包裹质粒DNA的阳离子脂质体复合物的制作方法

本发明涉及肿瘤的基因治疗
技术领域：
，尤其涉及一种包裹质粒dna的阳离子脂质体复合物及其制备方法。
背景技术：
：细胞分裂是机体发育和组织修复的正常过程。母细胞分裂成两个相等的子细胞，这些子细胞可能进一步分化，装配新的组织，或者取代老化的细胞或受到伤害的组织。当机体不再需要更多的细胞时，健康细胞通过接触抑制、细胞因子、生长激素调控等手段，不再分裂。当健康细胞产生一系列基因突变，细胞分裂不再受到机体的调控，从而形成肿瘤细胞。肿瘤细胞是不断分裂的细胞，生成瘤块，并能通过血液向远端的组织进行转移。一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。恶性肿瘤具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个不断产生基因突变、受多因子影响的复杂过程。根据中国国家肿瘤防治中心的统计，癌症(恶性肿瘤)也是目前中国疾病导致死亡的头号杀手。其中，又以肺癌的发病率最高。每年在中国有60万患者死于肺癌，是十大癌症死亡原因之首，且有逐年增加的趋势。根据2010年美国癌症协会的报告，癌症是美国仅次于心脏病致死的主要原因。约31％的男性和26％的女性死于肺癌或支气管癌。癌症治疗的常规手段包括手术，化疗，放疗。理论上，以手术完全移除肿瘤细胞，癌症是可以被治愈的。对早期或较早期实体肿瘤来说，手术切除仍然是首选的治疗方法。化疗和放疗均显示出较大的副作用。在过去以传统放化疗和手术治疗为主要治疗手段的几十年中，在改善长期结果和总体生存率方面取得的进展相对较小，特别是病人诊断出肿瘤时往往已是中晚期，患者5年生存率很低。概念上迫切需要新方法，即有针对性的药物。2010年美国药物和食品管理局(fda)批准的第一个细胞免疫的肿瘤治疗技术(provenge)，拉开了肿瘤免疫治疗的大幕。2014年至2017年有5个针对pd-1/pd-l1免疫检测靶点的抗体药物获批上市。以car-t为代表的细胞免疫疗法目前也已经有两款上市，即诺华的kymriah以及kite公司的yescarta。这些药物或治疗技术在肿瘤治疗的长效性和延长患者生存率方面表现优异，并且副作用降低，pd-1/pd-l1抗体成为目前最好的抗癌药，标志着在细胞、分子和机体各个层面的免疫治疗正式成为肿瘤治疗的主角，癌症治疗已进入免疫治疗时代。肿瘤免疫治疗未来的发展方向不仅是从根本上替代化疗和放疗，甚至可能会替代一部分手术，拥有广阔的前景。现代肿瘤免疫治疗最重要发现是细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocyte，ctl)能够抑制肿瘤生长，而且是杀死肿瘤细胞的主要力量。无论是基于细胞、免疫抑制检查点、增强免疫细胞因子和溶瘤病毒免疫治疗的方案，都是围绕ctl的扩增和调控设计的，主要依仗携带cd8+、cd4+等表面抗原的t淋巴细胞对肿瘤细胞的识别和清除。t淋巴细胞表面抗体识别多肽抗原，包括肿瘤抗原(neoantigen)。肿瘤抗原是专一地反映肿瘤细胞中基因突变产生的变异多肽，因此针对肿瘤抗原产生的t淋巴细胞具有非常高的肿瘤专一性，毒副作用小。癌症免疫周期包括几个连续的步骤：癌细胞产生的肿瘤抗原被树突细胞捕获。树突细胞将主要组织相容性复合物(mhc)分子中的捕获的抗原呈递给t淋巴细胞，引发和激活针对特异肿瘤抗原的ctl应答。在趋化因子梯度引导下，活化的ctl流入并浸润肿瘤组织。通过t细胞受体(tcr)和新抗原mhc复合物之间的相互作用，ctl利用表面抗体特异识别、结合并杀死具有可识别抗原的肿瘤细胞。少数肿瘤患者发生自愈的现象，证实人体自身的免疫系统可以识别并杀伤肿瘤细胞，浸润肿瘤的免疫细胞(til)是病理上的直接证据。起作用的一类免疫细胞是效应细胞，直接对肿瘤产生杀伤或抑制。很多细胞都加入这个过程，如nk细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜酸性白细胞等，但是作用最大的还是ctl，特别是cd8+t淋巴细胞。还有一类是调节细胞，它不直接损伤肿瘤，而是调节控制效应细胞的功能。免疫系统识别两类抗原：抗体识别的抗原和t细胞识别的抗原。过去的研究发现了许多抗体识别的肿瘤抗原，如cd19，ca-125等，大都不是肿瘤特异的。例如，cd19是正常b细胞抗原，但在b细胞衍生的肿瘤细胞中高表达，使其成为car-t疗法治疗急性淋巴母细胞白血病的靶点之一，b细胞急性淋巴细胞白血病患者的响应率达到惊人的82.5％[1]。2017年8月，tisagenlecleucel(cd19-car-t，kymriah)获批上市，成为第一个fda批准的细胞免疫治疗方法。改造后的t淋巴细胞表达嵌合受体，靶向结合b细胞表面的cd19蛋白质，因此，cd19-car-t治疗是以牺牲正常b细胞为代价，有很大的副作用和治疗风险。t细胞识别的抗原为多肽，可以是高表达的正常胚胎蛋白、分化相关因子和因突变获得的肿瘤异常蛋白。前二者在肿瘤细胞中特征性高表达或在机体早期发育过程中曾出现过的抗原。肿瘤发生过程因体细胞基因突变而产生，伴随有肿瘤变异蛋白的生成。常与肿瘤发生有关的基因包括pole、p53、ras、egfr等，突变产生变异多肽抗原，可以被t细胞识别。这些突变具有很强的肿瘤专一性，成为免疫治疗中靶向识别的目标。如使用rna测序数据所鉴定的，癌症病变中cd8+t细胞数量在具有高突变率的肿瘤中较高[2]。肿瘤免疫治疗的基本设计思路归纳起来有两个途径：一个是增强免疫反应，另一个是对肿瘤免疫逃逸机制的纠正。增强免疫反应代表了大部分现有免疫治疗的方法，比如il-2，抗cd19肿瘤疫苗，car-t治疗，抗ctla-4，增强dc细胞对肿瘤抗原的提呈，表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)的溶瘤病毒等。但增强免疫反应的治疗方法，一般是通过血液进行全身性给药，可能产生针对正常细胞和组织的免疫杀伤，很多时候是弊大于利，只在很少癌症类型中有好处。对肿瘤免疫逃逸机制的纠正，比如对pd-1/pd-l1免疫检查点的纠正，激活ctl对肿瘤细胞的特异攻击，肿瘤治疗免疫反应是高度特异的，不损伤或很少损伤自身组织。这种纠正方法依赖于机体本身已经发生的、针对肿瘤的免疫反应，因此患者响应率一般较低。pd-1/pd-l1抗体治疗对很多种肿瘤有效，但是它只对每种癌症的一小部分病人有效果，例如仅对大约30％的肺癌有疗效。如果病人的肿瘤组织为pd-l1阳性，有效率进一步提高到50％左右。对何杰金淋巴瘤有效率接近90％，黑色素瘤有效率达40-50％，膀胱癌50％，消化道肿瘤如胃癌，食管癌和肝癌的有效率也在30％以下。治疗有响应的病人，抗pd-1治疗可以明显提高存活时间，但并不是对所有晚期肿瘤病人都有效，并且随着抗pd-1治疗的开展，也有了肿瘤复发的报道。“下一个最有效免疫检查点靶点是什么？”，是肿瘤免疫治疗领域问得最多的一个问题，也正是限制这种治疗方法的主要问题之一。抗免疫抑制检查点疗法，依赖于机体已有肿瘤抗原特异的ctls对肿瘤细胞的识别，对异质性肿瘤治疗需要多克隆的肿瘤特异ctls。因此针对免疫抑制检查点实施的抗肿瘤治疗方法，前体是机体已经产生识别肿瘤抗原的特殊ctls。肿瘤免疫逃逸机制机体的免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答，对极少数幸运患者的肿瘤有治愈的功效，但是对绝大多数肿瘤患者而言，肿瘤仍能在机体内进行生长，转移，如果没有有效干预，最终导致死亡，表明肿瘤能够逃避宿主免疫系统的攻击，或是通过某种机制使机体不能产生有效的抗肿瘤免疫应答。肿瘤免疫逃逸(tumorimmuneescape)是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些“异己”细胞，抵御肿瘤的发生发展。然而，恶变细胞在某些情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤。也就是说：一方面，机体可通过先天性免疫和获得性免疫抵抗肿瘤的发生；另一方面，肿瘤细胞可通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。肿瘤的发生与否及转归如何都取决于这两方面的总体作用。肿瘤免疫逃逸机制呈多样化，包括：一、肿瘤抗原的缺陷和抗原调变。肿瘤抗原与正常细胞表面蛋白的差异很小，由体细胞突变产生，甚至仅个别氨基酸不同，且表达量较低，故其免疫原性非常弱，难以诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。免疫原性较强的肿瘤细胞可以激活机体有效的免疫识别应答，被先期消灭，而免疫原性相对较弱的肿瘤则能逃脱免疫系统的监视而繁殖扩增，一些肿瘤细胞能表达大量肿瘤癌胚抗原，多系机体胚胎期的正常成分，机体对其存在先天性免疫耐受，同样也不能有效激发机体免疫应答。经过对不断突变肿瘤的选择，存活下来的肿瘤的免疫原性越来越弱，以致最终导致产生免疫逃逸。二、mhc抗原的表达异常。肿瘤细胞mhc-i类分子的低表达或缺失，致使肿瘤细胞内抗原无法提呈，影响肿瘤特异性ctl活化和抗肿瘤效应；另一方面，nk细胞表面kir识别肿瘤细胞表面异常表达的非经典mhc-ⅰ类分子(如hla-g、hla-e等)，从而启动抑制性信号，抑制nk细胞的细胞毒作用。