力药，包括但不限于红霉素；(76)阿片激动剂静脉麻醉药，包括但不限于芬太尼；(77)造血抗贫血药，包括但不限于促红细胞生成素、非格司亭(g-csf)和沙格司亭(gm-csf)；(78)凝血剂，包括但不限于抗血友病因子1-10(ahf1-10)；(79)抗凝血药，包括但不限于华法林、肝素(对于肝素结合的聚合物和心肺转流术泵回路而言是重要的)、阿加曲班—各自通过不同的机理起作用并且被不同地代谢；(80)生长受体抑制剂，包括但不限于厄洛替尼和吉非替尼；(82)堕胎药，包括但不限于甲氨蝶呤；(83)抗糖尿病药，包括但不限于胰岛素；(84)口服避孕药，包括但不限于雌激素和孕激素；(85)孕激素避孕药，包括但不限于左炔诺孕酮和炔诺孕酮；(86)雌激素，包括但不限于共轭雌激素、己烯雌酚(des)、雌激素(雌二醇，雌酮和硫酸雌酮哌嗪)；(87)致育药，包括但不限于氯米芬、人绒毛膜促性腺素(hcg)和促生育素；(88)甲状旁腺药，包括但不限于降钙素；(89)垂体激素，包括但不限于去氨加压素、戈舍瑞林、催产素和加压素(adh)；(90)孕激素，包括但不限于甲羟孕酮、炔诺酮和孕酮；(91)甲状腺激素，包括但不限于左甲状腺素；(92)免疫生物学药剂，包括但不限于干扰素β-1b和干扰素γ-1b；(93)免疫球蛋白，包括但不限于免疫球蛋白im、imig、igim和免疫球蛋白iv、ivig、igiv；(94)酰胺局部麻醉剂，包括但不限于利多卡因；(95)酯局部麻醉剂，包括但不限于苯佐卡因和普鲁卡因；(96)肌骨骼皮质类固醇抗炎药，包括但不限于倍氯米松、倍他米松、可的松、地塞米松、氢化可的松和泼尼松；(97)肌骨骼抗炎免疫抑制剂，包括但不限于硫唑嘌呤，环磷酰胺和甲氨蝶呤；(98)肌骨骼非甾体抗炎药(nsaid)，包括但不限于双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、酮咯酸和萘普生；(99)骨骼肌松弛药，包括但不限于巴氯芬、环苯扎林和地西泮；(100)反向神经肌肉阻滞剂骨骼肌松弛剂，包括但不限于吡啶斯的明；(101)神经病药，包括但不限于尼莫地平、利鲁唑、他克林和噻氯匹定；(102)抗惊厥药，包括但不限于卡马西平、加巴喷丁、拉莫三嗪、苯妥英和丙戊酸；(103)巴比妥酸盐抗惊厥药，包括但不限于苯巴比妥和扑米酮；(104)苯并二氮杂
因此，在另一实施方案中，生物活性剂选自药剂、药物、细胞、气体和气态前体、合成有机分子、蛋白质、酶、生长因子、维生素、类固醇、聚阴离子、核苷、核苷酸、聚核苷酸、纳米颗粒、诊断剂、遗传物质及其任何组合。在一些实施方案中，生长因子选自表皮生长因子、血小板衍生化的生长因子、肝细胞生长因子、人生长激素、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及其组合。
在另一方面，本公开内容涉及使所述组合物形成水凝胶的方法，其包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将如权利要求1-28中任一项所述的组合物混合在溶液中足够的时间；并将溶液暴露于uv光下，光照后组合物形成交联的聚合物网络结构。在一个实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：使水凝胶组合物干燥。在另一实施方案中，在交联反应完成之前将水凝胶干燥一段时间。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将水凝胶组合物破碎。在一个不同的实施方案中，在干燥后将水凝胶破碎。在一个实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将水凝胶组合物浇铸成预定的浇铸形状。