本发明涉及一种以融合干扰素为活性成分的嚼糖剂型药物。
背景技术：
：包被是药剂学中最常用的技术之一，所谓包被是指在特定设备中按特定工艺将能成膜的材料涂覆在药物固体制剂外表面，使其干燥后成为紧密黏附在表面的一层或数层不同厚薄、不同弹性的多功能保护层，这个多功能保护层就叫做包被。根据包被物料不同可以分为粉末包被、微丸包被、颗粒包被、片剂包被、胶囊包被；根据包被材料不同分为糖包被、半薄膜包被、薄膜包被(以种类繁多的高分子材料为基础，包括肠溶包被)、特殊材料包被(如硬脂酸、石蜡、多聚糖)。养猪业中，猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪流感等多种病毒性传染病多发。猪病疫苗种类繁多且免疫频繁，仍不能有效预防疾病的暴发与流行。提高疫苗免疫效力，研发高效、安全的猪病防治用药成为养猪业中的迫切的需要。干扰素(interferon，ifn)最初于1957年由英国科学家isaacs研究禽流感病毒的干扰现象时被发现，是一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，由病毒及其它种类的干扰素诱导剂来刺激内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞所产生，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及诱导分化等活性。干扰素作用的发挥并不是直接作用于病毒，而是刺激细胞产生多种广谱抗病毒蛋白，可通过直接或间接途径发挥抗病毒作用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种以融合干扰素为活性成分的嚼糖剂型药物。本发明提供了一种产品，是将包被载体、液相体系和特异蛋白质混匀后静置得到的；所述产品在低温状态下为固态；所述包被载体为具有促使液相体系低温凝固的物质；所述液相体系具有溶解包被载体和特异蛋白质的功能；所述特异蛋白质包括如下两个区段：猪poifnλ1蛋白和猪il2蛋白。所述低温为大于0℃小于8℃的温度。所述低温为4℃。所述包被载体为果糖、麦芽糖或大豆磷脂。所述液相体系为生理盐水。所述特异蛋白质还包括连接肽，连接肽位于猪poifnλ1蛋白和猪il2蛋白之间。猪poifnλ1蛋白如序列表的序列1第1-172位氨基酸残基或序列表的序列3第1-172位氨基酸残基所示。猪il2蛋白如序列表的序列1第183-316位氨基酸残基或序列表的序列3第183-316位氨基酸残基所示。所述特异蛋白质为蛋白质甲或蛋白质乙。蛋白质甲如序列表的序列1或序列表的序列3所示。蛋白质乙为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)含有蛋白质甲的融合蛋白；(a2)在蛋白质甲的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a3)在蛋白质甲的末端连接标签得到的融合蛋白。包被载体和特异蛋白质的质量配比为1：1。产品中包被载体的质量百分含量为0.05mg/kg。产品中特异蛋白质的质量百分含量为0.05mg/kg。所述产品为嚼糖剂型药物。所述产品的功能为预防猪病毒性传染病。本发明还保护一种制备产品的方法，包括如下步骤：用液相体系溶解包被载体，得到溶液甲；用液相体系溶解特异蛋白质，得到溶液乙；将溶液甲和溶液乙混匀，然后低温静置直至凝固，得到产品；所述包被载体为具有促使液相体系低温凝固的物质；所述液相体系具有溶解包被载体和特异蛋白质的功能；所述特异蛋白质包括如下两个区段：猪poifnλ1蛋白和猪il2蛋白。所述低温为大于0℃小于8℃的温度。所述低温为4℃。所述包被载体为果糖、麦芽糖或大豆磷脂。所述液相体系为生理盐水。所述特异蛋白质还包括连接肽，连接肽位于猪poifnλ1蛋白和猪il2蛋白之间。猪poifnλ1蛋白如序列表的序列1第1-172位氨基酸残基或序列表的序列3第1-172位氨基酸残基所示。猪il2蛋白如序列表的序列1第183-316位氨基酸残基或序列表的序列3第183-316位氨基酸残基所示。所述特异蛋白质为蛋白质甲或蛋白质乙。蛋白质甲如序列表的序列1或序列表的序列3所示。蛋白质乙为如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)含有蛋白质甲的融合蛋白；(a2)在蛋白质甲的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a3)在蛋白质甲的末端连接标签得到的融合蛋白。包被载体和特异蛋白质的质量配比为1：1。产品中包被载体的质量百分含量为0.05mg/kg。产品中特异蛋白质的质量百分含量为0.05mg/kg。溶液甲中，包被载体的浓度为0.1mg/kg。溶液乙中，特异蛋白质的浓度为0.1mg/kg。溶液甲和溶液乙等体积混合。所述产品为嚼糖剂型药物。所述产品的功能为预防猪病毒性传染病。所述方法制备得到的产品也属于本发明的保护范围。所述产品为嚼糖剂型药物。所述产品的功能为预防猪病毒性传染病。本发明还保护以上任一所述产品在制备用于预防猪病毒性传染病的药物中的应用。