三、肿瘤细胞抗原的“封闭”或“覆盖”。肿瘤抗原可被某些非特异性成分(如唾液粘蛋白等)覆盖，或被封闭性因子(blockingfactor)封闭”，从而干扰免疫细胞对肿瘤抗原的识别。四、肿瘤抗原的加工、处理和提呈障碍。某些肿瘤细胞(如小细胞肺癌细胞)不能将mhc-i类分子-抗原肽复合物转移至癌细胞表面；某些肿瘤细胞内lmp-1、lmp-2和tap表达低下，均导致肿瘤抗原的加工、处理和提呈障碍，使肿瘤细胞逃逸机体免疫机制的攻击。宿主在外周血获得的树突细胞(dendriticcell)往往对抗原提呈功能良好，将骨髓细胞与gm-csf、il-4、tnf-a等在体外共同培养，扩增的dc具有抗原提呈能力，表明肿瘤患者机体内树突细胞在从骨髓释放到体内的成熟过程中受到了宿主体内某些因素的干扰，削弱其对肿瘤抗原的提呈作用。要消除机体内形成的肿瘤仅靠识别肿瘤抗原是不够的。成型的肿瘤具有复杂的组织架构，不仅由肿瘤细胞组成，还包括基质细胞，炎症细胞，血管系统和细胞外基质(ecm)，所有这些总和定义为肿瘤微环境(tumormicroenvironment,tme)。tme往往为肿瘤细胞提供更适合免疫抑制逃逸的温床。肿瘤免疫治疗需要针对肿瘤微环境，也就是局部化的治疗。肿瘤病人，也包括晚期的病人，免疫反应全身衰竭的情况是很罕见的。就算是终期病人，血中或者骨髓中都能分离到特异识别肿瘤的淋巴细胞。也就是说，在肿瘤微环境里，不是所有的淋巴细胞都是有问题的。五、肿瘤细胞协同分子激活的免疫抑制。pd-1属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，在t细胞和b细胞前体上表达。肿瘤细胞表面pd-l1[3]与t淋巴细胞表面pd-1结合，诱导免疫抑制反应的机制已得到确认[4-6]，是肿瘤免疫抑制应答的关键检查点之一。抗pd-1抗体重新激活cd8+t细胞裂解癌细胞[7]。pd-1和ctla4抗体的治疗效果互补，抗ctla4治疗导致增强的ctl依赖性免疫反应[8]。使用抗pd-1和抗ctla4治剂的联合肿瘤治疗已经成为抗免疫抑制检查点治疗的重要方向。pd-1/pd-l1抑制仅仅是众多免疫抑制检查点中的一个。肿瘤细胞表达fasl，而活化的ctl表达fas，二者结合可介导肿瘤抗原特异性ctl凋亡，使肿瘤逃逸ctl的特异性杀伤效应。tim3在cd4+辅助t细胞1(th1)和cd8+细胞毒性t细胞中上调，参与协条免疫抑制作用。在由其配体galectin-9激活后，tim3抑制效应t细胞的活性，使其成为下一个肿瘤免疫治疗的热门靶点之一。六、肿瘤细胞分泌免疫抑制因子。近期发现，肿瘤细胞分泌il-10、tgf-β、vegf和pge2等细胞因子，可抑制dc前体细胞发育，阻止其向成熟dc分化。dc(尤其在肿瘤浸润部位的dc)表达mhc-ⅱ类分子和b7。在上述因子作用下，dc能诱导til对肿瘤抗原的耐受。此外这些因子还下调其他免疫细胞功能，有利于肿瘤细胞逃逸免疫攻击。七、til的异常或信号转导异常。在诱导活化til治疗肿瘤时，部分til不能被活化，其表面信号转导分子(如src、syk家族的ptk)、il-2和il-2r等表达降低。肿瘤的免疫逃逸是一种动态和复杂的过程，其中不同的机制彼此制约，以保护肿瘤的生存，避免来自免疫系统的识别或杀伤。tme是免疫抑制和免疫增强相互博弈的地方，但肿瘤发生时，免疫抑制通常占据主导地位，tme的形成更有利肿瘤。tme保护肿瘤免疫逃逸的机制还不完全清楚，随着对tme和免疫治疗认识的深入，会出现更多针对tme以及提高目前免疫治疗疗效的方法。肿瘤基因治疗的原理基因治疗是指将目的基因导入至细胞内，依照目的基因序列在细胞中转译并转录出功能性蛋白质，从而修补或置换患者病变细胞内的致病基因，使其恢复正常功能。肿瘤基因治疗的原理是将有抑制癌细胞作用的功能性基因，利用基因运送载体导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞表达出活性基因产物而获得特定功能，继而执行或介导对肿瘤细胞的杀伤或抑制作用，达到治疗目的。肿瘤基因治疗涉及基因运送载体、功能基因及肿瘤受体细胞三方面。对目标细胞产生高效转染且毒性小的基因运送载体是基因治疗的首要条件。对不同的目的基因和受体细胞，基因运送载体的效率与用药方法也迥异。常用作肿瘤基因治疗的基因运送载体可以分类为病毒类和非病毒类载体。常用的病毒转基因运送载体有逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒以及溶瘤病毒等。病毒载体是利用基因重组技术将待表达的目的基因整合到去除了复制关键因子的病毒核酸中，经病毒蛋白质包裹后，形成有感染活性的病毒颗粒，用以感染受体细胞。病毒载体可高效地把目的基因专一地输入具有适配受体的细胞内，然而，机体免疫对病毒的识别和高效清除[9]，注定了病毒载体的使用只能是局部注入肿瘤组织(intratumoral)或体外的(exvivo)的方式进行。运送大分子dna的非病毒载体以脂质体为主，这类脂质体载体利用一些不带电性或极性的磷脂类，以不同比例组合形成微脂粒，再将核酸与这些微脂粒混合，将dna包裹其中，通过胞饮机制或其他机制进入细胞。适用于肿瘤基因治疗的脂质体为阳离子型脂质体，其优点为①相对于正常细胞或不分裂细胞，对肿瘤细胞有较高的转染率；②免疫原性低，可以通过血液进行全身转运和重复用药。主要缺点是对肿瘤细胞的体内转染效率低，半衰期短。抗癌基因的选择是肿瘤基因疗法的另一关键所在。迄今为止，肿瘤基因治疗所用的治疗基因以抑制肿瘤细胞生长的抑癌基因为主，如抑癌基因rb、p53、p16、bax、fus1等导入肿瘤细胞，表达的蛋白质产物诱发肿瘤细胞“凋亡”。这类研究已从实验研究过渡到临床试验阶段，其中p53基因的部分临床试验结果显示了其潜力。但应用重组腺病毒携带p53等抑瘤基因的临床试验结果并未达到预期的治疗效果，宣告病毒载体携带抑瘤基因策略的失败。进行中的dotap:胆固醇脂质体携带抑瘤基因fus1的临床二期试验加入了与化疗药物erlotinib的组合，以增强对肿瘤的疗效(见临床试验：fus1-nanoparticlesanderlotinibinstageivlungcancer，nct01455389)。dotap:卵磷脂脂质体(cationicdotap:lecthicinliposome，cdll)的包裹效率高于dotap:胆固醇脂质体(cationicdotap:cholesterolliposome，cdcl)，包裹抑癌基因bax的脂质体复合物仍然不足以达到治愈肿瘤的目的(专利cn102133404b)。实验结果显示，对肿瘤细胞生长直接进行抑制的策略可以延缓肿瘤生长，但对于转染少量外源基因甚或没有被转染的肿瘤细胞就没有作用，仅靠所谓的“旁杀伤效应”远远不够，目前基因治疗载体系统的表达效率还不足以达到仅靠表达抑癌基因就能治愈肿瘤的程度[11]。血管的生成及维系是动物和人体各种组织和器官生成和功能运转的基本保障，也是肿瘤成瘤的重要条件。肿瘤组织中血管增生和碎片化，在肿瘤发生和转移过程中发挥着重要的作用。肿瘤的增殖和转移与人肿瘤血管的生成密不可分。新血管生成是肿瘤迅速增殖和转移的重要条件之一，新生的血管网为肿瘤的生长和转移提供养分和氧气，运走代谢废物，刺激肿瘤的生长。如果没有血管供应营养，肿瘤细胞将逐渐停止生长并死亡，失去致瘤性，这点已被大量动物及临床试验所证明。血管内皮细胞生成刺激因子包括：血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,简称vegf)、血管通透因子(vpf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和血管生成素(angiopoietin,简称ang)等，这些因子与内皮细胞表面受体相结合，激活细胞内不同的信号传递途径，进而调节血管内皮细胞活动。vegf及其受体(简称vegfr)体系是目前得到确认的、最重要的调节血管生长和维持的信号转导通路，参与血管的构建和维系。阻断vegf与vegfr的结合，如抗vegf抗体等，已经证明是对肿瘤的治疗有效，但由于只能系统性的给药，其药物副作用也是显而易见的。利用阳离子脂质体载体将能拮抗vegf或vegfr的重组基因运载进入肿瘤组织，并在肿瘤细胞中特异地表达出来，能产生对肿瘤的治疗作用，并大大地降低药物副作用。免疫增强基因疗法是利用肿瘤细胞表达具有促免疫反应能力的细胞因子，增加机体识别肿瘤抗原免疫原性的灵敏度，激活机体对同质性肿瘤细胞的免疫杀伤，因此不需要转染所有肿瘤细胞，同样起到消灭所有肿瘤细胞的效果。gm-csf是最有效的抗肿瘤免疫诱导剂之一[12]，它可以通过几种机制起作用，包括：募集天然杀伤细胞(nk)和抗原呈递细胞如树突细胞[13]。常规的或是机体水平的促进免疫反应方法潜在地增加免疫副反应的可能性。如对肿瘤的ctla-4抑制、基于cd19的car-t、cpg免疫激活疗法等，诱导细胞因子产生，具有较大的副作用。在肿瘤组织中高表达gm-csf可以特异性激活肿瘤组织部位的树突细胞，增强肿瘤抗原的提呈和转归效率，从而在避免全身增敏的条件下产生和增强t淋巴细胞的功效。nk细胞具有启动免疫反应的作用、激活或消除dc的能力，参与免疫协调[14]；nk细胞与dc相互作用，增强抵抗微生物和肿瘤的先天性免疫力[15]。