在另一实施方案中，所述方法还包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将所述组合物切割、折叠、拉伸、取芯和/或机加工成不同于浇铸形状的预定形状或尺寸。在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将生物活性剂掺入组合物中，其中生物活性剂包含如下物质、基本上由如下物质组成，或者进一步由如下物质组成：药物；维生素、矿物质补充剂、前药、生长因子或药物活性剂。
在一个方面中，本公开内容涉及合成大分子单体的方法，其包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：使-(ch2)p(coo)mcr’＝ch2与多糖的羟基反应，得到包含可聚合结构部分和可水解降解的连接基、基本上由可聚合结构部分和可水解降解的连接基组成，或者进一步由可聚合结构部分和可水解降解的连接基组成的第一大分子单体，该大分子单体为式ii；并且使第一大分子单体与包含-(ch2)nnh2、基本上由-(ch2)nnh2组成，或者进一步由-(ch2)nnh2组成的第二化合物反应，其中第二化合物与第一大分子单体的游离羟基反应，从而形成第二大分子单体，其中第二大分子单体为式iii。在一个实施方案中，第一和第二大分子单体是可生物降解的。在另一实施方案中，第二大分子单体比第一大分子单体更具生物相容性。在一些实施方案中，羟基可与异氰酸酯基在二月桂酸二丁基锡存在下反应以形成氨基甲酸酯基，从而在多糖中引入可生物降解的酯基和不饱和乙烯基。在不同的实施方案中，在三甲胺的存在下，羟基被取代以产生伯胺侧基。在一个实施方案中，所述多糖包括葡聚糖、基本上由葡聚糖组成，或者进一步由葡聚糖组成。在一些实施方案中，葡聚糖的平均分子量范围为至少2000道尔顿至200,000道尔顿。
在一个实施方案中，多糖上的羟基的-oconh(ch2)p(coo)mcr’＝ch2取代度为0.05-0.97。在一个实施方案中，多糖上的羟基的–o(ch2)nnh2取代度为0.03-0.95。
在另一实施方案中，本公开内容涉及一种水凝胶形成体系，其中所述体系包含多糖、基本上由多糖组成，或者进一步由多糖组成，所述多糖包含式i的第一重复单元和式ii的第二重复单元、基本上由式i的第一重复单元和式ii的第二重复单元组成，或者进一步由式i的第一重复单元和式ii的第二重复单元组成，其中至少一个重复单元具有至少一个可聚合结构部分；其中所述体系在暴露于uv光之后聚合，由此形成三维聚合物网络。在一个实施方案中，所述多糖为葡聚糖。在另一实施方案中，葡聚糖具有至少2000道尔顿至200,000道尔顿的平均分子量和至少13个至1234个重复单元。在不同的实施方案中，所述水凝胶形成体系的重量浓度为0.01-99.99％。在一些实施方案中，所述水凝胶能够以受控方式负载蛋白质分子并释放该分子。
在一个实施方案中，本公开内容还涉及减少疤痕形成的方法，所述方法包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：切除疤痕皮肤，以及用本公开内容的任一种组合物在疤痕皮肤区域上再生皮肤。在另一实施方案中，本公开内容涉及促进皮肤伤口愈合或表皮和皮肤附属物再生的方法，所述方法包括如下步骤、基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将本公开内容的任一种组合物施用至一部分损伤的皮肤区域上。在一个实施方案中，所述组合物局部施用。在另一实施方案中，皮肤附属物包括毛囊、皮脂腺和汗腺，基本上由毛囊、皮脂腺和汗腺组成，或者进一步由毛囊、皮脂腺和汗腺组成。