本发明属于药物化学领域，涉及一种多肽药物偶联物及其制备方法和应用。
背景技术：
恶性肿瘤是目前威胁人类生命和健康的主要疾病之一，它的浸润和转移是其恶性化的特征性标志。肿瘤细胞经血液转移是肿瘤进行远端转移的主要途径,也是目前临床上大多数肿瘤患者治疗失败和死亡的主要因素。
肿瘤转移过程包括肿瘤细胞穿越肿瘤组织的血管内皮细胞从原发部位迁出进入血液循环系统、肿瘤细胞随血液运行以及肿瘤细胞在转移部位的植入三个主要环节组成，转移过程涉及多种细胞黏附分子、细胞外基质以及其他血细胞间的相互作用。研究发现，血小板在肿瘤转移过程中发挥着至关重要的作用，具体作用机制主要包括以下几个方面：①进入血液循环中的肿瘤细胞激活血小板，二者聚集形成瘤栓，从而保护肿瘤细胞免受血液湍流以及免疫系统的攻击；②血小板表面存在可与肿瘤细胞和血管内皮细胞相互黏附的分子，使其既能够与损伤的内皮细胞发生黏附和融合，也能够与肿瘤细胞黏附，可起到促进肿瘤细胞-内皮细胞黏附的桥梁作用，从而帮助肿瘤细胞与转移部位的血管内皮细胞黏附；③当肿瘤细胞在转移部位植入后，血小板可以通过分泌多种生物活性因子直接促进肿瘤细胞生长和繁殖，并促进血管生成，为肿瘤生长提供合适的微环境。其中肿瘤细胞与血小板相互作用形成癌栓(即肿瘤细胞诱发的血小板聚集，tumorcell-inducedplateletaggregation,tcipa)及其分泌蛋白酶破坏微血管进入周围组织是肿瘤血行转移的限速步骤。
因此，抑制血小板的功能将有望成为抑制肿瘤转移的有力手段。目前已有多个抗血小板药物在动物模型上被成功用于抑制肿瘤细胞转移的研究。如血小板缺失小鼠在实验性肿瘤转移模型中的肺转移数显著降低；利用gpiibiiia单克隆抗体能够有效抑制血小板与肿瘤细胞的粘附，从而抑制肿瘤转移；利用血小板adp受体抑制剂替卡格雷在小鼠模型中成功抑制了肿瘤细胞的转移并延长小鼠生存期。然而，通过全身系统性的抑制或者敲除动物体内的血小板存在全身出血性风险，成为限制这类方法被应用于临床的重要因素。
另一方面，动脉粥样硬化(atherosclerosis)是心脑血管疾病共同的病理学基础，也是导致患者死亡的重要原因。病理学研究表明，动脉粥样硬化的发生发展包括脂质浸润、血小板活化、血栓形成、内膜损伤、炎性反应、氧化应激、血管平滑肌细胞激活等。虽然许多学者曾提出关于as发病机制的不同学说，但是血小板活化是正常凝血机制中的关键步骤，也是血管动脉粥样硬化疾病如急性冠脉综合症(acs)病理性血栓形成的重要原因。因此，抗血小板治疗是心、脑血管疾病治疗的一个非常重要的方面。目前可用的口服抗血小板药物包括阿司匹林、p2y12受体拮抗剂氯吡格雷和普拉格雷，它们均能改善动脉粥样硬化患者的缺血症状。然而，由于目前口服抗血小板制剂具有较大的缺血性风险和较高的出血倾向，寻找新的可减少缺血性事件发生和出血危险性的治疗药物势在必行。
因此，如何能够特异性的抑制血小板与肿瘤细胞结合，以及如何使血小板抑制剂特异性的结合到动脉粥样硬化部位，且不影响血小板正常凝血功能，是这两种技术领域的瓶颈问题。我们认为实现现有抗血小板药物的靶向投递，从而实现在肿瘤组织部位或者动脉粥样硬化部位特异性高浓度富集，是解决这一问题的关键。
多肽偶联药物(peptidedrugconjugate,pdc)是一种新型的偶联药物。它是依赖一端约10个氨基酸的肽链作为靶向肿瘤细胞的靶向结构域，另一端是具有生物功能的药物分子，实现药物分子的高效靶向投递，达到肿瘤治疗增效减毒的科学目的。与抗体偶联药物(antibodydrugconjugate,adc)相比，它的分子量更小，不易引起免疫反应；与抗体生产的复杂工艺过程相比，pdc可完全由化学方法合成，效率更高，且更容易进行纯化。因此，pdc已越来越成为下一代靶向药物的发展趋势。基于此，本发明旨在将肿瘤血管靶向多肽(creka)与现有血小板抑制剂偶联到一起形成一种新型多肽药物偶联物，有望实现高效低毒的抑制肿瘤转移和抑制动脉粥样硬化进展的科学目标。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种多肽药物偶联物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多肽药物偶联物，所述多肽药物偶联物包括替卡格雷和creka多肽，所述替卡格雷与creka多肽连接。
本发明提供的多肽药物偶联物，将替卡格雷通过与多肽连接，相比于现有的血小板抑制剂，既能够实现肿瘤组织部位的高浓度富集，也能够在动脉粥样硬化组织高浓度富集，这样就能实现在特定区域抑制血小板的功能而不影响正常血液循环过程中的血小板功能，增加了药物利用度的同时降低了常规血小板抑制剂的出血风险，从而实现更好更安全的肿瘤转移抑制或者预防急性冠脉综合症的功能。