表达gm-csf的溶瘤病毒可以分别诱导病毒特异和肿瘤特异的t淋巴细胞。2015年溶瘤病毒携带gm-csf基因的t-vec疗法获得fda批准用于黑色素瘤的治疗[16]。溶瘤病毒疗法的早期目标是直接用病毒溶解肿瘤细胞，而不是产生免疫应答反应。但后来发现，实际上起作用的是共表达的gm-csf对肿瘤抗原提呈细胞的激活，导致生成专一识别肿瘤抗原的ctl，进而杀死肿瘤细胞。溶瘤病毒对不同部位转移肿瘤的治疗和长期疗效的维持是通过增强免疫反应实现的[17,18]。病毒蛋白本身就是异体抗原，而且具有很强的免疫原性。利用病毒为载体的基因治疗中，机体产生的免疫反应集中到了抗病毒的反应上，影响抗肿瘤反应的效果。另外，机体产生抗病毒抗体，也限制了病毒载体通过血液进行全身输送，只能是局部用药，如溶瘤病毒只能直接注入肿瘤组织才能发挥作用[18]。sipuleucel-t(provenge)是在体外利用gm-csf帮助抗原提呈的个性化癌症免疫疗法，用于治疗前列腺癌。通过提取患者的白细胞，主要是树突细胞。融合蛋白pa2024由存在于95％前列腺癌细胞中的抗原前列腺酸性磷酸酶(pap)和gm-csf组合而成。将血液产物与由融合蛋白pa2024一起温育，gm-csf帮助树突细胞成熟，并再输送到患者体内。接受sipuleucel-t治疗的患者中位生存时间为25.8个月，而安慰剂治疗患者的中位生存时间为21.7个月，增加了4.1个月。31.7％的治疗患者存活36个月，对照组为23.0％[19]。sipuleucel-t治疗的一个设计缺陷是产生的抗肿瘤t-淋巴细胞是针对高表达的正常pap，而非患者肿瘤细胞本身具有的变异蛋白质，pap抗原产生的免疫反应对肿瘤的治疗效果有限。尽管基于阻断黑色素瘤中程序性细胞死亡1(pd-1)的单一疗法取得了成功，但大多数患者并没有获得持久的临床益处。肿瘤中预先存在的t细胞浸润和/或pd-l1的存在可以用作临床反应的指标。然而，基于血液分析来了解pd-1阻断的机制尚未被广泛探讨。在这里，我们使用pd-1靶向抗体pembrolizumab治疗前后iv期黑素瘤患者外周血的免疫谱，并确定循环衰竭表型cd8+t细胞的药效学变化。大多数患者表现出对pembrolizumab的免疫学反应。许多患者的临床失败不仅仅是由于不能诱导免疫力恢复，而是由于t细胞再激活与肿瘤负荷之间的不平衡所致。与治疗前肿瘤负荷相关确定的循环tex细胞的复兴程度与临床反应相关。通过对机械相关的循环t细胞亚群进行重点分析，校正为预处理疾病负担，我们确定临床可用的潜在治疗中对pd-1阻断反应的预测因子[20]。肿瘤免疫治疗的途径有两个：一个是促进机体对肿瘤抗原的免疫反应能力，另一个是针对免疫抑制检查靶点。后者是建立在机体已经产生对肿瘤细胞免疫响应的前提下，对产生免疫抑制的肿瘤微环境进行调整，重新激活机体对肿瘤的免疫反应。因为肿瘤产生免疫逃逸的机制多样化，因此利用针对特定肿瘤免疫抑制检查点的治疗方法，肿瘤患者对特定疗法的响应率普遍较低。促进机体对肿瘤抗原的免疫反应灵敏度，增加对肿瘤抗原提呈，可以诱导产生不同表型的ctls，即多克隆化的ctls，产生能规避肿瘤细胞免疫逃逸机制的ctl，提高机体免疫治疗响应率。现有的治疗手段可以提升机体整体免疫水平，但没法做到针对肿瘤组织进行局部选择性免疫增强。这样做的结果是超敏反应对机体带来极大的伤害。t细胞在胸腺(thymus)成熟，形成无抗性t细胞(naivetcell)。儿童时期的胸腺达到最大(20-37克)，青春期后以每年胸腺的数量以3％的速度递减，至75岁时仅6克重。因此老年人血液中t细胞数目降低，免疫能力减退。抗pd-1疗法对晚期肿瘤几乎没有疗效，同肿瘤的微环境有关，也同年龄也有关。抗pd-1抗体等对免疫抑制检测点的调归，对肿瘤细胞抑制ctl效应的修正，没有增加免疫反应的强度，也就没有增加免疫细胞的数目，因此这类免疫调控需要依赖有足够数目的t细胞。肿瘤的发生随着年龄而增长，老年病人的t细胞数目下降，降低ctl抗肿瘤的效率。促免疫反应对肿瘤的治疗对老年病人是非常有必要的。目前常用的促免疫反应的治疗手段，如注射gm-csf因子，大多通过全身给药，缺乏肿瘤组织专一性，引起很大的副作用，也降低对肿瘤的疗效。在病灶部位，而非全身，诱导产促免疫反应可以保证晚期肿瘤的治疗疗效，并降低免疫过敏产生的副作用。技术实现要素：本发明的目的之一，在于提供一种包裹质粒dna的阳离子脂质体复合物，以解决上述问题。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种包裹质粒dna的阳离子脂质体复合物，由阳离子脂质体及其包裹的质粒dna组成，其中，所述阳离子脂质体由dotap与辅助脂质构成，所述质粒dna为至少一种促进免疫反应的细胞因子的质粒载体。作为优选的技术方案：所述复合物中dna质粒的浓度大于0.40μg/μl，dna质粒的平均粒径小于240nm。作为优选的技术方案：所述阳离子脂质体是由dotap与卵磷脂构成，其摩尔比为20：(8-11)。作为优选的技术方案：所述阳离子脂质体是由dotap与胆固醇构成，其摩尔比为20：18。作为优选的技术方案：所述质粒dna为gm-csf、g-csf、ifn-γ、白介素、tnfα、细胞因子、抗血管生成因子或抑癌基因的基因序列中的至少一种。作为进一步优选的技术方案：所述质粒dna包含有去除了cpg寡核苷酸序列的卡那霉素抗性基因，编码基因具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。作为更进一步优选的技术方案：所述gm-csf为经过碱基优化的gm-csf。作为再进一步优选的技术方案：编码mgm-csf的基因具有如seqidno：2所示的核苷酸序列；编码hgm-csf的基因具有如seqidno：3所示的核苷酸序列。作为再进一步优选的技术方案：编码的flt1-kdr3重组蛋白质具有如seqidno：4所示的氨基酸序列；作为再进一步优选的技术方案：实时定量pcr被用于测定mgm-csf基因表达水平，pcr引物如seqidno：5所示的核苷酸序列；pcr互补引物如seqidno：6所示的核苷酸序列；在本发明中，在目标细胞中表达具有免疫增强功能的细胞因子，包括：干扰素、白介素、tnf-a、gm-csf和g-csf等，以优化的多次给药方式，克服免疫治疗中肿瘤免疫逃逸问题。阳离子脂质体dna复合物，通过全身血液输送，把质粒dna(无活性基因表达前体)相对特异地转染到肿瘤细胞中，在肿瘤细胞中表达出具有生物活性的蛋白质，分泌胞外，其表达并不直接抑制肿瘤细胞生长，因此可以充分利用肿瘤细胞的蛋白质表达能力，在其受到免疫细胞的攻击之前，持续地生产目标蛋白质。设计的活性蛋白质为促免疫反应的细胞因子之一，分泌并富集于肿瘤组织附近，形成对肿瘤病灶局部给药，提高对肿瘤细胞专一性抗原的提呈，降低对正常组织产生的副作用。本发明的发明点在于利用阳离子脂质体包裹一种(或多种)促进免疫反应的细胞因子的质粒载体，如gm-csf、g-csf、或il-2的基因序列。表1总结了潜在的促免疫因子。t淋巴细胞所识别的肿瘤抗原为多肽，而脂质体复合物的构成为天然的卵磷脂、dotap和质粒dna，dotap是经过修饰的卵磷脂。cdll:dna复合物成分单一，不含蛋白质或多肽成分，因此免疫原性弱。质粒dna的大量制备首先是在大肠杆菌中扩增，然后经过dna亲和层析柱进行纯化，去除杂质和内毒素。细菌缺乏dna甲基化酶，生产的质粒dna为非甲基化。非甲基化cpg寡核苷酸序列诱导b细胞增殖和分泌免疫球蛋白[21]，具有强效免疫激活功能的非甲基化cpg寡核苷酸已被作为佐剂使用[10]。非甲基化cpg寡核苷酸(sd-101)也被用于刺激机体对肿瘤组织的免疫反应，与ox40抗体联合使用在小鼠模型里产生良好的治疗效果，已经在临床i期进行测试。但从理论上讲，这种免疫反应并没有专一地针对肿瘤抗原产生疗效，而是广谱地增加免疫反应强度，把大量免疫资源浪费在抗细菌的反应上。质粒扩增需要的卡那霉素抗性基因(kanamycinresistancegene)含有cpg寡核苷酸序列，增加质粒dna的免疫原性。本发明对质粒载体pne-orf中卡那霉素抗性基因碱基序列进行了优化，去除了cpg寡核苷酸序列(如图2a和图2b)。阳离子脂质体dna复合物由dotap、卵磷脂和质粒dna构成，免疫原性低，其微弱的免疫原性主要来自dotap和质粒dna上非甲基化cpg寡核苷酸序列。基因工程改造的质粒dna在是大肠杆菌中发酵生产的，原核细胞缺乏对cpg寡核苷酸序列进行甲基化的能力。非甲基化的cpg寡核苷酸增大机体免疫反应强度[10]。由于肿瘤的免疫治疗使用促免疫反应的细胞因子，为减低质粒dna的免疫原性造成的抗原反应，本发明对质粒dna序列中卡那霉素基因抗性基因和目标orf的序列进行改造，尽可能地清除cpg寡核苷酸序列，以减低机体潜在的免疫副反应。为了进一步降低质粒dna的免疫原性和增加在真核细胞中的表达效率，本发明对质粒dna中目的基因的碱基序列进行了优化。本发明采用的技术方案是这样的：筛选出目标细胞因子，通过基因数据库，如ncbi、ebml，获得其编码序列，进行基因序列的优化，以利于优化的高表达的碱基序列，并筛选、清除cpg寡核苷酸序列。将优化的基因序列克隆到pne表达质粒中，进行表达产物的鉴定。