本发明属于微生物技术领域，主要涉及乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液及其制备方法和应用。
背景技术：
仔猪大肠杆菌性腹泻是由肠毒素型大肠杆菌引起的一种急性、死亡率较高的传染病，主要危害新生断奶仔猪，导致仔猪免疫力、生长性能下降、腹泻频发不止，死亡率增高，往往给养猪业带来了巨大的经济损失。该病的治疗主要依赖抗生素，但长期滥用抗生素造成病原菌耐药性增强。因此，在现代养猪业中，预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻是亟待解决而且必须解决的问题。
在我国，应用中药治疗疾病已有几千年的历史，中药含有很多活性成分，具有抗菌以及提高免疫力的作用，中草药经过几千年的积累与传承，具有很高的应用价值，采用有关益生菌在体外作用中药，以提高中药疗效，利用微生物的生长代谢活动增进中药有效成分的释放，不仅可以提高中药药效，还可以增强机体免疫力。中草药含有各种有效成分，对病原体有直接抑制或杀灭作用；但中草药自身成分复杂，目前使用方法大多局限于传统炮制，对药物的有效成分利用率低。
罗伊氏乳杆菌是目前已报道的几乎可存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸杆菌，常栖息于人和动物的肠道系统中，对人和动物无害，具有良好的生物相容性；它代谢甘油产生一种特殊的抑菌物质--罗伊氏素(reuterin)，其主要成分是3-羟基丙醛(3-hpa)的单体、水合物和环化二聚体；罗伊氏乳杆菌是具有改善过敏体质、预防过敏反复发作，以及调节肠道功能的益生菌；应用领域主要在保健食品、功能型固体饮料、各种营养食品等，剂型有颗粒剂、胶囊、片剂等。
技术实现要素：
本发明目的是为解决预防和治疗仔猪大肠杆菌性腹泻而滥用抗生素的问题，而提供一种乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液。
乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液，它是由下述方法制备的：
1）乌梅生药1000g，加入5倍体积蒸馏水，煎煮30-50分钟，取出药液后，药渣再加入5倍体积蒸馏水煎煮30-50分钟，反复3次；将3次所得药液过滤、浓缩，至1000ml，得乌梅水提液；
2）将步骤1）水提液加入10.00g牛肉膏、10.00g蛋白胨（peptone）、20.00g葡萄糖（glucose）、0.20gmgso4·7h2o、5.00g酵母粉（yeastpowder）、2.00gc6h17n3o7、5.00gch3coona、1.00mltween-80、2.00gk2hpo4·3h2o、0.05gmnso4·h2o，搅拌至完全溶解，倒入发酵罐中，灭菌；
3）灭菌后，加入乌梅水提液体积的2%的罗伊氏乳杆菌菌液，恒温发酵，条件为：175-185r/min，40-45℃，10-14h；即得乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液；
步骤2）中所述的灭菌，为115℃条件下高压灭菌20min；
步骤3）中所述的发酵，条件为：180r/min，42℃，12h；
步骤1）中所述的煎煮时间为40min。
所述的乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液在治疗仔猪腹泻中的应用。