本发明提供的多肽药物偶联物，是一种全新的药物偶联物，替卡格雷常见于单独用药，而制备成多肽类分子联合用药，则没有任何相关研究。
替卡格雷是由美国阿斯利康公司研发并于2011年上市的选择性adp受体-p2y12抑制剂，属于新的化学类别-环戊基三唑嘧啶(cptp)类，是一种新型的血小板聚集抑制剂，选择性拮抗腺苷二磷酸(adp)，抑制adp介导的血小板活化及聚集，其与氯吡格雷的作用机制相似。但不同的是，替卡格雷与血小板p2y12受体之间的相互作用具有可逆性，从而对血栓的形成进行抑制，没有构象改变和信号传递，并且在停药后血液中的血小板功能也随之快速恢复。虽然它能够更好的保护血小板数量和功能，但是临床应用中仍然存在出血风险。creka(cys-arg-glu-lys-ala)多肽，是利用体内肽库筛选鉴别出的一个五肽，它能与肿瘤血管中的凝血血浆蛋白结合，进而定位在肿瘤血管中或者动脉粥样硬化血管中，是药物设计过程中广泛应用的靶向多肽。因此，将替卡格雷与creka多肽结合形成新的多肽药物偶联物，则可以特异性的抑制肿瘤组织内部的血小板功能，或者特异性抑制动脉粥样硬化部位的血小板功能，而不影响正常血液循环过程中的血小板功能，从而实现高效低毒的抑制肿瘤转移或者预防急性冠脉综合症的终极目标。
优选地，所述连接剂包括直链脂肪二酸酐。
优选地，所述直链脂肪二酸酐包括乙二酸酐、丙二酸酐、丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、庚二酸酐、壬二酸酐或癸二酸酐中的任意一种。
本发明所用的链接剂具有良好的生物相容性，相比起具有类似功能纳米载体，安全性更好。
优选地，所述creka多肽为cys-arg-glu-lys-ala组成的五肽。
本发明所用的多肽具有良好的生物相容性，相比起具有类似功能纳米载体，安全性更好，同时具有良好的靶向功能，效果突出。
优选地，本发明所述多肽药物偶联物的结构具体如式i所示：
其中，r为直链脂肪基。
示例性的如：当连接剂为乙二酸酐时，r为ch2-ch2；当连接剂为丙二酸酐时，r为ch2-ch2-ch2。
在本发明中，替卡格雷通过连接剂与多肽连接的方式，应既不影响替卡格雷的血小板抑制功能，也不影响creka多肽的肿瘤以及动脉粥样硬化靶向功能。作为优选，替卡格雷的连接位点选择为自由羟基，creka多肽的连接位点选择为n端的自由氨基；而如果其他位置与连接剂相连，则creka多肽的活性被破坏，从而不具有多肽的功能。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的多肽药物偶联物的制备方法，所述制备方法包括：以多肽固相合成法合成creka多肽，而后将替卡格雷连接至creka多肽上得到所述多肽药物偶联物。
优选地，通过使用连接剂将替卡格雷连接至creka多肽上。
本发明多肽药物偶联物通过多肽固相合成方法制得，制备方法简单，易于工艺放大，相比起单克隆抗体的制备工艺，成本低，效率高。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)以多肽固相合成法合成creka多肽；
(2)将creka多肽与连接剂在催化剂和碱性试剂存在下于溶剂中反应得到产物；
(3)将步骤(2)得到的产物在催化剂和碱性试剂存在下与替卡格雷反应得到多肽药物偶联物粗品，经切割、洗涤、干燥、色谱纯化得到所述多肽药物偶联物。
优选地，步骤(1)中所述固相合成法所用的树脂为2-氯三苯甲基氯树脂。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述的催化剂为o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)、1-羟基苯并三唑(hobt)和n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)。
优选地，所述连接剂、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑和n,n-二异丙基碳二亚胺的质量比为(1-2):1:(1-2):(1-2)，例如可以是1:1:1:1、1.5:1:1.4:1.6、1.8:1:1.3:1.7或2:1:2:2。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述碱性试剂为n,n-二异丙基乙胺(diea)。