本发明还保护一种用于预防猪病毒性传染病的药物，包括以上任一所述产品。本发明还保护以上任一所述产品的应用，为如下(b1)或(b2)：(b1)作为猪免疫增强剂；(b2)制备猪免疫增强剂。以上任一所述猪病毒性传染病为猪流感病毒引起的猪流感。所述猪流感病毒为h1n1猪流感病毒。所述h1n1猪流感病毒为a/california/04/2009a(h1n1)毒株。以上任一所述猪为长白猪。本发明对于猪病毒性传染病的防控具有重大应用推广价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。vsv病毒(水泡性口炎病毒)：中国兽医药品监察所。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、重组菌的构建以及目的蛋白的制备一、重组质粒的构建将序列表的序列2所示的双链dna分子插入pet28a(+)载体的ndei和bamhi酶切位点之间，得到重组质粒pet28a-poifnλ1-il2。根据测序结果，对重组质粒pet28a-poifnλ1-il2进行结构描述如下：在pet28a(+)载体的ndei和bamhi酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的dna分子。序列表的序列2所示的dna分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为优化后poifnλ1-il2融合蛋白。序列表的序列1中，第1-172位氨基酸残基组成优化后的猪poifnλ1蛋白，第183-316位氨基酸残基组成优化后的猪il2蛋白。将序列表的序列4所示的双链dna分子插入pet28a(+)载体的ndei和bamhi酶切位点之间，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在pet28a(+)载体的ndei和bamhi酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的dna分子。序列表的序列4所示的dna分子编码序列表的序列3所示的蛋白质。将序列表的序列3所示的蛋白质命名为优化前poifnλ1-il2融合蛋白。序列表的序列3中，第1-172位氨基酸残基组成优化前的猪poifnλ1蛋白，第183-316位氨基酸残基组成优化前的猪il2蛋白。将序列表的序列5所示的双链dna分子插入pet28a(+)载体的ndei和bamhi酶切位点之间，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在pet28a(+)载体的ndei和bamhi酶切位点之间插入了序列表的序列5所示的dna分子。序列表的序列5所示的dna分子编码优化前的猪poifnλ1蛋白。二、重组菌的构建和制备目的蛋白的能力比较1、重组菌的获得将重组质粒pet28a-poifnλ1-il2导入大肠杆菌bl-21(de3)，得到68株重组菌。2、各株重组菌制备目的蛋白的能力比较分别将步骤1制备的68株重组菌进行如下步骤：(1)将重组菌单菌落接种至3ml含0.1mg/ml卡那霉素的液体lb培养基，37℃、200rpm振荡培养12小时，得到种子液。(2)将20ml步骤(1)得到的种子液接种至1980ml含0.1mg/ml卡那霉素的液体lb培养基，37℃、200rpm振荡培养至体系od600nm值为0.6，加入iptg并使其浓度为1mmol/l，然后37℃、200rpm振荡培养4h。(3)完成步骤(2)后，将整个培养体系离心收集菌体，用ph8.0的pbs缓冲液悬浮，然后进行超声破碎(300w，超声6s停12s，99次)，然后5000g离心10分钟，收集沉淀(包涵体)。(4)取步骤(3)得到的沉淀，依次用washingbuffer和resuspensionbuffer洗涤。washingbuffer(ph8.0)：含0.5％triton-100、50mmtris、300mmnacl、10mmedta、10mmdtt，余量为水。resuspensionbuffer(ph8.0)：含50mmtris、100mmnacl、10mmedta、10mmdtt，余量为水。(5)完成步骤(4)后，用dissolutionbuffer完全溶解包涵体，然后4℃、10000g离心20分钟，收集上清液。dissolutionbuffer(ph8.0)：含6mgua-hcl、10％甘油、50mmtris、100mmnacl、10mmedta、10mmdtt，余量为水。(6)取步骤(5)得到的上清液，缓慢滴加到refoldingbuffer中，4℃、200rpm搅拌24h。refoldingbuffer(ph8.0)：含100mmtris、400mml-arghcl、2mmedta、5mmgsh、0.5mmgssg，余量为水。(7)收集完成步骤(6)的整个体系，在4℃条件下进行浓缩，浓缩至20ml左右时加分子筛缓冲液至100ml，然后继续在4℃条件下进行浓缩，浓缩至20ml左右时加分子筛缓冲液至100ml，然后继续在4℃条件下进行浓缩，浓缩至4ml，即为浓缩液。