一个苯甲酸衍生物在制备抗细菌药物中的应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸在制备以栖热菌门thermusparvatiensis镁离子转运体(thermusparvatiensisco²⁺resistancec,tpcorc)为靶标的药物中的应用，尤其是3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸在制备以tpcorc为靶标的抗细菌药物中的应用。

(二)

背景技术：

细菌感染是威胁全球人类健康的严重疾病之一。据《世界卫生组织简报》2016；94:638-639，“目前面临的一个威胁是，引起感染和疾病的细菌、寄生虫和病毒可能会对于抗微生物药物产生广泛耐药性，进而使世界失去有效的抗微生物药物，一些从前可以治愈的感染将会致患者于死地。”估计2016年全球约有70万人死亡可归咎于抗微生物药物耐药性问题。35年后，每年死亡人数将升至1000万人。因此，寻找新型、有效的抗生素药物是急需解决的问题。

tpcorc是一种表达在(thermusparvatiensis，tp)菌细胞膜上的镁离子转运体。而镁离子则是在生物体内含量最高的二价阳离子，通过结合三磷酸腺苷(atp)，在离子通道门控、细胞分裂周期调控、以及代谢调控等各种生命活动中发挥重要作用。tpcorc蛋白在调控细菌体内镁离子的动态平衡起到了重要的作用，可能作为抗生素药物的新的作用靶点。tpcorc蛋白的氨基酸序列为mdrppsrwllllalgtpalaqgeaaspenpwlwavlvlllalsaffsasetaittlypwklkelaeskngpfrllaeditrflttilvgnnlvniaatalvtelatqafgsagvgvatgamtflilffgeitpkslavhhaeaiarlaawpiyglsvlfypvgrffslvsggllrllgleprgtplvseeelklilagaeesgaiqpqeeemihsileleetpvreimtprvemvaiedeatledllalyrehrysrvpvresvdhivgvayakdlldyyceedlkgrtvasithppyfvpenmdawsllkelrrrkvhmaivvdefggtaglvtledvieeivgeiydetdepedaairrlpdgslsiqaqtpidevsealgvelpegeydtlsgflyalfgripsvgesvewqgfrfvvesadqrriervrverlvehgeg。

3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸，其结构式为：

该化合物的分子式为c28h26n2o5，分子量为470.52，cas编号为312621-87-7。目前尚未有关于此化合物的活性报道。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的在于提供3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸的新用途，即3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸在制备以tpcorc为靶标的药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸在制备以镁离子通道蛋白为靶标的药物中的应用。

优选地，所述镁离子通道蛋白为栖热菌门thermusparvatiensis镁离子转运体(tpcorc)。

本申请人经实验研究发现，该化合物能有效抑制tpcorc的活性，并且其能作为tpcorc的抑制剂，可发展为细菌感染的预防及治疗药物。

具体的，本发明还提供了所述3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸在制备用于抑制细菌生长和/或杀死细菌的药物中的应用。

具体的，本发明还提供了所述3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸在制备以镁离子通道蛋白为靶标的用于抑制细菌生长和/或杀死细菌的药物中的应用；所述镁离子通道蛋白优选为栖热菌门thermusparvatiensis镁离子转运体(tpcorc)。

本发明化合物对tpcorc的半数有效抑制浓度(ic50)的测定结果见图1。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含选自3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸、及其盐、水合物和溶剂合物中的一种或多种以及药学上可接受的载体。

该化合物添加药物可接受的载体后，可制成常规的剂型如片剂、颗粒剂、针剂等。

本发明还提供了所述的药物组合物在制备以镁离子通道蛋白为靶标的药物中的应用。

本文所用术语“盐”包括3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸与碱形成的盐，包括药学上可接受的盐，所述碱包括：碱金属氢氧化物，例如氢氧化钠和氢氧化钾；碱土金属氢氧化物，例如钙、钡、镁的氢氧化物；有机碱如n-甲基-d-葡萄糖胺、胆碱三(羟甲基)氨基-甲烷、l-精氨酸、l-赖氨酸、n-乙基哌啶、二苄胺等。对合适的盐的综述参见stahl和wermuth的《药学盐手册：性质、选择和使用》(handbookofpharmaceuticalsalts：properties，selection，anduse)(wiley-vch，weinheim，德国，2002)。

术语“溶剂合物”用于描述包含本发明化合物以及化学计量的一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如乙醇)的分子复合物。当所述溶剂是水时采用术语“水合物”。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明对已知化合物3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸发掘了新的医疗用途，开拓了新的应用领域。

(2)本发明发现3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸是tpcorc的第一个抑制剂。

(3)细菌常发生变异而产生耐药性，已有多重耐药的报道。3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸抑制细菌的机制与现有药物不同，可供临床治疗选择使用。

(四)附图说明

图1为化合物3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸阻碍体外重组tpcorc组织胱硫醚-β-合成酶(cystathionineβ-synthase，cbs)结构域与mant-atp结合实验中结合率—浓度曲线图；纵坐标为结合率(％)，横坐标为化合物浓度(m)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：化合物的tpcorc活性

1、实验材料

(1)主要试剂：3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸(荷兰specs公司，http://www.specs.net)。

mant-atp三乙铵盐溶液(西格玛奥德里奇公司，产品编号：18723)tpcorccbs结构域蛋白是tpcorc蛋白第228个氨基酸到第348个氨基酸之间的区域，tpcorccbs结构域蛋白的氨基酸序列为mtprvemvaiedeatledllalyrehrysrvpvyresvdhivgvayakdlldyyceedlkgrtvasithppyfvpenmdawsllkelrrrkvhmaivvdefggtaglvtledvieeivgeiyde。本发明实施例中的tpcorccbs结构域蛋白是利用基因tpcorc，由申请人克隆至t7载体，在rosseta大肠杆菌中体外表达后，通过组氨酸标签过镍柱纯化，后过阴离子交换柱而得到的。