优选地，所述碱性试剂与1-羟基苯并三唑的质量比为(1.5-3):1，例如可以是1.5:1、1.8:1、2:1、2.4:1、2.5:1、2.8:1或3:1。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述溶剂为二甲基甲酰胺和甲醇组成的混合溶剂。
优选地，步骤(3)中所述切割为使用切割液将多肽从树脂上切割。
优选地，所述切割液为按质量百分比计由94.5％的三氟乙酸(tfa)、2％的水、2.5％的1,2乙二硫醇(edt)和1％的三异丙基硅烷(tis)所组成的混合溶液。
优选地，所述洗涤为使用乙醚进行洗涤。
作为优选技术方案，本发明提供的制备方法具体包括以下步骤：
(1)树脂溶涨：称取取代度为0.5mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂(2-chlorotritylchlorideresin树脂)，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(dcm)，振荡。
(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入fmoc-ala-oh，再加入diea后加入少量dcm溶解，振荡。然后直接加甲醇反应，目的是封头，最后用二甲基甲酰胺(dmf)和dcm交替清洗6遍。
(3)脱保护：加20％哌啶dmf溶液反应。
(4)检测：抽掉哌啶溶液，取树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，加热，变深蓝色为阳性反应。
(5)洗涤：依次使用dmf洗两次，甲醇洗两次，dmf洗两次。
(6)缩合：称取fmoc-lys(boc)-oh，hbtu，diea，hobt，dic，均用尽量少dmf溶解，加入反应管进行反应。
(7)洗涤：依次用dmf两次，甲醇洗两次，dmf洗两次。
(8)重复三至七步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
(9)连接连接剂：称取连接剂，hbtu，diea，hobt，dic，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，然后用dmf洗两次，甲醇洗两次，dmf洗两次，抽滤洗涤6次。
(10)连接接替卡格雷：称取0.1g替卡格雷，hbtu，diea，hobt，dic，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，然后用dmf洗两次，甲醇洗两次，dmf洗两次，抽滤洗涤6次。
(11)洗涤：使用甲醇洗三次。
(12)从树脂上切割多肽：配制切割液：tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％。将树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温震荡。
(13)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干。即得多肽药物偶联物粗品。
(14)取粗品多肽药物偶联物进行色谱纯化，色谱条件为：流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将高效液相色谱(hplc)用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％，结束比例水5％，乙腈95％，确定目标产物出峰位置。
(15)制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备hplc平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品，最后将纯化后的溶液冻干，既得到多肽药物偶联物，将粉末状的多肽，密封包装，-20℃保存。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的多肽药物偶联物在制备抗肿瘤药物或制备预防急性冠脉综合症药物中的应用。