在一些实施例中，损伤的皮肤区域包括刮擦、切割、撕裂、擦伤、挫伤磨损，穿刺、切口、一度烧伤、二度烧伤、三度烧伤、开放性伤口，皮肤撕脱和/或划伤，基本上由其组成或者进一步由其组成。在一个实施方案中，所述组合物为水凝胶。在一些实施方案中，所述水凝胶包括液体水凝胶、固体水凝胶、纳米尺寸的水凝胶和/或宏观尺寸的水凝胶，基本上由其组成，或者进一步由其组成。在一个实施方案中，将在施用前所述水凝胶冷冻干燥、切割、切碎或剁碎。在一些实施方案中，所述水凝胶可吸收多余的流体，渗出物和/或保持水分。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤，基本上由如下步骤组成，或者进一步由如下步骤组成：将所述组合物置于未受伤的皮肤区域。在一些实施方案中，将所述组合物施用于整个受伤区域。在一个实施方案中，所述组合物包含需要治疗的个体的生物活性剂，基本上由生物活性剂组成，或者进一步由生物活性剂组成。在一些实施方案中，所述生物活性剂包含药物、维生素、矿物质补充剂、前药、生长因子或药物活性剂，基本上由其组成，或者进一步由其组成。在另一实施方案中，所述水凝胶用于再生新组织或保护组织不进一步损伤或恶化。在一些实施方案中，所述组织包括皮肤、肌肉、骨骼、肝脏、肺、骨骼肌、牙髓、脉管系统、胃肠道、心脏组织、眼组织、肠、椎间盘、软骨、韧带、腱或其组合。
实施例
提出以下实施例，旨在为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并非是限制发明人看待其发明的范围，而且它们也并非用于表明下文的实验是所实施的所有或唯一的实验。尽管会努力保证所用的数字(例如数量、温度等)的准确性，但也应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同各单独的出版物或专利被具体和单独地通过引用并入一样。
已就本发明人发现或提出的具体实施方案描述了本发明，以便包括用于实施本发明的优选模式。本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在不偏离本发明的预期范围下，可对所例示的具体实施方案做出许多改变和变化。
水凝胶可通过直接化学反应进行交联，或者所述反应可由化学引发剂或光引发剂引发。光引发的交联可提供如下优点：通过直接控制uv光暴露而更容易地控制交联度。因此，某些实施方案包括水凝胶和在特定时间内形成水凝胶的水凝胶形成组合物。例如，在暴露于365nm的36w紫外灯下由此引发自由基聚合以形成任何成型水凝胶时，所述组合物可在小于约1分钟，小于约5分钟，小于约10分钟或小于约20分钟内形成水凝胶。dexieme水凝胶结构如图6a所示。为了优化水凝胶交联，图6b进一步显示了不同条件下的转化效率和溶胀比，由此缩小皮肤再生的理想交联条件。
所用水凝胶可用敷料保持就位。敷料可保护伤口免受细菌感染，控制水分蒸发损失，防止脱水，控制氧气和二氧化碳的渗透性，且吸收伤口渗出物。
在一些实施方案中，所述水凝胶包含一些试剂，基本上由其组成，或者进一步由其组成，从而促进伤口修复和皮肤完全再生，所述试剂例如为生长因子、细胞因子、基因、干细胞等。在一些实施方案中，药剂可为抗生素或生长因子。当所述水凝胶包含抗生素时，所述抗生素可例如为抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂或抗微生物剂，以防止或减少伤口感染。
从前文的描述显而易见的是，可对本文描述的发明进行改变和修改以使其适于各种用途和条件。该类实施方案也处于下文权利要求的范围内。
除非上下文另有说明，否则以单数时态列出的术语也包括多个。
将在以下实施例中说明本发明化合物的制备、表征和使用方法。起始物质根据本领域已知或本文所示的方法制备。提供以下实施例以使得可以更全面地理解本发明。这些实施例仅仅是示意性的，不应解释为以任何方式限制本发明。