分子筛缓冲液(ph8.0)：含20mmtris、150mmnacl，余量为水。(8)取1ml步骤(7)得到的浓缩液，4℃、12000rpm离心10min，用superdex7510/300gl分子筛层析柱纯化。柱体积为24ml；填充物为葡聚糖凝胶g15100-200。洗脱液(ph8.0)：含20mmtris、150mmnacl，余量为水。洗脱液流速：0.3ml/min。收集保留体积为12.8ml-15.1ml的过柱后溶液，即为目的蛋白溶液。将68株重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，均显示单一条带，即得到的电泳纯的目的蛋白。目的蛋白即优化后poifnλ1-il2融合蛋白。检测将各个重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度，67株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度均为3.7-4.0mg/ml之间，1株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度为24.1mg/ml(将该株重组菌命名为大肠埃希氏菌bl21/pet28a-polfnλ1-il2)。3、重组菌的保藏大肠埃希氏菌(escherichiacoli)bl21/pet28a-polfnλ1-il2，已于2018年06月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.15920。三、重组菌的构建和制备目的蛋白的能力比较1、重组菌的获得将重组质粒甲导入大肠杆菌bl-21(de3)，得到20株重组菌。2、各株重组菌制备目的蛋白的能力比较分别将步骤1制备的20株重组菌进行检测，方法同步骤二的2。将20株重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，均显示单一条带，即得到的电泳纯的目的蛋白。目的蛋白即优化前poifnλ1-il2融合蛋白。检测将各个重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度，20株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度均为2.5-2.7mg/ml之间。将20株重组菌中制备目的蛋白能力最强的一株重组菌命名为重组菌甲。四、重组菌的构建及其制备目的蛋白的能力比较1、重组菌的获得将重组质粒乙导入大肠杆菌bl-21(de3)，得到20株重组菌。2、各株重组菌制备目的蛋白的能力比较分别将步骤1制备的20株重组菌进行检测，方法同步骤二的2。将20株重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，均显示单一条带，即得到的电泳纯的目的蛋白。目的蛋白即优化前猪poifnλ1蛋白。检测将各个重组菌进行上述步骤得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度，20株重组菌得到的目的蛋白溶液中的蛋白浓度均为1.1-1.3mg/ml之间。将20株重组菌中制备目的蛋白能力最强的一株重组菌命名为重组菌乙。步骤二、步骤三和步骤四的结果表明：采用相同的表达载体和宿主菌，优化前poifnλ1-il2融合蛋白的产量显著高于优化前猪poifnλ1蛋白的产量，优化后poifnλ1-il2融合蛋白的产量显著高于优化前poifnλ1-il2融合蛋白的产量。实施例2、嚼糖剂型药物的制备和应用本实施例中所用到的优化后poifnλ1-il2融合蛋白为实施例1的步骤二中采用大肠埃希氏菌bl21/pet28a-polfnλ1-il2制备得到的。本实施例中所用到的优化前poifnλ1-il2融合蛋白为实施例1的步骤三中采用重组菌甲制备得到的。本实施例中所用到的优化前猪poifnλ1蛋白为实施例1的步骤四中采用重组菌乙制备得到的。本实施例中所用的果糖级别为分析纯。本实施例中所用的麦芽糖级别为分析纯。本实施例中所用的大豆磷脂为市售的大豆磷脂粉，产品链接为https://detail.1688.com/offer/44882170792.html。分别将果糖、麦芽糖和大豆磷脂作为包被载体。一、嚼糖剂型药物的制备1、以生理盐水为溶剂，制备浓度为0.1mg/kg的包被载体溶液。2、以生理盐水为溶剂，制备蛋白浓度为0.1mg/kg的目的蛋白溶液。3、将步骤1制备的包被载体溶液和步骤2制备的目的蛋白溶液等体积混匀，得到混合液。4、将步骤3得到的混合液4℃静置，自然凝固，然后切割成正方体状，即为嚼糖。每块嚼糖为50g。嚼糖4℃保存。