本发明提供了乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液，它是由下述方法制备的：取乌梅生药称量1000g，加入5倍体积蒸馏水，煎煮30-50分钟，取出药液后，药渣再加入5倍体积蒸馏水煎煮30-50分钟，反复3次；将3次所得药液过滤、浓缩，至1000ml，得乌梅水提液；将水提液加入10.00g牛肉膏、10.00g蛋白胨（peptone）、20.00g葡萄糖（glucose）、0.20gmgso4·7h2o、5.00g酵母粉（yeastpowder）、2.00gc6h17n3o7、5.00gch3coona、1.00mltween-80、2.00gk2hpo4·3h2o、0.05gmnso4·h2o，搅拌至完全溶解，倒入发酵罐中，灭菌；灭菌后，加入乌梅水提液体积的2%的罗伊氏乳杆菌菌液，恒温发酵，条件为：175-185r/min，40-45℃，10-14h；即得乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液；本发明在筛选大量对大肠杆菌有抑制作用的单味中草药的基础上，研制出一种中药与益生菌相结合的新型复合制剂，发酵后总菌数含量为8×109cfu/ml；体外抑制大肠杆菌效果良好；体内试验表明连续4天灌服乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液（5ml/kg）对大肠杆菌引起的仔猪腹泻具有较好的治疗作用，并且能够增强仔猪生长性能，提高机体的免疫力和抗病能力。
附图说明
图1仔猪小肠he染色病理切片结果，a:乌梅水提液组；b:乌梅发酵液组；c:罗伊氏乳杆菌菌液组；d:大肠杆菌组；e:空白对照组。
具体实施方式
实施例1十二种单味中草药体外拮抗大肠杆菌实验
1、中药药液制备
板蓝根、五倍子、黄连、蒲公英、乌梅、甘草、白术、诃子、金银花、黄柏、败酱草、紫花地丁12种中药；分别取中药称量500g，加入5倍体积蒸馏水进行煎煮40分钟，取出药液后，药渣再加入5倍体积蒸馏水煎煮40分钟，反复3次；将3次所得药液过滤后放入80℃烘干箱内，将药物浓缩成1.00g/ml药液，即每ml相当于生药1g。
2、抑菌实验
在无菌操作台内把已经高压灭菌过的lb固体营养液倒入平板中；待其冷凝，吸取100μl的浓度为105cfu/ml的大肠杆菌种子液，均匀的涂布在冷凝的培养液平板上；打孔后将浓缩至1g/ml中药液滴入平板孔内；将装有药液的平板放于37℃的温箱中18到24h；取出后并测量抑菌环的直径，取平均值后记录数据。
实验结果如表1所示，结果表明，乌梅水提液对大肠杆菌生长的抑制作用最显著。
实施例2乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液的制备及抑菌实验
1、乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液的制备
取乌梅生药称量1000g，加入5倍体积蒸馏水进行煎煮40分钟，取出药液后，药渣再加入5倍体积蒸馏水煎煮40分钟，反复3次；将3次所得药液过滤，放入80℃烘干箱内，将药物浓缩至1000ml，即1.00g/ml药液；将10.00g牛肉膏、10.00g蛋白胨（peptone）、20.00g葡萄糖（glucose）、0.20gmgso4·7h2o、5.00g酵母粉（yeastpowder）、2.00gc6h17n3o7、5.00gch3coona、1.00mltween-80、2.00gk2hpo4·3h2o、0.05gmnso4·h2o分别加入装有1000ml的乌梅水提液中搅拌完全溶解，将液体倒入2.5l发酵罐中，115℃条件下高压灭菌20min；灭菌后发酵罐加入2%罗伊氏乳杆菌菌液，180r/min，42℃，发酵12h，即得乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液。