以下非限制性实例用于进一步阐述本专利的公开内容。
统计
对于每个数据点，对3-8个样品进行葡聚糖衍生物和水凝胶性质的所有测量。合适的话，实施单向或双向anova测试(graphpadprism4.02，graphpadsoftware，sandiego，ca)。显著性水平用post测试确定，且设定为：*p<0.05，**p<0.01，*＊*p<0.001。报告所有图形数据。
实施例1
生物吸收性dex大分子单体的合成
葡聚糖大分子单体的合成包括两个步骤，如图2所示。dexiem水凝胶前体的制备和先前的报道类似(sun等，carbohydratepolymers，第65卷，第273-287页，2006)。首先使葡聚糖在dbtdl催化剂存在下与iem反应以形成葡聚糖-甲基丙烯酸异氰酸酯基乙酯(dexiem)。在室温(25℃)和干燥氮气下，将干燥的葡聚糖(mw40,000；8.0g)溶于无水dmso(70.0ml)中。在室温下将dbtdl催化剂(1.2ml)注入溶液中，然后滴加im(1.2ml)。将反应混合物在室温(25℃)下搅拌12小时。将得到的大分子单体在冷的过量异丙醇中沉淀。通过溶解并分别在dmso和异丙醇中沉淀而进一步纯化产物。将得到的该dexiem在37℃下真空干燥过夜。
生物相容性是生物活性支架的重要考虑因素。细胞活力实验显示，dexieme在较高浓度下具有优异的生物相容性(图2a(i))。dexieae是一种具有最小差异的新设计，然而dexieae还显示出比dex-ae显著更大的生物相容性。在较低浓度下，dexieae也具有与dex-ae相比显著提高的生物相容性(sun等，jbiomedmaterresa，第93卷，第1080-1090页，2010)(图2a(ii))。dexieme的合成示于图2b中。dexiem通过在dbtdl催化剂存在下使葡聚糖与甲基丙烯酸2-异氰酸酯基乙酯反应而容易地获得。在该步骤中，将具有异氰酸酯基、可生物降解的酯基和可交联的乙烯基的化合物引入葡聚糖中，从而得到dexiem。在第二步中，如图2b所示，使dexiem与beahb反应，由此将胺基引入dexiem的游离羟基以形成dexieme。所述反应在三乙胺存在下进行。
在两个化学改性步骤之后，葡聚糖转变成可酶降解和可水解降解的且具有改进的生物相容性的大分子单体。此外，该改性可引入较长的链，因此不需要使用第二交联剂来制造水凝胶。
为了提高所述大分子单体的生物相容性，将伯胺基团引入dexiem大分子单体中。将胺基引入葡聚糖中得到了具有更好的生物相容性和释放性质的水凝胶(sun等，journalofbiomedicalmaterialsresearchparta，第93a卷，第1080-1090页，2010)。简言之，在干燥氮气下将干燥的dexiem(3.0g)溶于无水dmso(30ml)中。将三乙胺(5.6ml)注入上述溶液中。将beahb(3.75g)溶于dmso(10ml)中，然后滴加到上述溶液中。将该反应溶液在50℃下搅拌8小时。过滤反应混合物以除去沉淀的et3nh4br。通过将过滤的溶液沉淀至过量的冷异丙醇中而获得所得的dexieme。通过溶解并分别用dmso和冷异丙醇沉淀而将产物进一步纯化至少3次。将dexieme在37℃下真空干燥过夜。然后将所得的dexieme用蒸馏水渗析(mwco：1000道尔顿)3天，再冻干3天。在引入胺基后，dexieme显示出比dexiem显著改善的生物相容性(图2a(i))。
化学表征