目的蛋白为优化后poifnλ1-il2融合蛋白，包被载体为果糖，得到的嚼糖为果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化后poifnλ1-il2融合蛋白，包被载体为麦芽糖，得到的嚼糖为麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化后poifnλ1-il2融合蛋白，包被载体为大豆磷脂，得到的嚼糖为大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化前poifnλ1-il2融合蛋白，包被载体为果糖，得到的嚼糖为果糖-优化前poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化前poifnλ1-il2融合蛋白，包被载体为麦芽糖，得到的嚼糖为麦芽糖-优化前poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化前poifnλ1-il2融合蛋白，包被载体为大豆磷脂，得到的嚼糖为大豆磷脂-优化前poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化前猪poifnλ1蛋白，包被载体为果糖，得到的嚼糖为果糖-优化前猪poifnλ1蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化前猪poifnλ1蛋白，包被载体为麦芽糖，得到的嚼糖为麦芽糖-优化前猪poifnλ1蛋白-嚼糖。目的蛋白为优化前猪poifnλ1蛋白，包被载体为大豆磷脂，得到的嚼糖为大豆磷脂-优化前猪poifnλ1蛋白-嚼糖。二、嚼糖剂型药物的应用试验动物为长白猪。将实验动物分成10组，每组24只，分别处理如下：第一组：试验第1-7天饲喂果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第二组：试验第1-7天饲喂麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第三组：试验第1-7天饲喂大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第四组：试验第1-7天饲喂果糖-优化前poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第五组：试验第1-7天饲喂麦芽糖-优化前poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第六组：试验第1-7天饲喂大豆磷脂-优化前poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第七组：试验第1-7天饲喂果糖-优化前猪poifnλ1蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第八组：试验第1-7天饲喂麦芽糖-优化前猪poifnλ1蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第九组：试验第1-7天饲喂大豆磷脂-优化前猪poifnλ1蛋白-嚼糖，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗；第十组：试验第1-7天饲喂安慰剂(与嚼糖等质量的淀粉块)，每日3次(每次间隔8小时)，每次5颗。试验第21天进行攻毒。攻毒采用鼻内接种的方式，每头试验动物接种1ml病毒液。病毒液为猪流感病毒a/california/04/2009a(h1n1)的病毒液，1ml病毒液中猪流感病毒a/california/04/2009a(h1n1)的含量为1000pfu。试验第24-26天，统计各组的流感发病率。在该时间段出现如下三个症状中两个以上症状的猪判断为发病猪：①不采食；②呼吸困难；③体温为40.5℃以上。第一组的流感发病率为8.33％。第二组的流感发病率为12.5％。第三组的流感发病率为12.5％。第四组的流感发病率为20.83％。第五组的流感发病率为25％。第六组的流感发病率为25％。第七组的流感发病率为41.67％。第八组的流感发病率为50％。第九组的流感发病率为50％。第十组的流感发病率为100％。实施例3、干扰素活性检测细胞培养液：含10％fbs的dmem培养液。一、干扰素活性检测方法1、细胞制备取生长良好的pk-15细胞，消化后用细胞培养液悬浮，得到细胞浓度为5×105个/ml的细胞悬液；将细胞悬液加至96孔细胞培养板(100μl/孔)，在37℃、5％co2条件下培养8-10h使其成为单层细胞。2、采用细胞培养液为溶剂，先将待测物质溶解或稀释，使蛋白浓度为0.001mg/ml，作为母液，再将母液进行4倍梯度稀释，稀释6个梯度，得到各种稀释液。3、取完成步骤1的细胞培养板，吸弃上清；3个阳性对照孔加入细胞培养液(100μl/孔)，3个阴性对照孔加入细胞培养液(100μl/孔)，其它孔加入步骤2得到的稀释液(100μl/孔)，每种稀释液设置3个复孔；然后在37℃、5％co2条件下培养12-15h。4、取vsv病毒，用无血清dmem培养液稀释，得到病毒浓度为1000tcid50/ml的病毒稀释液。5、取完成步骤3的细胞培养板，吸弃上清；3个阳性对照孔加入步骤4制备的病毒稀释液(100μl/孔)，3个阴性对照孔加入无血清dmem培养液(100μl/孔)，其它孔加入步骤4制备的病毒稀释液(100μl/孔)；然后在37℃、5％co2条件下培养24h。