用cdll脂质体对质粒dna进行包裹，形成具有治疗功能、可以静脉注射给药的cdll:dna复合物。降低dna载体的免疫原性是很重要的，尤其是因为gm-csf等具有促进免疫反应的能力，对载体的免疫反应有放大的可能性。“cpg”序列的抗原性是公知的，我们据此对所有本发明使用到的orf都进行了序列修饰，除了优化密码子，也要去除cpg序列，这种修饰降低质粒dna本身的免疫原性。阳离子脂质体dotap作为载体在血浆中被迅速降解，需要辅脂的保护。us专利6413544中用摩尔数比为20:18的胆固醇为辅脂，可以增加dotap:胆固醇:dna复合物在血浆中稳定性，使其具有体内进行基因转染的能力。用相同摩尔数比的卵磷脂为辅脂构成的dotap:卵磷脂:dna复合物则丧失了体内基因转染的能力，只能用作体内转染试剂的阴性对照。我们通过实验发现，dotap与卵磷脂的摩尔数比例影响脂质体的体内转染能力，当dotap与卵磷脂的摩尔数比为20:9时，dotap:卵磷脂:dna复合物具有最大的dna装载能力和体内转染能力、以及最小的粒子颗粒(专利cn102133404b)。在专利cn102133404b中，尽管我们用表达多种抑癌基因的脂质体对肿瘤进行了试验，对肿瘤生长和进程有程度不一的抑制作用，但对肿瘤细胞直接杀灭的作用机制不尽人意，不能达到实验设计所期待的长期疗效结果。本发明更新了设计思路，利用表达促免疫的细胞因子，避免对肿瘤细胞的直接杀灭，充分利用肿瘤细胞表达生产细胞因子，增强机体免疫对肿瘤细胞的免疫识别敏感性和免疫杀伤能力，通过血液全身性给药达到对转移癌的治疗；通过重复多次给药达到对异质性肿瘤细胞的识别；通过正常化的免疫防御系统，生成针对肿瘤抗原的记忆t细胞，在完成肿瘤免疫治疗后，实现对同质肿瘤细胞的免疫监视，避免复发。相对于应用肿瘤抑制基因对肿瘤生长仅仅产生抑制作用，如专利cn102133404b和文献[11]所示，本发明可以控制肿瘤的生长，达到长期治疗的效果和治愈的目的，尤其是对晚期转移肿瘤。本发明所用的细胞因子为分泌性多肽，表达后被分泌到细胞质外。实施例2中测定了pne-hgm-csf对h1299细胞的转染、表达及分泌，证实体外培养的h1299细胞所表达的gm-csf主要分泌于细胞外(图5)。体外培养的不同肿瘤细胞受多种细胞因子转染，大多数细胞因子的表达，包括gm-csf，对细胞生长没有太大影响(图6)。在体内，转染的肿瘤细胞持续不断的表达gm-csf因子，直到细胞被清除。细胞因子可以被最大化的生产并富集于肿瘤组织，刺激树突细胞对肿瘤抗原的提呈、达到在肿瘤组织区域增强局部免疫反应的效果。balb/c小鼠转移癌治疗实验中，部分经过cdll:gm-csf复合物治疗的小鼠肿瘤中发现大量cd8+ctl碎片，证实cd8+ctl对肿瘤细胞的杀灭作用。部分小鼠肿瘤中没有观察到cd8+ctl，但均观察到对移植肿瘤细胞的杀灭，揭示了gm-csf功能的多样性。本发明涉及的目标蛋白orf可以通过基因重组技术获得，该技术为常规技术，首先获得编码上述蛋白的dna序列，该序列可以在ncbi的genbank中下载得到，然后通过pcr扩增获得上述蛋白的dna并克隆到载体中，载体可以是分子生物学常用的质粒或dna片段。载体中包含驱动基因表达的启动子、蛋白翻译起始和终止信号，还含有原核细胞生长选择性基因，有利于对细菌的选择和质粒dna的生产。本发明所述阳离子脂质体dna复合物可以通过静脉注射，并重复多次给药，对机体全身进行覆盖，克服肿瘤位置、大小、形态、数量对用药方式的限制，提高对同质性肿瘤的抗原提呈灵敏度，并产生免疫记忆。多次给药方式也提高对异质性肿瘤细胞抗原提呈的敏感性，提高产生具有肿瘤抗原针对性ctl的机率，达到长期疗效的目的。基因不断突变产生新的变异蛋白质，是肿瘤逃脱免疫攻击的重要方式，也是肿瘤复发的原因之一。所述发明可以应用于复发的肿瘤，针对新生的变异蛋白质，攻击新生的异质性肿瘤。肿瘤细胞数目巨大时，gm-csf在肿瘤细胞中的表达量大，不断刺激产生新的抗原提呈细胞，持续发送强大的免疫进攻信号。随着肿瘤细胞数目降低，gm-csf的表达量减少，免疫信号减弱，随之产生的ctl数目也减少，为达到临床治疗理想的药物量效关系提供了一种解决方法。阳离子脂质体dotap/e7复合物激活免疫反应，具有一定的抗肿瘤活性。但通过共同配制高比例的惰性中性脂质dopc与阳离子脂质/e7复合物，导致ros降低和抗肿瘤活性降低(us专利8877206b2：stimulationofanimmuneresponsebycationiclipids)。用cdll空脂质体对转移癌的治疗效果低于表达gm-csf的脂质体复合物，并且出现坏死的肺组织。证明gm-csf增强了对肺组织的保护(图10)。白细胞介素-2(il-2)也是促免疫反应的关键细胞因子之一，且具有多种功能。在治疗转移性肾细胞癌和转移性黑素瘤有一定疗效[22]。表1总结了可以代替gm-csf产生促免疫反应作用的细胞因子，这些基因可以在本发明中用以替代gm-csf，达到对肿瘤进行基因免疫治疗的目的。实际上，这解决了目前car-t治疗实体肿瘤最大短板之一：car-t细胞无法有效地进入实体瘤组织内部，而绝大多数都被挡在肿瘤组织外围，造成car-t细胞无法和肿瘤细胞直接接触进而杀伤肿瘤的困境。肿瘤免疫疗法具有革命性的意义，特别是抗pd-1疗法的临床应用，具有广谱性和副作用小的特点，它证实了通过激活机体本身的免疫反应可以消融肿瘤。但是现行的肿瘤免疫治疗方法都有缺陷，有很大的改进空间。本发明的目的之二，在于提供一种复合物的制备方法，采用的技术方案为：利用cdll与含有抗血管生成作用的重组基因进行混合，所产生的脂质体复合物具有表达抗vegf活性的重组蛋白，如vegf受体片段。vegf结合受体有三种：vegfr1(flt1)，vegfr2(flk1或kdr)和vegfr3(flt4)，与肿瘤血管新生关系密切的为前两种。vegfr1和vegfr2均由三种不同的功能区域组成；第一个功能区是位于细胞外，由7个免疫球蛋白样结构域组成，是vegf与受体结合的关键识别和结合区域。第二个功能区是由疏水性氨基酸组成的跨细胞膜部分，第三个功能区是细胞内部分，包含酪氨酸激酶基团。flt1可结合vegfa，vegfb和plgf，kdr可以结合vegfa、vegfc和vegfd[23,24]。当受体被vegf激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团磷酸化，酪氨酸激酶活性受到激活，发生一系列的信号传递，进而引起血管新生。kdr被认为是血管新生的主要调节受体。sflt1为自然发生的可溶性flt1分泌型变异体，具有结合vegf的功能。sflt1由flt1的胞外区域(1-656氨基酸)和变异的sflt1c-末端多肽(-gehcnkkavfsriskfkstrndcttqsnvkh)组成[25]。flt1-kdr3的氨基酸序列由flt1n端1-822氨基酸组合成的多肽，含有跨膜区域。c-末端加上半胱氨酸(c)，以利于形成二聚体。在252-311位氨基酸序列插入kdr的区域3(r3)，以kdr的r3取代flt1的r3区域后，增强重组多肽对vegfc和vegfd的亲和力。sflt1-kdr3重组蛋白为可溶性的flt1-kdr3，由flt1-kdr3n-端(1-658氨基酸)与sflt1c-末端31个氨基酸重组而成。cdll:flt1-kdr3具有抑制emt6肺转移癌的作用，尤其是对晚期肿瘤见效快(表5，图7a和图7b)。与cdll:gm-csf联合用药，提高对晚期非转移癌的治愈疗效(图11和图12)。本发明的目的，还在于提供一种上述复合物的制备方法，采用的技术方案为：将所述阳离子脂质体与所述质粒dna混合，即得。无dna载荷的阳离子dotap:卵磷脂脂质体(cdll)本身对肿瘤组织具有亲和力，能造成局部肿瘤组织缺血性坏死，图14a和图14b。cdll这种作用对肿瘤的影响是短暂的，如cdll对晚期的emt6肺转移癌有一定的抑制作用，但并不能维持长期的治疗效果，图11和图12。与cdll相比，无dna载荷的阳离子dotap:胆固醇脂质体(cdcl)对肿瘤细胞的杀伤作用不明显[26]。加上mgm-csf后，cdll:mgm-csf对肿瘤组织任然具有引起缺血性坏死的作用，在药物注射6小时－48小时的小鼠肿瘤切片中均得到证实，图14b。而mgm-csf的表达诱导t淋巴细胞产生，维持对肿瘤的长期疗效，并对肺组织有明显的修复作用，图10和图12。cdll通过血液对全身肿瘤细胞进行转染，对肿瘤组织的杀伤，产生类似溶瘤病毒对肿瘤细胞的裂解作用，加上有mgm-csf基因的表达，有助于促进机体对肿瘤抗原的提呈和t淋巴细胞的转归。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明另辟蹊径，应用免疫治疗的原理，使用gm-csf基因等促免疫反应的细胞因子，克服脂质体载体总体转染效率不高的缺点；技术上，类似的脂质体药物在美国已经进入临床二期试验，没有毒副作用的担心，并且因为免疫原性低，可以通过全身性静脉注射重复给药，对治疗转移癌和复发的异质性肿瘤有很大帮助[27,28]。这一点已经获得动物实验数据的支撑，在动物转移癌模型上也取得很好的长期疗效结果；本发明的脂质体复合物对早期emt6乳腺癌细胞肺转移癌治愈率达100％，对终晚期emt6细胞肺转移癌治愈率达到33％；用脂质体gm-csf和flt1-kdr3联合使用，提高终晚期肺转移癌的治愈率到50％；对b16黑色素瘤细胞肺转移癌也有相似的作用和长期治愈疗效。