经检验发酵后总菌数含量为8×109cfu/ml。
2、体外抑制大肠杆菌生长实验
在无菌操作台内把已经高压灭菌过的lb固体营养液倒入平板中；待其冷凝，吸取100μl的浓度为105cfu/ml的大肠杆菌种子液，均匀的涂布在冷凝的培养液平板上；打孔后将乌梅水提液，乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液，与罗伊氏乳杆菌上清液各取100μl滴入平板孔内；将装有药液的平板放于37℃的温箱中18到24h；取出后并测量抑菌环的直径，取平均值后记录数据。
实验结果如表2所示，结果表明乌梅水提液在与罗伊氏乳杆菌共培养后抑菌效果明显提升，抑菌直径能够达到25±0.1mm。
实施例3乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液对仔猪大肠杆菌性腹泻的治疗研究
1、材料与方法
按照实施例2的方法制备乌梅水提液、乌梅与罗伊氏乳杆菌发酵液（简称乌梅发酵液）。
将28日龄的生长状况相同的同一批仔猪50头，平均分成5组，分别为乌梅水提液组、乌梅发酵液组、罗伊氏乳杆菌菌液组、大肠杆菌组和空白对照组，每组10头，每头仔猪都灌喂5ml的浓度为6×109cfu/ml的大肠杆菌菌液，随后观察其腹泻情况；待全部腹泻后，进行4天相应药物的灌喂；攻菌和喂药的分组见下表3；待灌喂药物后每两天进行采食量，体重，腹泻率等指标的测量，在14天清晨采血进行血常规及血液生化检测；分离血清elisa方法检测血清中igg、il-2、ifn-γ的含量；宰杀各组仔猪，检测肝脏超氧化物歧化酶（sod）含量；分别采集仔猪的肝脏、脾脏、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结，称量湿重，计算免疫器官指数，公式为：免疫器官指数=器官湿重/胴体重；分离猪小肠，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，he染色，光镜下观察病理学改变。用spss17.0处理数据，以平均数±标准差表示,采用方差分析进行差异显著性分析。
2、实验结果
1）第14天生长性能指标检测结果
实验结果见表4，大肠杆菌组由于大肠杆菌在肠道内定植，破坏肠绒毛，引起仔猪腹泻，脱水，采食量下降，体重增加缓慢；乌梅水提液组和罗伊氏乳杆菌菌液组仔猪采食量、日增重与大肠杆菌组相比明显增加，腹泻率为30%，说明乌梅水提液和罗伊氏乳杆菌对仔猪腹泻有一定作用；乌梅发酵液组仔猪料重比与空白对照组相近，灌喂乌梅发酵液两天后仔猪腹泻症状消失；说明乌梅发酵液治疗仔猪腹泻效果显著，并能提高仔猪生长性能。
2）免疫器官指数检测结果
免疫器官相对重量增加，说明机体细胞的免疫机能增强，实验结果显示（表5），结果显示大肠杆菌组肝脏显著重于其他组，由于肠毒素型大肠杆菌释放的肠毒素具有广泛性损伤，乌梅水提液组、乌梅发酵液组、罗伊氏乳杆菌菌液组仔猪脾脏指数、下颌淋巴结指数、腹股沟淋巴结指数明显升高，并且乌梅发酵液组与其他组相比差异显著，说明乌梅发酵液能够增强仔猪免疫力。但是大肠杆菌组肝脏指数高于其他组原因可能是大肠杆菌感染使肝脏代偿性肥大。
3）血常规指标检测结果
实验结果见表6，白细胞计数(wbc)过高常见于急性化脓性细菌感染；红细胞计数（rbc）异常常见于某些肾病或心肺功能欠佳；血红蛋白（hgb）异常常见于红细胞增多症；红细胞压积（hct）异常常见于脱水，休克等；血小板（plt）异常常见于慢性感染，急性出血等；血小板压积（pct）异常常见于缺铁，血小板生成异常等。结果显示，乌梅水提液组、罗伊氏乳杆菌菌液组、大肠杆菌组wbc，plt异常，代表机体发生感染，由于大肠杆菌分泌的毒素，造成肠道出血，腹泻造成严重脱水，有炎症发生，造成指标异常。乌梅发酵液组乌梅发酵液治疗组各项指标正常，治疗效果良好。