本发明提供的多肽药物偶联物通过在肿瘤组织部位或者动脉粥样硬化部位特异性的抑制血小板的功能，从而实现了抑制肿瘤组织远端转移或者预防急性冠脉综合症的治疗效果。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的多肽药物偶联物，将替卡格雷通过与多肽连接，相比于现有的血小板抑制剂，既能够实现肿瘤组织部位的高浓度富集，也能够在动脉粥样硬化组织高浓度富集，这样就能实现在特定区域抑制血小板的功能而不影响正常血液循环过程中的血小板功能，增加了药物利用度的同时降低了常规血小板抑制剂的出血风险，从而实现更好更安全的肿瘤转移抑制或者预防急性冠脉综合症的功能。
附图说明
图1是本发明实施例1中多肽药物偶联物的合成方法流程示意图。
图2是本发明实施例2中多肽药物偶联物hplc纯化结果图。
图3是本发明实施例2中多肽药物偶联物质谱检测结果图。
图4是本发明实施例3中多肽药物偶联物抗血小板聚集活性结果曲线图。
图5是本发明实施例4中多肽药物偶联物向结合凝血血栓蛋白激光共聚焦显微镜观察结果图。
图6是本发明实施例5中多肽药物偶联物抑制肿瘤转移结果对比图。
图7是本发明实施例6中多肽药物偶联物靶向动脉粥样硬化斑块荧光结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法制备多肽药物偶联物，具体包括以下步骤：
(1)称取取代度为0.5mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂0.3g，将树脂放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡10min。
(2)将步骤(1)所得树脂溶液通过沙芯抽滤掉溶剂，加入0.037g的fmoc-ala-oh，再加入0.08g的diea后加入少量dcm溶解，振荡2h。然后直接加甲醇(约1ml)反应15min目的是封头，最后用dmf和dcm交替清洗6遍。
(3)将步骤(2)中连接好ala氨基酸的树脂加15ml20％哌啶dmf溶液(15ml/g)反应20min。
(4)将步骤(3)处理后的树脂抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，kcn，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。
(5)在确定步骤(4)反应为阳性以后，将步骤(3)树脂用dmf(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)洗涤两次。
(6)称取0.210gfmoc-lys(boc)-oh，hbtu0.04g，diea0.08g，hobt0.04g，dic0.04g，均用尽量少dmf溶解，加入步骤(5)的反应管，反应40min。
(7)将步骤(6)反应完的树脂用dmf(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)洗涤两次。
(8)重复三至七步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
(9)称取丁二酸酐0.05g，hbtu0.04g，diea0.08g，hobt0.04g，dic0.04g，均用尽量少dmf溶解，加入步骤(8)反应管。反应40min。然后用dmf(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)两次抽滤洗涤6次。
(10)称取0.1g替卡格雷，hbtu0.04g，diea0.08g，hobt0.04g，dic0.04g，均用尽量少dmf溶解，加入步骤(9)反应管。反应40min。然后dm(10ml/g)洗涤两次，甲醇(10ml/g)洗涤两次，dmf(10ml/g)两次抽滤洗涤6次。
(11)将步骤(10)处理后树脂用甲醇(10ml/g)洗涤三次。
(12)配制切割液(10/g)：tfa94.5％；水2％；edt2.5％；tis1％。将步骤(11)树脂装入烧瓶或者离心管中，树脂和切割液比例按照10ml/g，恒温震荡，切割反应120min。
(13)将步骤(12)中裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干。即得多肽药物偶联物粗品。
合成步骤的流程示意图如图1所示。
实施例2
在本实施例中，通过以下方法纯化多肽药物偶联物，具体包括以下步骤：
(1)取粗品多肽药物偶联物放入器皿中。用2-5ml50％的乙腈水溶液溶解。
(2)将步骤(1)溶液用0.45μm滤膜过滤。
(3)分析：取3μl用分析级hplc分析粗品。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将hplc用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度水95％，乙腈5％，结束比例水5％，乙腈95％，确定目标产物出峰位置。