附图说明图1a：pne-orf表达质粒图谱；图1b：pne-flt1-kdr3表达质粒功能图谱；图1c：pne-mgm-csf表达质粒功能图谱；图2a:kanamycin抗性基因序列cpg岛分析结果kanamycin抗性基因含有天然的cpg岛序列；图2b:优化后kanamycin抗性基因序列cpg岛分析结果修饰后的kanamycin抗性基因去除了cpg岛序列；图3：脂质体dna复合物粒度测定比较；图4：flt1-kdr3转染24小时后，细胞及培养液中vegfr1的含量；图5：cdll:hgm-csf转染h1299细胞24小时后，细胞及培养液中hgm-csf的含量；图6：体外培养细胞接受cdll:dna复合物转染后细胞存活率；图7a：cdll:dna对早期emt6乳腺癌细胞balb/c小鼠肺转移瘤抑制效率初筛；图7b：cdll:dna对晚期emt6乳腺癌细胞balb/c小鼠肺转移瘤抑制效率初筛；图8a：转基因及组合抑制emt6细胞balb/c肺转移瘤的初筛-1(肿瘤灶数目)；图8b：转基因及组合抑制emt6细胞balb/c肺转移瘤的初筛-2(肿瘤灶数目)；图8c：转基因及组合抑制emt6细胞balb/c肺转移瘤的初步筛选(荷瘤小鼠数目)；图9：cdll:dna复合物治疗emt6乳腺癌细胞早期肺转移癌的kaplan-meier生存曲线；图10：cdll:dna复合物对emt6乳腺癌早期肺转移癌治疗后小鼠肺wexler染色结果；小鼠肺组织按处死时间或死亡时间顺序排位；图11：cdll:dna复合物治疗emt6乳腺癌细胞晚期肺转移癌的kaplan-meier生存曲线；图12：cdll:dna复合物对emt6乳腺癌晚期肺转移癌治疗后小鼠肺wexler染色结果；小鼠肺组织按处死或自然死亡的时间顺序排位。图13：经cdll:dna复合物治疗后emt6皮下移植肿瘤的组织学染色分析；图14a：注射脂质体复合物6小时后的emt6皮下移植肿瘤组织化学染色分析；图14b：cdll:dna复合物治疗不同时间emt6皮下移植瘤的he和cd8+组化染色分析；图15：经cdll:mgm-csf注射后，肿瘤中mgm-csf表达水平的时间曲线；图16：经cdll:mgm-csf尾静脉注射24后，肿瘤及组织中mgm-csf表达的mrna水平rt-qpcr测定结果；图17：balb/c小鼠，cdll:mgm-csf尾静脉注射后，血液中mgm-csfdna残留和mrna表达水平；图18：cdll:mgm-csf复合物对emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌再接种致瘤生存实验；图19a：cdll:dna复合物对b16黑色素瘤肺转移瘤早期治疗小鼠肺荷瘤比较；图19b：cdll:dna复合物对b16黑色素瘤肺转移瘤早期治疗的肿瘤灶统计结果；图20：cdll:mgm-csf转染b16黑色素瘤肺转移瘤24小时，肿瘤灶中mgm-csf表达水平的rt-qpcr测定结果。具体实施方式下面将结合附图对本发明作进一步说明。除非特别说明，本申请中的“cdll”均是指阳离子dotap:卵磷脂脂质体，脂质体摩尔数为4mm的dotap和1.8mm的卵磷脂制备而成，摩尔数目比为20:9。本申请中的“cdll:dna复合物”由4mmdotap，1.8mm卵磷脂，和0.45μg/μl的质粒dna构成。阳离子dotap:卵磷脂脂质体(cdll)包裹基因a表达质粒形成的阳离子脂质体dna复合物以cdll:a来表示。实施例1：pne-orf基因表达质粒的重组构建本发明在大肠杆菌质粒puc19碱基序列(genbank:m77789.2)模版的基础上进行基因工程改造，设计了仅包含5种必要功能区域的最小化外源基因表达质粒:pne-orf，结构见图1a，所述pne-orf质粒dna具有如seqidno：1所示的核苷酸序列。puc骨架提供了用于在大肠杆菌中繁殖的puc复制起点和用于单链dna生产的f1起点。利用puc复制起点，质粒小于3.0kb时，质粒产量极大地降低。本发明所表达的大多数基因为细胞因子，为小分子蛋白质，如小鼠gm-csf的orf为423bp，形成的质粒接近3.0kb，不易于质粒的生产。加入f1片段起到平衡作用，增加质粒产量。细菌启动子位于卡那霉素抗性基因的上游，启动大肠杆菌中表达卡那霉素抗性。细菌卡那霉素抗性基因的编码序列含有264个密码子，本发明使用大肠杆菌偏好的密码子进行碱基改变以增强该基因在细菌中的表达，并去除“cpg岛”，以减低细菌生产的质粒dna在机体内引起潜在的抗原反应。embosscpgplot线上程序(http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot)可以分析核苷酸序列中潜在的cg岛，计算程序沿着序列移动的窗口(序列区域)上计算观察到的cg二核苷酸模式的预期数量比率，以图形方式绘制计算的比率和“cpg岛”区域。利用embosscpgplot程序对卡那霉素序列进行对比分析，pegfp-n1中的卡那霉素序列显示两个强“cpg岛”峰(图2a)，优化后的卡那霉素序列(kan-dcpg)中“cpg岛”消失(图2b)。图1a中，真核细胞基因表达质粒载体pne-orf由puc复制子和去除了cpg岛的卡那霉素抗性基因组成，包含真核细胞的cmv启动子、多聚a信号和蛋白质编码序列(orf)。目的orf序列可以通过nhei/xbai限制性内切酶位点克隆到pne质粒中，在真核细胞中受cmv启动子推动mrna的合成。cmv来源于人源巨细胞病毒序列，是已知的最强真核细胞启动子之一，而且具有广谱性。目标基因的orf序列位于人巨细胞病毒(cmv)启动子和转录终止信号(polya信号)之间，orf上游序列改变为kozak共有翻译起始序列，以提高真核细胞中的翻译效率。目标基因orf的两端，分别参入限制性内切酶nhei和xbai识别位点，任何orf序列都可以经过人工合成时加上这两个酶切位点，方便地切换到pne-orf表达质粒中，形成新的表达质粒。例如，flt1-kdr3重组基因是在flt1(vegfr1)的n-端822氨基酸为基础，以flk1的功能域3(flk1r3)取代flt1的功能域3(flt1r3)形成的重组蛋白，兼具vegfr1/2对不同vegf的亲和力。由南京金斯瑞公司合成的flt1-kdr3重组基因片段seqidno4，用nhei和xbai进行酶切，分离2424bp的dna片段，克隆到pne-orf载体中，测序确认，并经elisa验证，确认有vegfr受体活性蛋白质的表达(图4)，完成pne-flt1-kdr3重组蛋白表达质粒的构建。质粒的结构示意图见图1b，图1b中，合成的flt1-kdr3重组基因片段，组装在cmv启动子之下，在真核细胞中表达具有seqidno：4序列的flt1-kdr3重组蛋白质。南京金斯瑞公司合成的mgm-csf基因片段seqidno2，用nhei和xbai进行酶切，分离450bp的dna片段，克隆到pne-orf载体中，测序确认，并经elisa或免疫印迹sds-凝胶电泳验证，完成pne-mgm-csf表达质粒的构建，见图1c，图1c中，合成的mgm-csf重组基因片段，具有seqidno：2序列，组装在cmv启动子之下，在真核细胞中表达小鼠gm-csf重组蛋白质。同样的方式用于构建人源gm-csf重组表达质粒pne-hgm-csf。将pne-hgm-csf质粒dna转入真核细胞h1299培养细胞中，表达出人源gm-csf蛋白因子，其氨基酸序列与genbank中geneid12981的csf2氨基酸序列一致，并经elisa检测确定。表1：具有促进免疫反应能力的细胞因子和本发明涉及的重组基因利用pne-orf载体质粒克隆目标蛋白质表达载体的标准化过程为：在ncbi(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)网站上，以表中geneid为关键词搜索目标蛋白质。拷贝目标蛋白质的氨基酸序列，对目标蛋白质氨基酸序列进行转换，获得相对应的核苷酸序列(即目标蛋白质的orf)，并经过针对真核细胞的表达进行密码子优化处理和“cpg岛”的清除。再对设计的基因片段加上合适的kozak序列和nhei，xbai酶切位点，如seqidno.xxx所示，人工合成所设计的dna片段，克隆到含有cmv启动子的pne-orf表达质粒载体，测序确认。经转染，pne-目标基因在真核细胞中表达出设计的蛋白质，图1c为代表性的pne-mgm-csf表达质粒图，表1中所列蛋白质均可以类似的构建方式获得具有相似结构的表达载体。各种蛋白质的orf片段的合成、表达质粒的构建和测序鉴定由南京金斯瑞公司或sigma-aldrich提供完成。用质粒dna转染dh5a大肠杆菌，进行卡那霉素序筛选培养，并利用qiagen的质粒dna提取试剂盒进行纯化。实施例2：pne-hgm-csf在h1299细胞中表达及分泌4种pne-0rf表达质粒：pne-gfp、pne-hgm-csf、pne-sflt1、pne-hbax可以在真核细胞中相应地表达gfp、hgm-csf、sflt1以及hbax蛋白质。