通过ftir和1hnmr表征葡聚糖及其衍生的大分子单体以确定其化学结构。对于ftir表征，将所有样品在真空烘箱中干燥至少24小时，然后用kbr粉末压制成丸粒(1/10，w/w)以进行ft-ir表征(nicoletmagna560，madison，si)。对于1hnmr表征，将样品以25％(w/v)的浓度溶解在氘代dmso(dmso-d6)中，并在varianinova400mhz光谱仪(paloalto，ca)上记录其光谱。使用2.50ppm处的dmso峰作为参比线。
通过核磁共振(1hnmr)和傅立叶红外变换(ftir)进一步表征葡聚糖、dexiem和dexieme的化学结构，且示于图3中。如图3a中关于不同大分子单体的1hnmr谱所示，dexiem和dexieme的乙烯基端基峰出现在6.16pm和5.75ppm处。7.33和7.47ppm处的峰可归属于氨基甲酸酯(-nh-)质子，3.54ppm处的峰归属于与胺基共轭的烷基。如图3b中关于这些大分子单体的ftir谱所示，1635cm-1处的峰显示出典型的双键拉伸振动，这证实了乙烯基的成功共轭。dexiem中1541cm-1处的峰归属于酰胺ii，且由于胺基的n-h拉伸振动，在dexieme中迁移至1535cm-1。总之，nmr和ftir谱都证实了我们设计的大分子单体的结构。葡聚糖及其衍生物的表征如图3所示。
实施例2
生物相容性
为了缩小水凝胶前体的范围，首先对葡聚糖衍生物进行细胞毒性试验。通过使用mtt测定(invitrogen)增殖非洲绿猴sv40转化的肾成纤维细胞(cos7)来评估生物相容性。简言之，将cos7细胞以每孔6000个细胞的密度接种在96孔板中，并在含有10％fbs的100μldmem中培育24小时。随后，向各孔中加入不同浓度的葡聚糖衍生物样品。在48小时后，向每个孔中加入20mlmtt(5mg/ml，于pbs缓冲液中)溶液并再培育4小时。最后，用150ml二甲亚砜(dmso)代替培养基。通过酶标仪(bio-rad，型号550，usa)在570nm下测量吸光度。相对细胞活力由以下方程计算：细胞活力(％)＝(od570(样品))/od570(对照))×100％，其中od570(样品)是在样品存在下获得的读数，od570(对照)是在不存在样品下的读数。
脂肪细胞对伤口愈合和毛囊再生都是有益的(festa等，cell，第146卷，第761-771页；schmidt等，development，第140卷，第1517-1527页，2013)。为了进一步研究葡聚糖衍生物的生物相容性，使用mts试剂盒(sigma)来检测人脂肪干细胞(asc)(cyagenbiosciencestechnology)的增殖。将asc在含有10％胎牛血清的dmem/f-12中培养，直至细胞达到80％融合。简言之，将asc在大分子单体溶液(5.0μl/ml培养基)的存在下培养并每天计数，或在含有20％(v/v)mts溶液的培养基中培育4小时。然后将培养基转移到96孔板中，并在微板读数器中在490nm下读取结果。
实施例3
巨噬细胞分化
在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640培养基中培养人体单核细胞白血病thp-1细胞系(americantypeculturecollection)。根据公开的方案(freytes等，journalofcellularbiochemistry，第114卷，第220-229页(2013)；tjiu等，jinvestdermatol，第129卷，第1016-1025页(2008))，thp-1细胞在用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(50ng/ml)处理48小时后分化成巨噬细胞。为了测试大分子单体对巨噬细胞增殖的影响，在大分子单体溶液(5.0μl/ml培养基)存在下，将分化的巨噬细胞(2.0×105细胞/ml)在标准湿度和co2条件下在37℃下培育96小时，且在加入mts溶液后再培育4小时。将120μl培养基转移到96孔板中，并在微板读数器中在490nm下读取结果。