6、取完成步骤5的细胞培养板，吸弃上清，加入结晶紫染色液(100μl/孔)，然后室温放置30min。7、取完成步骤6的细胞培养板，吸弃上清，用双蒸水冲洗，然后加入脱色液(100μl/孔)，然后室温放置10min。8、利用酶标仪测定od570nm值并记录。以能抑制50％细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用reed-muench法计算干扰素效价，即能抑制50％细胞病变的稀释倍数，结果见表1。表1运用reed-muench法计算干扰素效价x：阴性对照孔的od570平均值；y：阳性对照孔的od570平均值。根据上表计算各项值，最后根据g项按照如下公式计算干扰素效价(假设上述计算中g4项计算值大于0.5，而g5项计算值小于0.5)：待测物质的干扰素效价(u/0.001mg)＝预先稀释倍数×4(4+(g4-0.5)/(g4-g5))。二、嚼糖剂型药物的干扰素效价本步骤中所用的嚼糖实施例2的步骤一制备的果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖、麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖、大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖。待测物质分别为如下：新鲜制备的果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖、将果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖4℃保存12个月、将果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖25℃保存3个月、新鲜制备的麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖、将麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖4℃保存12个月、将麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖25℃保存3个月、新鲜制备的大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖、将大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖4℃保存12个月、将大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖25℃保存3个月、按照步骤一的方法检测干扰素活性。待测物质的干扰素效价见表2。表2新鲜制备4℃、12个月25℃、3个月果糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖1.35×105u/mg1.30×105u/mg1.30×105u/mg麦芽糖-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖1.0×105u/mg0.95×105u/mg0.85×105u/mg大豆磷脂-优化后poifnλ1-il2融合蛋白-嚼糖0.95×105u/mg0.85×105u/mg0.75×105u/mgsequencelisting<110>中国科学院微生物研究所北京天之泰生物科技有限公司<120>一种以融合干扰素为活性成分的嚼糖剂型药物<130>gncyx181505<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>316<212>prt<213>artificialsequence<400>1glyprovalprothrphelysprothrthrthrarglysglycyshis151015metglyglncysglnserleuserproglngluleulysglyphelys202530lysalalysaspalaleuglugluserleuserleulysasntrpser354045cysserserproleupheproargthrargaspleuargglnleugln505560valtrpgluargleuvalalaleuglualagluleuaspleuthrleu65707580lysvalleuargalaalaalaaspserserleuglyvalthrleuasp859095glnproleuargthrleuhishisilehisvalgluleuglnalacys100105110ileargalaglnprothralaglyserargleuglnglyargleuasn115120125histrpleuhisargleuglnglualathrlyslysgluserglngly130135140pheleuglualaservalthrpheasnleuphehisleuleuvalarg145150155160aspleuargservalthrserglyaspleuhisileglyglyglygly165170175serglyglyglyglyseralaprothrserserserthrlysasnthr180185190lyslysglnleugluproleuleuleuaspleuglnserleuleulys195200205gluvallysasntyrgluasnalaaspleuserargmetleuthrphe210215220lysphetyrmetprolysglnalathrgluleulyshisleuglncys225230235240leuvalglugluleulysalaleugluglyvalleuasnleuglygln245250255serlysasnseraspseralaasnilelysglusermetasnasnile260265270asnvalthrvalleugluleulysglysergluthrsercysglucys275280285glutyraspaspgluthrvalthralavalglupheleuasnlystrp290295300ilethrphecysglnseriletyrserthrleuthr305310315<210>2<211>951<212>dna<213>artificialsequence<400>2ggtccggttccgaccttcaaaccgaccaccacccgtaaaggttgccacatgggtcagtgc60cagtctctgtctccgcaggaactgaaaggtttcaaaaaagctaaagacgctctggaagaa120tctctgtctctgaaaaactggtcttgctcttctccgctgttcccgcgtacccgtgacctg180cgtcagctgcaggtttgggaacgtctggttgctctggaagctgaactggacctgaccctg240aaagttctgcgtgctgctgctgactcttctctgggtgttaccctggaccagccgctgcgt300accctgcaccacatccacgttgaactgcaggcttgcatccgtgctcagccgaccgctggt360tctcgtctgcagggtcgtctgaaccactggctgcaccgtctgcaggaagctaccaaaaaa420gaatctcagggtttcctggaagcttctgttaccttcaacctgttccacctgctggttcgt480gacctgcgttctgttacctctggtgacctgcacatcggcggtggtggtagcggcggtggt540ggtagtgctccgacctcttcttctaccaaaaacaccaaaaaacagctggaaccgctgctg600ctggacctgcagagcctgctgaaagaagttaaaaactacgaaaacgctgacctgtctcgt660atgctgaccttcaaattctacatgccgaaacaggctaccgaactgaaacacctgcagtgc720ctggttgaagaactgaaagctctggaaggtgttctgaacctgggtcagtctaaaaactct780gactctgctaacatcaaagaatctatgaacaacatcaacgttaccgttctggaactgaaa840ggttctgaaacctcttgcgaatgcgaatacgacgacgaaaccgttaccgctgttgaattc900ctgaacaaatggatcaccttctgccagtctatctactctaccctgacctaa951<210>3<211>316<212>prt<213>artificialsequence<400>3glyprovalprothrphelysprothrthrthrarglysglycyshis151015metglyglnpheglnserleuserproglngluleulysglyphelys202530lysalalysaspalaleuglugluserleuserleulysasntrpser354045cysserserproleupheproargthrargaspleuargglnleugln505560valtrpgluargleuvalalaleuglualagluleuaspleuthrleu65707580lysvalleuargalaalaalaaspserserleuglyvalthrleuasp859095glnproleuargthrleuhishisilehisvalgluleuglnalacys100105110ileargalaglnprothralaglyserargleuglnglyargleuasn115120125histrpleuhisargleuglnglualathrlyslysgluserglngly130135140cysleuglualaservalthrpheasnleuphehisleuleuvalarg145150155160