用这4种质粒dna分别转染培养的h1299细胞，用elisa测定法测定细胞培养上清和细胞裂解液中人源gm-csf蛋白的含量，确认目标蛋白产率及分泌。具体做法为：用6孔板，每孔接种2.4×104细胞。用浓度为0.9μg/μl-1.00.45μg/μl的质粒dna与cdll脂质体进行等体积混合，形成cdll：dna复合物，其中，dotap浓度为4mm，卵磷脂为1.8mm，见表2表2不同质粒dna与cdll的复合物粒径及分散指数cdllcdll：mgm-csfcdll：flt1-kdr3cdcl：mgm-csfdotap浓度(mm)4444辅脂浓度(mm)1.8(卵磷脂)1.8(卵磷脂)1.8(卵磷脂)3.6(胆固醇)dna浓度(ug/ul)0.000.450.450.45平均粒径(nm)116.87±5.26201.57±11.28195.55±10.95405.11±37.6680％粒径范围(nm)44.89-149.2574.06-246.2072.32-241.01320.43-512.47分散指数(pi)0.24950.27390.26570.2833用济南微纳激光粒度分析仪对不同制备的脂质体和脂质体复合物进行颗粒粒径分析，测定得到cdll平均粒径小于120nm；cdll：dna的平均粒径小于240nm，见图3；图3中，用济南微纳激光粒度分析仪(型号：winner802)对dotap卵磷脂脂质体载体、含有不同质粒dna的脂质体复合物粒径大小进行测定。所有脂质体的终浓度均为4mm，dna浓度为0.45μg/μl。cdll：dna复合物加入培养细胞中，混匀，转染4小时后，置换为含1％fbs的rpmi1640培养液，孵育24小时，取上清，收集细胞，分别利用elisa定量测定法测定培养上清及细胞裂解样本中人源gm-csf含量。酶联免疫吸附法(elisa)测定hgm-csf及vegfr含量由成都里来生物医学实验中心完成，所用试剂盒为abcam公司的humangm-csfelisakit，货号：xl-eh0079；humanvegfr1elisakit，货号：xl-eh0388。实验步骤按试剂盒手册推荐的进行，标准物的浓度与od值计算出标准曲线的线性回归方程式符合标准。图4中，6孔板里接种2.4x10^4h1299细胞。经过2.5μg质粒dna转染24小时后，置换入含1％fbs的培养液，孵育4小时，收集上清和细胞，分别利用elisa定量测定法测定样本中相当于vegfr1的含量。fbs中含有vegf。h1299细胞表达一定量的gm-csf和vegfr1。*：t测试检验，p<0.01，具有显著差异；培养液上清中vegfr1的含量为：样本中含量–1％fbs/rpmi1640培养液所含的本底；细胞vegfr1的测定含量为：细胞vegfr1含量–h1299细胞的本底含量；实验结果证明：pne-sflt1、pne-sflt1-kdr3和pne-flt1-kdr3质粒dna转染的h1299细胞上清中，测到vegfr1含量升高；flt1-kdr3转染的细胞中每孔有相当于200ngvegfr1含量的增加，与对照细胞比具有显著差异。证实pne-flt1-kdr3表达具有vegfr1活性的重组蛋白质，表达的flt1-kdr3重组蛋白质有一部分分泌到细胞外。pne-gfp、pne-sflt1、pne-sflt1-kdr3质粒dna转染的h1299细胞上清中，每孔测到gm-csf含量约为200ng，没有明显差别；pne-hgm-csf质粒dna转染的h1299细胞上清含量为360ng，明显高于3个对照质粒的表达量(p<0.01)，图5。4种细胞裂解样本中均有少量的gm-csf，没有明显区别。实验结果证明pne-hgm-csf质粒dna转染的h1299细胞有gm-csf的表达，并且分泌到细胞外。实施例3：cdll:dna复合物对体外培养细胞的生长影响本实验检测了cdll包裹的gm-csf、il-2等细胞因子质粒对细胞生长的影响。细胞株为正常的小鼠成纤维细胞3t3细胞、非小细胞肺癌细胞：h1299、a549和h460以及肝癌细胞hepg2。细胞培养于含10％fbs的rmpi1640中，将细胞用胰酶-edta消化后，计数，以每孔5000个细胞进行96孔板铺板，培养过夜。将质粒dna和cdll混合，用含10％fbs的rmpi1640稀释为每50μl培养液含0.2μg(低浓度)和0.4μgdna(高浓度)，每孔加入50μl含cdll:dna复合物的培养液，进行细胞转染。转染后第二天用100μl新鲜培养基换液，继续培养至第三天，加入20μlcck-8，37℃孵育4小时。读取od450的测试值，背景参考为od620的读数值。质粒dna转染48小时后细胞存活率实验结果见图6，图6中，3t3为小鼠成纤维母细胞，作为正常细胞对照；a549、h1299和h460为非小细胞肺癌细胞；hepg2为肝癌细胞。细胞在96孔盘中培养过夜，然后分别用0.2μg和0.4μg质粒dna进行转染。活细胞经cck-8染色法进行定量测定。正常成纤维细胞3t3中，除了高浓度inf-γ和gm-csf/il-2共转染对细胞生长有一定的抑制外，其余cdll:dna复合物对细胞的生长没有抑制，反而在低浓度组有明显的促细胞生长作用。高浓度cdll:dna复合物处理的肿瘤细胞中，与gfp转染对照组比较，只有p53缺失型的h1299细胞表现出剂量相关的生长抑制，而p53野生型的细胞对cdll:dna复合物的剂量相对不敏感。包裹gm-csf、il-2、sflt-1、il-7等cdll复合物对各种肿瘤细胞没有明显的生长抑制作用，与gfp转染对照的细胞存活率相当。相对于只含有包膜外区域的可溶性sflt-1，具有跨膜区域的抗vegf重组受体flt1-kdr3的cdll复合物对h460、h1299、hepg2有剂量依赖性的生长抑制作用。实施例4：emt6乳腺癌细胞balb/c小鼠肺转移癌模型的建立本实验首先探索了emt6乳腺癌细胞在小鼠肺转移癌的生长情况。emt6细胞培养于含10％fbs的dmem培养液中。按照常规细胞培养方法消化离心弃上清液获取细胞沉淀，然后用pbs缓冲液悬浮细胞，利用血细胞计数板进行细胞计数，最后根据细胞总数用pbs缓冲液调整细胞浓度至1×106细胞/ml。实验采用25只spf级别balb/c小鼠，进入实验室经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射100μlemt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。注射后7、14、21、28及35天随机处死5只小鼠，检查小鼠器官荷瘤情况，确认转移癌只在肺部出现。对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。重复实验三次，肿瘤灶数目列于表3中。三次重复实验证实emt6乳腺癌细胞的肺转移癌模型具有很好的重复性。对不同时间收获的肺组织进行了h&e组织学染色分析，证实肿瘤存在。emt6细胞接种7天后，小鼠肺组织中已经观察到明显的肿瘤灶，肿瘤细胞数目随时间延长而增多，在第28天时肿瘤细胞数目达到顶峰，一周后，已出现明显的肿瘤坏死。在肿瘤晚期，即从第21天开始，观察到肿瘤血管出现，并逐渐增多，加粗，35天时达到最大、数目最多。但此时，已出现大面积的出血现象。荷瘤小鼠的生存期实验使用5只spf级别balb/c小鼠。小鼠进入实验室后，经过一周的环境适应，通过尾静脉注射emt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。观察小鼠生理变化，记录死亡时间。检查死亡小鼠器官荷瘤情况，确认转移癌在肺部出现，未见于其他组织和器官。对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。重复实验三次，荷瘤小鼠死亡时间列于表4中。三次重复实验证实emt6乳腺癌细胞的肺转移癌模型具有很好的重复性，死亡范围为接种后27–42天，平均生存时间为34天。表3：emt6细胞原位肺癌balb/c小鼠模型建模表4：emt6乳腺癌细胞balb/c小鼠肺转移癌模型荷瘤小鼠生存时间实施例5：cdll:dna复合物对emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌的初步抑制实验本实验探索cdll:mgm-csf和cdll:flt1-kdr3脂质体复合物对早期、及晚期emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌灶数目的抑制情况。根据emt6细胞肺转移癌模型的特征，我们把emt6接种10天后给药定义为早期肿瘤的治疗，接种20天后给药为晚期肿瘤治疗。早期肿瘤的治疗：18只spf级别balb/c小鼠，经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射emt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。接种第10天，15只小鼠随机分为三组，每组5只，分别用cdll:mgm-csf、cdll:flt1-kdr3、cdll:mgm-csf/flt1-kdr3和生理盐水进行三次尾静脉注射，每两天注射一次，每次80μl药物或生理盐水。