促炎(m1)/抗炎(m2)巨噬细胞的极化
在thp-1细胞分化成巨噬细胞后，它们分别进一步极化为m1和m2表型。在有240ng/mllps和20ng/mlifn-γ和10％热灭活的胎牛血清(hi-fbs)的rpmi-1640培养基中处理48小时后，得到m1极化巨噬细胞。在含有10％hi-fbs的20ng/mlil-4和20ng/mlil-13的rpmi-1640培养基中获得了m2极化巨噬细胞。类似地，将极化的m1/m2细胞(2.0×105细胞/ml)在大分子单体溶液(5.0μl/ml培养基)存在下在37℃下培育96小时，并且在加入mts溶液后进一步培育4小时。将120μl培养基转移到96孔板中，并在微板读数器中在490nm下读取结果。
成人中的过多炎症细胞导致形成纤维化组织。因此，不引起免疫响应或较少免疫响应的支架是伤口愈合所特别需要的。巨噬细胞的分化和极化示于图4中。图4b(i)显示当暴露于巨噬细胞时，dexieme在4天内具有比dex-ae显著更低的炎症响应。进一步的研究还表明，dexieme比dex-ae、ha和matristem引起更少的促炎响应(图4b(ii))，但显示出更大的抗炎响应(图4b(iii))。如图5所示，matristem具有强烈的促炎响应，而dexieme具有较低的促炎响应，然而具有强烈的抗炎响应。总的来说，该结果清楚表明，dexieme引起低免疫响应，可能是皮肤再生的良好候选者。随着细胞毒性，其安全性得到进一步证实。
实施例4
生物吸收性dex水凝胶的制备
dexieme水凝胶的制备和先前报道方法类似(sun等，carbohydratepolymers，第65卷，第273-287页(2006))。将dexieme以不同浓度(例如10％)溶解在含有0.1％(w/w)2-甲基-1-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(irgacure2959，ciba)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将所述混合物转移到模具中(例如，每个模具100μl体积)，从而在光聚合后获得盘状水凝胶。将所得水凝胶从模具中取出并浸入无菌pbs溶液中，然后施用至伤口上。
水凝胶转化效率
使水凝胶前体彼此反应以形成三维网络，并由以下方程估算它们的转化效率：转化效率(％)＝wd/wo×100，其中wd是用蒸馏水洗涤后的干燥水凝胶的重量，wo是初始前体重量。
溶胀试验
如先前报道那样测定水凝胶的溶胀性质(sun等，carbohydratepolymers，第65卷，第273-287页，2006)。溶胀比根据下式计算：溶胀比(％)＝[(ws-wd)/wd]×100，其中wd是干燥水凝胶试样的重量，ws是在室温(25℃)下预定间隔的溶胀水凝胶的重量。当两个相邻间隔之间的溶胀比之间不存在差异时，水凝胶达到平衡溶胀状态。
在一些实施方案中，将水凝胶或组合物(固体或流体状)施用到至少一部分受伤区域上。在一些实施方案中，将预先形成的水凝胶置于受伤区域上。在一个实施方案中，将水凝胶成型为任何形状，包括但不限于卵形、球形、盘状、片状或其他结构。在一个实施方案中，水凝胶的形状取决于伤口形状，并且水凝胶可以是预先成型的或切开的以适合伤口。在一些实施方案中，水凝胶可在受伤部位上光交联。在一些实施方案中，除了受伤区域之外，可施用水凝胶以将水凝胶延伸至未受伤区域上。在一些实施方案中，整个受伤区域可被水凝胶覆盖，其中延伸或不延伸至未受伤区域上。该施用如图7所示。
实施例5
手术程序