aspleuargservalthrserglyaspleuhisileglyglyglygly165170175serglyglyglyglyseralaprothrserserserthrlysasnthr180185190lyslysglnleugluproleuleuleuaspleuglnleuleuleulys195200205gluvallysasntyrgluasnalaaspleuserargmetleuthrphe210215220lysphetyrmetprolysglnalathrgluleulyshisleuglncys225230235240leuvalglugluleulysalaleugluglyvalleuasnleuglygln245250255serlysasnseraspseralaasnilelysglusermetasnasnile260265270asnvalthrvalleugluleulysglysergluthrserpheglucys275280285glutyraspaspgluthrvalthralavalglupheleuasnlystrp290295300ilethrphecysglnseriletyrserthrleuthr305310315<210>4<211>951<212>dna<213>artificialsequence<400>4ggtccggttccgaccttcaaaccgaccaccacccgtaaaggttgccacatgggtcagttc60cagtctctgtctccgcaggaactgaaaggtttcaaaaaagctaaagacgctctggaagaa120tctctgtctctgaaaaactggtcttgctcttctccgctgttcccgcgtacccgtgacctg180cgtcagctgcaggtttgggaacgtctggttgctctggaagctgaactggacctgaccctg240aaagttctgcgtgctgctgctgactcttctctgggtgttaccctggaccagccgctgcgt300accctgcaccacatccacgttgaactgcaggcttgcatccgtgctcagccgaccgctggt360tctcgtctgcagggtcgtctgaaccactggctgcaccgtctgcaggaagctaccaaaaaa420gaatctcagggttgcctggaagcttctgttaccttcaacctgttccacctgctggttcgt480gacctgcgttctgttacctctggtgacctgcacatcggcggtggtggtagcggcggtggt540ggtagtgctccgacctcttcttctaccaaaaacaccaaaaaacagctggaaccgctgctg600ctggacctgcagctgctgctgaaagaagttaaaaactacgaaaacgctgacctgtctcgt660atgctgaccttcaaattctacatgccgaaacaggctaccgaactgaaacacctgcagtgc720ctggttgaagaactgaaagctctggaaggtgttctgaacctgggtcagtctaaaaactct780gactctgctaacatcaaagaatctatgaacaacatcaacgttaccgttctggaactgaaa840ggttctgaaacctctttcgaatgcgaatacgacgacgaaaccgttaccgctgttgaattc900ctgaacaaatggatcaccttctgccagtctatctactctaccctgacctaa951<210>5<211>519<212>dna<213>artificialsequence<400>5ggtccggttccgaccttcaaaccgaccaccacccgtaaaggttgccacatgggtcagttc60cagtctctgtctccgcaggaactgaaaggtttcaaaaaagctaaagacgctctggaagaa120tctctgtctctgaaaaactggtcttgctcttctccgctgttcccgcgtacccgtgacctg180cgtcagctgcaggtttgggaacgtctggttgctctggaagctgaactggacctgaccctg240aaagttctgcgtgctgctgctgactcttctctgggtgttaccctggaccagccgctgcgt300accctgcaccacatccacgttgaactgcaggcttgcatccgtgctcagccgaccgctggt360tctcgtctgcagggtcgtctgaaccactggctgcaccgtctgcaggaagctaccaaaaaa420gaatctcagggttgcctggaagcttctgttaccttcaacctgttccacctgctggttcgt480gacctgcgttctgttacctctggtgacctgcacatctaa519当前第1页12