第21天，每组随机处死两只小鼠，对其肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。第28天，处死余下4只，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。肿瘤灶数目列于表5中。表5：emt6乳腺癌细胞balb/c小鼠肺转移癌的早期治疗结果以生理盐水对照为参照，p＜0.05，具有统计学意义晚期肿瘤的初步治疗：用24只spf级别balb/c小鼠，经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射emt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。接种第21天，随机处死2只小鼠，检查小鼠器官荷瘤情况，确认转移癌在肺部出现。余下的24只小鼠随机分为三组，每组8只，分别用cdll:mgm-csf、cdll:flt1-kdr3、cdll:mgm-csf/flt1-kdr3和生理盐水进行进行三次尾静脉注射，每两天注射一次，每次80μl药物或生理盐水。第23、24天，每组中随机处死一只；第35及43天各处死三只，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。肿瘤灶数目列于表6中。表6：emt6乳腺癌细胞balb/c小鼠肺转移癌的晚期治疗结果以生理盐水对照为参照，p＜0.05，具有统计学意义实验结果显示，cdll:mgm-csf复合物三次注射给药，对早期emt6细胞的肺转移癌有很好的治疗效果(图7a)，对晚期肺转移癌结束用药后(第26天)，肺转移癌病灶数目仍然维持下降的趋势，显示该复合物具有长期疗效的作用(图7b)。这点与cdll:flt1-kdr3复合物相比，尤为突出。后者对在给药期间，对肿瘤有显著的抑制作用，但在用药结束后的第35天和第43天，肿瘤灶数目增多。抗血管生成因子对肿瘤的抑制作用出现较早，注射次数不够多的情况下，疗效较难长期维持。cdll:mgm-csf/flt1-kdr3组合用药组，在给药早期及26天后均有较好的治疗效果，兼顾了对晚期肿瘤的长期和短期治疗作用。实施例6：cdll:dna复合物对emt6细胞肺转移癌的抑制比较本实验比较不同cdll:dna复合物对早期(接种十天)emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌灶数目的抑制情况。早期肿瘤的治疗用48只spf级别balb/c小鼠，经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射emt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。接种第10天，荷瘤小鼠随机分为八组，每组六只，分别用生理盐水、cdll:il-2、cdll:il-7、cdll:mgm-csf、cdll:inf-γ、cdll:mgm-csf、cdll:bax、cdll:mgm-csf/bax复合物，脂质体dna复合物的质粒dna含量均为0.45μg/μl，通过尾静脉注射。进行三次尾静脉注射，每两天注射一次，每次80μl药物或生理盐水。第21天，每组随机处死三只，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。第28天，处死余下三只，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。肿瘤灶数目比较见图8。生理盐水组三只小鼠死亡，肺转移癌灶数目并入第21天及第28天统计。cdll:mgm-csf、cdll:inf-γ、cdll:mgm-csf、cdll:bax组个有一只小鼠死亡，cdll:mgm-csf/bax组两只小鼠死亡，肺转移癌病灶数目并入第28天统计。实验结果显示，il-2、il-7、mg-csf、inf-γ、mgm-csf及bax均具有很强的抑制肿瘤生长的作用(图8a和图8b)。其中，mgm-csf和mg-csf复合物以及含有mgm-csf的组合治疗17天后，小鼠肺转移瘤数目低于10天治疗的，显示出mgm-csf和mg-csf对肿瘤的抑制具有长期疗效。实施例7：mgm-csf和flt1-kdr3复合物对早期emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌生存实验本实验探索接种emt6乳腺癌细胞7天后(早期)分别给予cdll:mgm-csf和cdll:flt1-kdr3复合物治疗的小鼠生存率实验。早期肿瘤的治疗：20只spf级别balb/c小鼠，经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射emt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。接种7天后随机处死2只小鼠，wexler染色确认小鼠emt6肺转移癌建模成功。小鼠随机分为三组，每组6只，分别用cdll:mgm-csf、cdll:flt1-kdr3，脂质体dna复合物的质粒dna含量均为0.45μg/μl，通过尾静脉注射。和生理盐水进行三次尾静脉注射，每两天注射一次，每次80μl药物或生理盐水。第14天至第19天，重复给药，共三次，每两天注射一次，剂量同前。记录小鼠生长情况、体重及死亡时间。解剖死亡小鼠，检查小鼠荷瘤情况，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。第124天，处死小鼠，检查小鼠荷瘤情况，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小(图9)。生存延长实验结果显示，生理盐水给药组小鼠在接种emt6细胞后42天内全部死亡，解剖死亡小鼠，取其肺进行wexler染色，可观察到肺转移癌(图10)。cdll:mgm-csf组中，六只小鼠全部存活至第124天，处死小鼠后，染色结果显示没有肺转移癌。肺组织表形健康，无坏死组织，无明显病理改变，没有明显疤痕。cdll:flt1-kdr3组小鼠六只存活至第124天，处死小鼠后，染色结果显示没有肺转移灶，肺组织有坏死组织和明显病理改变，疤痕明显。实验结果再次证实cdll:mgm-csf复合物对emt6细胞的转移癌具有长期疗效，且可以保护肺组织的健康。实施例8：cdll脂质体复合物对晚期emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌生存实验本实验探索接种emt6乳腺癌细胞21天后(晚期)分别给予cdll:mgm-csf和cdll脂质体复合物治疗的小鼠生存率实验。晚期肿瘤的治疗：36只spf级别balb/c小鼠，经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射emt6细胞，注射剂量：1×105细胞/只。接种21天后随机处死2只小鼠，wexler染色确认肺组织表面均有肿瘤灶，瘤体大，确定晚期肺癌模型成立。小鼠随机分为五组，每组6只，分别用cdll:mgm-csf、cdll:flt1-kdr3、cdll:mgm-csf/cdll:flt1-kdr3、cdll和生理盐水进行三次尾静脉注射，脂质体dna复合物中质粒dna含量均为0.45μg/μl，通过尾静脉注射。每两天注射一次，每次80μl药物或生理盐水。第35、37、39、50、53和54天，重复给药一次，剂量同前。cdll:mgm-csf/cdll:flt1-kdr3联和组的脂质体用药顺序为，两次cdll:mgm-csf，然后一次cdll:flt1-kdr3，分别注射；一周后，以同样的用药顺序重复三次注射。记录小鼠生长情况、体重及死亡时间。解剖死亡小鼠，检查小鼠荷瘤情况，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。第63天，处死剩下的小鼠，检查小鼠荷瘤情况，对肺组织进行wexler染色，记数肺部肿瘤灶数目及大小。晚期治疗结果显示，生理盐水组balb/c小鼠在42天内全部死亡，肺部表面有肿瘤灶，图11和图12。图12中，肺组织按小鼠死亡时间序列从左到右标记为1到6。三次疗程期间，cdll:mgm-csf组小鼠死亡四只，较其他组相比较少，解剖发现小鼠肺组织表面均有肿瘤灶。两只小鼠存活，处死后，组织染色结果显示没有肺转移癌。肺组织表形健康，无坏死组织，无明显病理改变。cdll脂质体对照组小鼠死亡五只，解剖发现小鼠肺组织表面均有肿瘤灶，肺组织有坏死组织和明显的病理改变。实验结果证实cdll:mgm-csf复合物对晚期emt6细胞的转移癌也具有一定的疗效，且疗效可以长期维持。cdll:mgm-csf/cdll:flt1-kdr3联合用药组显示出最佳的疗效，对晚期非转移癌的治愈率达50％；小鼠生长及体重无异常。实施例9：cdll:mgm-csf复合物治疗emt6细胞小鼠皮下移植瘤的组织染色分析及目标基因的表达水平采用6只spf级别balb/c小鼠进行emt6细胞的皮下移植，建立肿瘤模型。接种14天后，小鼠随机分为三组，每组2只，分别用cdll:mgm-csf、cdll:flt1-kdr3和生理盐水进行三次尾静脉注射，脂质体复合物中质粒dna含量均0.45μg/μl。