Ingol型千金烷型二萜在逆转肿瘤多药耐药中的应用的制作方法

本发明属于植物药用成分和逆转肿瘤多药耐药技术领域，特别涉及ingol型千金烷型二萜的应用，可以起到逆转肿瘤多药耐药的效果。

背景技术

目前，肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，据世界卫生组织统计，2015年全球有880万人因为癌症而死亡，几乎占了全球死亡人数的1/6。虽然在临床中可以用手术、化疗等治疗癌症，但肿瘤多药耐药的现象目前已经成为临床治疗失败、预后不良等结果的主要原因。因此，开发可以逆转肿瘤多药耐药且毒性小、安全范围宽的调节剂已经成为医药行业工作者的焦点，而中国传统中药毒性较西药小，来源广，药效好；因此，利用提取分离技术从中国传统中药中得到逆转肿瘤多药耐药的化合物逐渐成为部分医药行业从事者的工作重点。

金刚纂(euphorbianeriifolial.)，大戟科植物，又名霸王鞭、五楞金刚，《中国植物志》有载：“茎叶捣烂外敷痈疖、疥癣，有毒，宜慎用。”现代药理学实验表明，金刚纂具有消肿止痛、清热解毒、敛疮生肌、止咳平喘、润肠通便的功效。而从金刚纂中分离得到的ingol型千金烷型二萜目前尚未发现在逆转肿瘤多药耐药的活性。

火殃簕(euphorbiaantiquorum)，大戟科植物，又名笋大黄、簕羊，主要分布在云南、广东、广西、四川、贵州等地。据古籍记载，火殃簕除了能够清热解毒、消炎利尿，还能治疗咳嗽、牙痛、痛风等疾病。而其活性成分主要以生物碱、二萜、三萜为主，其中，从火殃簕中分离得到的ingol型千金烷型二萜尚未见其在逆转肿瘤多药耐药的药理活性。

霸王鞭(euphorbiaroyleana)，大戟科植物，又名次金刚，活性成分以及药理活性与火殃簕相似。目前国内外对霸王鞭的研究主要集中在抗炎、抗菌以及免疫抑制等方面，尚未发现与调节肿瘤多药耐药活性相关的报道。ingol型千金烷型二萜是从霸王鞭中分离得到的单体化合物。目前尚未发现关于该类化合物能作为抗肿瘤药物或逆转肿瘤多药耐药的调节剂的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供ingol型千金烷型二萜新的医药用途，即在逆转肿瘤多药耐药中的应用。

所述应用是以ingol型千金烷型二萜为活性成分在逆转肿瘤多药耐药中的应用。

所述应用是以ingol型千金烷型二萜为活性成分与其它活性成分配合使用发挥逆转肿瘤多药耐药的药理作用，以ingol型千金烷型二萜为活性成分与其它抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇等配合使用发挥逆转肿瘤多药耐药的药理作用。

所述应用是以ingol型千金烷型二萜为主，加入硬脂酸镁等润滑剂、羧甲基淀粉钠等崩解剂、乳糖等填充剂以及其它辅料，制成胶囊、滴丸、片剂、注射剂等多种形式。

所述ingol型千金烷型二萜是从金刚纂(euphorbianeriifolia)、火殃簕(euphorbiaantiquorum)以及霸王鞭(euphorbiaroyleana)中分离得到，但不仅限于从上述三种植物中分离得到。

所述ingol型千金烷型二萜的化学结构如下所示：

本发明ingol型千金烷型二萜应用mtt实验表明，化合物对正常细胞没有细胞毒性，当化合物单独作用于肝癌耐药株(hepg2/adr)时，几乎不具有细胞毒性；当化合物与阿霉素联用时，化合物能有效逆转肝癌细胞株的多药耐药；当化合物的浓度为4μmol/l时，有一定的逆转肿瘤多药耐药活性；当化合物的浓度为20μmol/l时，逆转肿瘤多药耐药活性比较明显，阿霉素的ic50在5～50μmol/l。

本发明ingol型千金烷型二萜能够明显抑制人肝癌抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇等耐药株的增殖，能逆转肿瘤多药耐药，可以作为治疗肿瘤多药耐药的调节剂。