(2)主要仪器：多功能酶标仪(美国伯腾仪器公司，citation3)。

2、实验方法

(1)准备测定样品

tpcorc的cbs结构域为其atp门控的结合位点，直接影响其镁离子转运活性。mant-atp为atp荧光类似物，mant-atp和cbs结构域的结合可通过激发cbs结构域的色氨酸，经荧光共振能量转移(fret)，继续激发mant-atp而检测到。实验重复数n＝3。

1)准备反应样品，其中包括：大肠杆菌体外表达纯化的tpcorccbs结构域，检测时使用的最终浓度为1μm。

2)向微孔板中，每孔加入反应缓冲液(终浓度为：50mmhepesph7.0,100mmkcl，5mmmgcl2,0.05％(w:v)，十二烷基-β-d-麦芽糖苷(n-dodecyl-beta-d-maltopyranoside))。

3)向微孔板中加入tpcorccbs结构域蛋白(终浓度为1μm)；加入溶解在dmso溶液中的3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸，终浓度分别为0，0.3，1，3，10，30，100，250μm；再加入mant-atp三乙铵盐溶液(终浓度为1μm)。另外设置对照孔，向步骤2)的微孔板里加入dmso溶液(2.5％(v:v))。

4)避光室温保存，置于摇床上混匀1小时。

(2)酶标仪测定

利用多功能酶标仪进行测定，激发光波长为280nm，测定波长为450nm的发射光强度。

(3)计算mant-atp结合率

计算mant-atp结合率(％)＝3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸添加孔的荧光强度/dmso对照孔的荧光强度×100％。

3、实验结果

结果表明，3-(5-(10-乙酰基-3,3-二甲基-1-氧-2,3,4,5,10,11-六氢-1h-二苯并[b,e][1,4]二氮杂-11-基)呋喃-2-基)苯甲酸对tpcorc结合mant-atp抑制作用明显，并呈剂量依赖性，计算其ic50为30μm，结果见图1。

sequencelisting

<110>中国科学院上海药物研究所

复旦大学

<120>一个苯甲酸衍生物在制备抗细菌药物中的应用

<130>di18-8143-xc47

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>443

<212>prt

<213>artificial

<220>

<221>chain

<222>(1)..(443)

<223>人工序列

<400>1

metaspargproproserargtrpleuleuleuleualaleuglythr

151015

proalaleualaglnglyglualaalaserprogluasnprotrpleu

202530

trpalavalleuvalleuleuleualaleuseralaphepheserala

354045

sergluthralailethrthrleutyrprotrplysleulysgluleu

505560

alagluserlysasnglypropheargleuleualagluaspilethr

65707580

argpheleuthrthrileleuvalglyasnasnleuvalasnileala

859095

alathralaleuvalthrgluleualathrglnalapheglyserala

100105110

glyvalglyvalalathrglyalametthrpheleuileleuphephe

115120125

glygluilethrprolysserleualavalhishisalaglualaile

130135140

alaargleualaalatrpproiletyrglyleuservalleuphetyr

145150155160

provalglyargphepheserleuvalserglyglyleuleuargleu

165170175

leuglyleugluproargglythrproleuvalsergluglugluleu

180185190

lysleuileleualaglyalaglugluserglyalaileglnprogln

195200205

glugluglumetilehisserileleugluleuglugluthrproval

210215220

arggluilemetthrproargvalglumetvalalailegluaspglu

225230235240

alathrleugluaspleuleualaleutyrarggluhisargtyrser

245250255

argvalprovalarggluservalasphisilevalglyvalalatyr

260265270

alalysaspleuleuasptyrtyrcysglugluaspleulysglyarg

275280285

thrvalalaserilethrhisproprotyrphevalprogluasnmet

290295300

aspalatrpserleuleulysgluleuargargarglysvalhismet

305310315320

alailevalvalaspglupheglyglythralaglyleuvalthrleu

325330335

gluaspvalileglugluilevalglygluiletyraspgluthrasp

340345350

gluprogluaspalaalaileargargleuproaspglyserleuser

355360365

ileglnalaglnthrproileaspgluvalserglualaleuglyval

370375380

gluleuprogluglyglutyraspthrleuserglypheleutyrala

385390395400

leupheglyargileproservalglygluservalglutrpglngly

405410415

pheargphevalvalgluseralaaspglnargargilegluargval

420425430

argvalgluargleuvalgluhisglyglugly

435440

<210>2

<211>124

<212>prt

<213>artificial

<220>

<221>chain

<222>(1)..(124)

<223>人工序列

<400>2

metthrproargvalglumetvalalailegluaspglualathrleu

151015

gluaspleuleualaleutyrarggluhisargtyrserargvalpro

202530

valtyrarggluservalasphisilevalglyvalalatyralalys

354045

aspleuleuasptyrtyrcysglugluaspleulysglyargthrval

505560

alaserilethrhisproprotyrphevalprogluasnmetaspala

65707580

trpserleuleulysgluleuargargarglysvalhismetalaile

859095

valvalaspglupheglyglythralaglyleuvalthrleugluasp

100105110

valileglugluilevalglygluiletyraspglu

115120