每两天注射一次，每次80μl药物或生理盐水。完成第三次注射24小时后，处死小鼠，手术取出肿瘤块，用福尔马林固定，石蜡切片。对切片进行he和cd8+抗体组织化学染色，在光学显微镜下观察肿瘤组织及肿瘤杀伤相关的cd8+t淋巴细胞。结果显示：he染色分析中，cdll:mgm-csf给药组能观察到肿瘤细胞死亡形成的”小岛”，呈地图样坏死，图13。并出现cd8+t淋巴细胞强染(暗褐色,箭头所示)，肿瘤细胞受到ctl侵润、包围并杀死。生理盐水给药组小鼠肿瘤细胞无明显减少。实验结果显示，cd8+t淋巴细胞可能参与了cdll:mgm-csf复合物对emt6细胞转移癌的治疗。实施例10：cdll:mgm-csf复合物在荷瘤小鼠肿瘤中的表达和组织化学分析采用18只spf级别balb/c小鼠进行emt6细胞的皮下移植，建立肿瘤模型。接种7天后，小鼠随机分为三组，每组3只，分别用cdll:mgm-csf和生理盐水进行尾静脉注射，脂质体复合物中质粒dna含量为0.45μg/μl，总量为80μl。注射后6，12，24和48小时时，分别处死3只小鼠，手术取出肿瘤块，分为两块，一块用福尔马林固定，石蜡切片；一块直接用trizol试剂进行保存。在24小时实验组中，同时取50μl血液、心脏、肝脏、肺、肾、脑和肠组织，用trizol试剂进行rna提取，对mgm-csfmrna表达水平进行rt-qpcr定量分析测定。首先用dnasei去除rna样本中的dna残留，然后用寡聚dt对mrna进行逆转录，最后用顺式引物seqidno：5和互补引物seqidno：6对逆转录样本进行定量测定。同时对小鼠内源性gapdh基因mrna的表达水平进行定量，用作方法对照。对切片进行he和cd8+抗体组织化学染色，在光学显微镜下观察肿瘤组织及肿瘤杀伤相关的cd8+t淋巴细胞。结果显示：he染色分析中，cdll:mgm-csf给药组能观察到肿瘤细胞死亡形成的”小岛”，呈地图样坏死，图14b。cdll:mgm-csf注射6小时时，2个肿瘤组织中已经出现了明显的缺血性坏死组织结构，另一个肿瘤切片与正常对照比没有明显区别图14a。同样的坏死情况以相似的比例出现在不同时间表达后制备的组织切片中。小鼠#4、#6和#7肿瘤组织出现cd8+t淋巴细胞强染色。超过2/3的小鼠肿瘤组织受到ctl侵润、包围并杀死，并随着时间进程而加深。生理盐水给药组小鼠肿瘤细胞无明显减少。实验结果显示，cd8+t淋巴细胞可能参与了cdll:mgm-csf复合物对emt6细胞转移癌的治疗作用。不同给药时间的肿瘤样本的mgm-csfmrna表达水平的测定结果列于图15。给药6小时的肿瘤样本已经可以测定到mgm-csf的表达，12小时达到高峰，48小时的样本已经没有测到目标mrna的表达。小鼠肿瘤mgm-csf的表达水平显示出较大的个性差异。对给药24小时获得的肿瘤和组织进行测定的结果显示，肿瘤中目标mrna的表达最高，血液、肺和肠组织样本中也少量表达，图16。血液中转基因的表达可能在粒细胞和巨噬细胞中表达，而肺和肠组织中的转基因mrna的来源相对复杂，与这两种组织中滞留的血细胞可能有关系。不同时间收集血液中mgm-csfmrna表达水平和dna残留量总结于图17中。脂质体mgm-csf注射后，立即取出的血液中含有大量的mgm-csfdna，6小时后大部分降解。12小时有微量存在。12小时后已无dna残留。相应地，注射后即采集的血液中检测到mrna的表达，6小时后的血液中已经降低至rt-qpcr的检测线以下，图17中a。显示血液成分对脂质体dna的迅速降解。与组织和肿瘤组织中的rna残留相比，24小时取出的肿瘤仍能测出少量的目标mrna，图15和图16。实施例11：cdll:mgm-csf复合物对emt6乳腺癌细胞小鼠肺转移癌再接种致瘤生存实验实验采用14只balb/c小鼠，小鼠进入实验室经过1周适应,通过尾静脉注射emt6乳腺癌细胞，105细胞/只。注射后15天随机处死2只小鼠，wexler染色确认小鼠emt6肺转移瘤建模成功。随后，剩余的12只小鼠被随机分为2组，6只/组，cdll:mgm-csf或生理盐水治疗，脂质体dna复合物的质粒dna含量均为0.45μg/μl，通过尾静脉注射。生理盐水给药组小鼠在41天内全部死亡，解剖死亡小鼠，取其肺进行wexler染色，可观察到肺转移瘤。第60天，治疗组小鼠随机分为2组，3只/组，分别注射emt6或b16细胞。注射b16黑色素瘤细胞的小鼠在81天-89天死亡，肺部检出大量黑色素瘤灶。注射emt6的小鼠存活，无异样，第120天处死，肺部染色结果显示没有发现肺转移瘤。晚期治疗结果显示，生理盐水组balb/c小鼠在39天内全部死亡，肺部表面有肿瘤灶，图18。实验结果证实，cdll:mgm-csf复合物对emt6细胞的转移癌有疗效，且对在接种同质性emt6癌细胞有长期疗效，而对异质性b16黑色素细胞瘤没有识别抑制的效果。实施例12：cdll:dna复合物对b16黑色素瘤细胞小鼠肺转移癌的抑制实验本实验探索建立b16黑色素瘤细胞肺转移癌模型和cdll:mgm-csf和cdll:flt1-kdr3复合物对b16细胞肺转移癌的抑制作用。b16黑色素瘤细胞肺转移癌建模过程：按照常规细胞培养方法消化离心弃上清液获取细胞沉淀，然后用pbs缓冲液悬浮细胞，利用血细胞计数板进行细胞计数，最后根据细胞总数用pbs缓冲液调整细胞浓度至1×105细胞/ml。取7只balb/c小鼠，进行随机编号并称重，然后将小鼠取出固定在小鼠固定器上，用酒精棉球搽拭小鼠尾部皮肤，用注射管吸取0.2ml黑色素瘤细胞悬液，在小鼠近尾端1/2至1/3处进针。注射完毕后观察记录小鼠生长状况。每周取一只小鼠进行解剖，观察记录小鼠肿瘤形成状况，直到看见明显肿瘤灶形成为止。小鼠在第二周左右开始出现明显的肿瘤灶，14天解剖的肺组织出现非常典型的黑色素转移癌。选取2只b16接种21天的小鼠，通过尾静脉注射80μlcdll:mgm-csf，24小时后处死小鼠，小鼠肺部呈现多个肿瘤灶。每只小鼠各取3个肿瘤灶，用trizol试剂进行rna提取，并用rt-qpcr定量测试法对样本中mgm-csf的mrna水平进行测定。b16黑色素瘤细胞肺转移癌的治疗：10只spf级别balb/c小鼠，经过一周的环境适应后，通过尾静脉注射b16细胞，注射剂量：2×104细胞/只。接种14天后随机处死2只小鼠，确认肺组织表面有肿瘤灶，确定肺癌模型的成立。小鼠随机分为四组，每组2只。脂质体dna复合物的质粒dna含量均为0.45μg/μl，通过尾静脉注射。分别用cdll:mgm-csf(高剂量，100μl)、cdll:mgm-csf(低剂量,10μl)、cdll:flt1-kdr3(80μl)和生理盐水(80μl)进行三次尾静脉注射，每两天注射一次药物或生理盐水。记录小鼠生长情况、体重。第30天，处死小鼠，检查小鼠荷瘤情况，记数肺部肿瘤灶数目及大小。初步实验结果显示，生理盐水组balb/c小鼠在第30天解剖时，肺部表面有典型的黑色素瘤灶，数量多且瘤体大，图19a。cdll:mgm-csf组对肺转移癌有治疗疗效，并且与药物使用剂量相关。黑色素瘤病灶的数量统计显示于图19b中，cdll:flt1-kdr3组对黑色素瘤肺转移癌有一定治疗效果，明显减少肿瘤体积，但肿瘤灶数没有明显降低，与生理盐水组的数目相当。对mgm-csf转染24小时后手术分离得到的三个黑色素瘤灶进行rt-qpcr定量分析，结果显示在所有肿瘤灶均测定出目标基因的表达，但表达水平呈现较大差异，见图20。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。专利引用：1.肖虹,一种肿瘤靶向治疗药物载体、其制备方法及其应用。cn102133404b,2011.2.smyth-templeton,n.andg.n.pavlakis,liposomecomplexesforincreasedsystemicdeliveryunitedstatespatent67702912001.3.serda,r.,elena,meraz,ismailmustafa,cationicliposomesforcancerimmunotherapy.wo2017/035009a1,2016.4.chen,w.s.d.,ca,us),etal.,stimulationofanimmuneresponsebycationiclipidsunitedstatespatent88772062008.5.kirn,d.m.v.,ca,us),systemictreatmentofmetastaticand/orsystemically-disseminatedcancersusinggm-csf-expressingpoxvirusesunitedstatespatent98272782015.6.roth,j.a.h.,tx,us),r.s.l.ramesh,tx,us),andb.h.gopalan,tx,us)methodsandcompositionsforimprovednon-viralgenetherapyunitedstatespatentapplication200501433362004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