(4)制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备hplc平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品，即制得纯度大于90％的目的产物。
图2为hplc纯化结果的示意图，并将产物进行质谱分析，如图3所示。综合图2和图3可以得出，多肽药物偶联物合成成功，并且成功提纯。
实施例3
在本实施例中，使用影响血小板聚集率的方法考察多肽药物偶联物的抗血小板活性，方法如下：
(1)称取制备好的多肽药物偶联物1mg，加入1ml乙醇制备成1mg/ml的药物溶液；根据偶联物与替卡格雷分子量计算出等效浓度的替卡格雷用量，称取替卡格雷粉末0.42mg，加入1ml乙醇并充分溶解。
(2)将步骤(1)中的偶联物以及替卡格雷溶液按照1:2比例倍比稀释6次，即对应的偶联物药物浓度为0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，0.015625mg/ml，备用。
(3)取猪静脉血20ml，以3.8％的枸橼酸钠9:1抗凝收集于塑料离心管中。将血液与抗凝剂充分混匀。在室温下以200g离心10min，吸出上层米黄色悬液即得富血小板血浆(prp)，余下以2000g离心10min，取上清液，得贫血小板血浆(ppp)。
(4)按born氏比浊法原理采用mpg-3e型多功能双通道血液凝聚仪。取prp200μl于比浊管中，分别加入不同浓度的药液或pbs10μl，在预热孔中37℃温育3min。然后在磁棒搅拌下分别加入诱导剂adp(60μmol/l)，以ppp调零检测5min内血小板最大聚集率。
测试结果如图4所示，如图4结果可知，多肽药物偶联物与替卡格雷具有相似的抗血小板活性。
实施例4
在本实施例中，考察多肽药物偶联物的凝血血栓蛋白的靶向功能，方法如下：
(1)称取制备好的偶联物0.5mg，加入0.5mlpbs，充分溶解。
(2)称取马来酰亚胺修饰的罗丹明染料1mg，加入1mlpbs，充分溶解后，吸取0.5ml加入到步骤(1)制备的溶液中，避光过夜反应。
(3)取5ml猪静脉血，以3.8％的枸橼酸钠9:1抗凝收集于塑料离心管中。3000g离心10min，取上清。
(4)取步骤(3)离心上清1ml，加入0.4m的cacl2溶液100μl，0.1u/ml的凝血酶100μl，吸打混匀后涂于载玻片上，4℃过夜孵育。
(5)吸取步骤(2)制备的反应溶液以及罗丹明染料溶液各200μl，均匀涂在步骤(4)制备好的载玻片上，避光孵育10min。
(6)使用pbs溶液冲洗步骤(5)孵育后的载玻片6次。
(7)盖上盖玻片，在激光共聚焦显微镜下观察两组破片上的罗丹明荧光情况。
结果如图5所示，由图5与对照组对比可知，多肽药物偶联物的凝血血栓蛋白的靶向功能良好。
实施例5
在本实施例中，考察多肽药物偶联物的抑制肿瘤转移能力，方法如下：
(1)将实施例1制备的多肽药物偶联物，通过尾静脉注射入裸鼠转移性乳腺癌4t1模型中，每2天给药1次，设置3个实验组，即生理盐水组，替卡格雷组，多肽药物偶联物组，偶联物与替卡格雷组的有效剂量均为10mg/kg。
结果如图6所示，由图6可知，与生理盐水组相比，替卡格雷组与偶联物组均能有效抑制4t1肿瘤的自发性肺部转移，但是偶联物组的抑制效率要明显高于替卡格雷药物组，说明本发明的多肽药物偶联物能够大大提高原有药物的抗肿瘤转移效果。
实施例6
在本实施例中，考察多肽药物偶联物的动脉粥样硬化斑块靶向能力，方法如下：
(1)通过高脂饮食喂养apoe基因敲除小鼠的方式，制备动脉粥样硬化动物模型；
(2)称取马来酰亚胺修饰的fitc染料1mg，加入1mlpbs，充分溶解后，吸取0.5ml加入到1mg/ml的多肽药物偶联物溶液中，避光过夜反应。
(3)将步骤(2)制备好的溶液通过尾静脉注射入造模完成的小鼠，并设置染料对照组，给药3h后，处死动物取对应组织进行成像。
结果如图7所示，由图7可知，与染料对照组相比，染料标记的多肽药物偶联物组在小鼠的主动脉中具有更多的荧光信号，表明多肽药物偶联物具有很好的动脉粥样硬化靶向作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的多肽药物偶联物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。