根据批准的且符合nih指南的方案(nih出版号85-23，1985年修订)进行动物护理和手术。为了研究我们的水凝胶对损伤皮肤的治疗能力，首先通过三度烧伤在小鼠上形成疤痕皮肤。烧伤的过程如先前报道那样进行(sun等，procnatlacadsciusa，第108卷，第20976-20981页，2011；zhang等，archsurg，第145卷，第259-266页，2010)。简言之，首先麻醉小鼠；然后将背部剃毛并用酒精清洁。然后产生直径1.2cm的三度烧伤。在5周内烧伤的皮肤自己愈合并形成疤痕皮肤。切除全厚度或接近全厚度一半的疤痕皮肤，并用相同尺寸的dexieme水凝胶覆盖伤口，并进一步用适当的敷料覆盖。
为了进一步研究水凝胶对更大伤口的再生能力，在3个月的巴哈马小型猪的背部产生直径2.5cm(或1英寸)的深至皮下组织的伤口。将伤口用相同尺寸的水凝胶覆盖，并进一步用适当的敷料覆盖。为了保护水凝胶和敷料不被损坏或丢失，在身体周围包裹额外的毯子层。
组织学
将dexieme水凝胶外植体用10％甲醛溶液固定24小时，在梯度乙醇(70％至100％)中脱水，包埋在石蜡中，随后将组织切成一系列5微米厚的薄片，进而用苏木精和曙红(h&e)染色或进行皮肤结构的免疫组织化学研究。
使用水凝胶来治疗预先存在的疤痕(图8)。如图8a所示，在小鼠背部产生疤痕皮肤并用水凝胶进行局部治疗。疤痕是由三度烧伤产生的，并且部分切除疤痕皮肤(图8a(i)和(ii)以及图8b)。将水凝胶施用到受伤区域(图8a(iii))，结果示于图8a(iv)中。图8b显示了在三度烧伤5周后伤口愈合的结果。图8c显示了在水凝胶处理后新再生的皮肤。使用苏木精和曙红(h&e)来染色代表性的由伤疤处再生的新皮肤，而虚线描绘了由烧伤产生的疤痕皮肤和在水凝胶处理后新再生的皮肤(图8c(i))。图8c(ii)显示了较高放大倍率的来自疤痕部位的完全再生皮肤。图8c(iii)显示了较高放大倍率的由灼烧引起的且保持不变的疤痕皮肤。再生皮肤显示出皮肤附属物和皮下组织，而由烧伤导致的疤痕皮肤仍然是疤痕皮肤。图8d显示了新再生的皮肤和疤痕皮肤之间的毛囊数量。图8e显示了在皮层(ae13)，伴生层(k75)和外根鞘(ae13/ae15)中表达的新再生毛发。
图9例示了预先存在的疤痕的水凝胶处理。图8d基于由这些实验获得的he照片计算。
图10显示了对完整的之前存在的疤痕进一步进行水凝胶治疗。图10a显示了在小鼠背部产生疤痕皮肤和全伤疤移除，随后进行水凝胶处理。图10a(i)是由烧伤切除的皮肤；而图10a(ii)显示了在除去皮肤疤痕后dexieme的全覆盖；而图10a(iii)和10a(iv)显示了新再生皮肤的两侧。图10b显示了水凝胶再生的完整皮肤结构。图10b(i)显示了由伤疤再生的皮肤，而虚线描绘了来自三个不同位置的新皮肤；图10b(i)、10b(ii)和10b(iii)是三个位置的放大图，其显示了新皮肤的形成。
总之，使用dexieme水凝胶对三度烧伤疤痕进行部分处理和完全处理时均导致新皮肤再生。
为了进一步证明dexieme水凝胶的效率，使用了临床前猪模型。图11显示了猪身上的水凝胶愈合急性深部伤口。图11a显示了外科程序：深至皮下组织的完全皮肤切除，然后水凝胶处理10周。图11b显示了不同时间点的伤口愈合的代表性h&e照片：(i)、(ii)和(iii)是未进行水凝胶处理的伤口，(v)、(vi)和(vii)是进行水凝胶治疗的伤口，(iv)和(viii)分别为对照和水凝胶处理伤口的放大图。图11b(ii)和11b(vi)中的虚线描绘了新形成的组织和正常皮肤之间的伤口界面。与图12中的正常猪皮肤相比，在dexieme水凝胶处理10周后，形成了完整的皮肤结构。
等同方案
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