（参考范围：wbc：11.0-22.0；rbc：5.00-9.50；hgb：9-16；hct：32.0-50.0；plt：200-700；pct：0.01-99.9）
4）血液生化六项检测结果
丙氨酸氨基转移酶（alt），碱性磷酸酶（alkp）是肝脏检测的指标，肝脏受损时指标检测指数会发生异常；肌肝（crea），尿素（urea）是肾脏检测指标，当发生肝病，脱水，肾病，或者尿道阻塞等指标会发生异常；总蛋白（tp）是全身性指标，代表动物体内蛋白质含量，当脱水，肝肾病疾病均会使指标异常；血糖（glu）是血中葡萄糖检测指标，一般见于糖尿病，酸中毒，癫痫，抽搐，肾上腺皮质功能亢进，甲状腺功能亢进及濒死期；降低则见于胰岛素分泌增多，肾上腺皮质功能不全，甲状腺功能减退等。结果显示（表7），乌梅水提液组、罗伊氏乳杆菌菌液组、大肠杆菌组alt和tp指标异常，说明动物肝脏受损。大肠杆菌组alt升高、glu下降、tp升高，说明仔猪由于腹泻高度脱水，肾脏和肝脏功能受损。乌梅发酵液组乌梅发酵液治疗组各项指标正常，说明动物状态良好，治疗效果显著。
（参考范围：alt:9-43；alkp：92-294；crea：44-186；glu：4.72-8.89；tp：60-80；urea：2.1-10.7）
5）肝脏超氧化物歧化酶（sod）检测结果
抗氧化系统是动物在进化过程中形成的一个完整而复杂的系统。其抗氧化能力的强弱，与健康存在着密切的关系。sod的活力可在一定程度上反映出中药清除体内自由基的水平，结果显示，乌梅发酵液组超氧化物歧化酶（sod）的含量显著高于大肠杆菌组和空白对照组，说明乌梅发酵液可以刺激体内抗氧化酶类系统，提高动物机体的免疫力和抗病能力（表8）。
6）血清中igg、il-2、ifn-γ的含量
igg是动物血清中含量最高，介导体液免疫的主要抗体，igg的含量在组间差异不大，说明发酵液对体液免疫影响不大；il-2可以刺激t淋巴细胞增殖，刺激ctl的增殖与分化并杀灭微生物，ifn-γ激活细胞毒性t淋巴细胞，刺激有核细胞表达mhc分子，从而促进其杀伤感染内病原体细胞。乌梅水提液组、乌梅发酵液组、罗伊氏乳杆菌菌液组仔猪igg升高，但与大肠杆菌组相比差异不显著。乌梅发酵液组il-2，ifn-γ显著高于大肠杆菌组、空白对照组，说明乌梅发酵液可以诱导机体产生il-2，ifn-γ细胞因子，促进免疫细胞活化。因此，发酵液不仅对仔猪腹泻治疗有明显的效果，还能够提高机体免疫力（表9）。
7）仔猪小肠he染色病理切片结果
各组仔猪小肠病理变化结果如图1所示，空白对照组小肠粘膜结构基本正常，粘膜上皮及腺体形态正常，未见明显病变；大肠杆菌组小肠表层部分粘膜上皮坏死脱落，粘膜固有层间质大量炎症细胞浸润，并有大量出血；乌梅水提液组、罗伊氏乳杆菌菌液组仔猪小肠肠粘膜上皮及腺体结构基本完整，固有层腺体间质中度炎症细胞浸润；乌梅发酵液组肠绒毛排列整齐，结构完整，无脱落破损，固有层腺体间质轻度炎症细胞浸润；实验表明，乌梅发酵液能够减轻大肠杆菌对长绒毛的损害。
由上述结果可知：乌梅与罗伊氏乳杆菌共发酵产物在体外对大肠杆菌具有较强的抑菌作用；体内试验表明连续4天灌服乌梅与罗伊氏乳杆菌共发酵产物（5ml/kg）对大肠杆菌引起的仔猪腹泻具有较好的治疗作用，并且能够增强仔猪生长性能，提高机体的免疫力和抗病能力。罗伊氏乳杆菌允许添加到食品中，因此，本发明既能治疗仔猪腹泻，提高仔猪生长性能，又能避免抗生素治疗的副作用和耐药性，其效果显著，生产成本低，具有广阔的应用和推广价值。