附图说明

图1为实施例4空白对照组hepg2/adr细胞株的显微电镜图；

图2为实施例4阳性对照组hepg2/adr细胞株的显微电镜图；

图3为实施例4ingol型千金烷型二萜(20μmol/l)与阿霉素(20μmol/l)联用时hepg2/adr细胞株的显微电镜图；

图4为实施例4ingol型千金烷型二萜单独作用于hepg2/adr细胞株时的细胞活度结果示意图；

图5为实施例4ingol型千金烷型二萜(20μmol/l)与阿霉素(20μmol/l)联用时hepg2/adr细胞株的细胞活度结果示意图；

图6为ingol型千金烷型二萜(4μmol/l)与不同浓度阿霉素联用作用于hepg2/adr细胞株时的细胞活度结果示意图；

图7为ingol型千金烷型二萜(20μmol/l)与不同浓度阿霉素联用作用于hepg2/adr细胞株时的细胞活度结果示意图。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中试剂如无特殊说明的，均为常规市售试剂或按常规方法制备的试剂。

实施例1

从金刚纂中分离得到ingol型千金烷型二萜，具体步骤如下：

(1)将干燥的金刚纂茎皮用粉碎机粉碎，用75％丙酮水溶液(75％表示体积浓度，全文涉及到百分含量均为体积浓度)室温浸泡3次，每次浸泡时间为24h，合并三次提取液后，减压蒸馏至没有丙酮味后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；

(2)将乙酸乙酯萃取物上6.5cm×120cm的mci柱进行层析分离，用30％、60％、75％、90％、100％甲醇水溶液依次进行洗脱，分别收集90％甲醇水溶液、75％甲醇水溶液、60％甲醇水溶液以及30％甲醇水溶液洗脱段的溶液；之后，将收集的90％甲醇水溶液洗脱液上硅胶柱，并用石油醚/乙酸乙酯进行梯度洗脱，两者的体积比依次为39:1、29:1、19:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5，收集洗脱液，经薄层色谱(tlc)分析合并为6个部分，并编号(frⅰ-1～frⅰ-6)，另外，将收集的75％甲醇水溶液与60％甲醇水溶液非黄酮部分合并，洗脱液上硅胶柱，并用石油醚/丙酮进行梯度洗脱，两者的体积比依次为80:1、49:1、29:1、19:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5，收集洗脱液，经tlc分析合并为5个部分，并编号(frⅱ-1～frⅱ-5)，frⅰ-4段位通过硅胶柱，用石油醚/乙酸乙酯(体积比依次为99:1、49:1、19:1、9:1、8:2)进行梯度洗脱，收集洗脱液，并编号(frⅰ-4-1～frⅰ-4-3)，之后将各分离液上硅胶柱，并用洗脱剂梯度洗脱后，最终hplc半制备得到ingol型千金烷型二萜，其结构如下所示(结构式5、6)。

将frⅱ-4分离液上硅胶柱，以石油醚/乙酸乙酯(体积比依次为19:1、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5)进行梯度洗脱，收集洗脱液，并编号(frⅱ-1～frⅱ-2)，之后，分别经制备tlc后得到样品，展开剂分别用不同比例的氯仿/异丙醇溶液，最终hplc半制备得到ingol型千金烷型二萜，其结构如下所示(结构式1、2、3、4)。

实施例2

从火殃簕中分离得到ingol型千金烷型二萜，具体步骤如下：

(1)取风干的火殃簕粉碎，在室温下用70％丙酮水溶液浸泡提取3次，每次浸泡24h，合并三次提取液，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；

(2)取乙酸乙酯萃取物上mci反向柱，用甲醇水溶液梯度洗脱，比例分别为30％、50％、70％、90％、100％，合并相同组分，得到ⅰ-ⅴ相，取ⅳ部分，经硅胶柱层析，可分成ⅳ-a和ⅳ-b两部分，取ⅳ-a，经sephadexlh-20色谱、hplc半制备，最终得到ingol型千金烷型二萜，其结构如下所示(结构式7、8、9)。

实施例3

从霸王鞭中分离得到ingol型千金烷型二萜，具体步骤如下：

(1)将干燥的霸王鞭粉碎后，用70％丙酮水溶液室温浸泡提取3次，每次浸泡时间为24h，合并三次提取液，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物；

(2)将乙酸乙酯萃取物上mci反向柱，并用30％、50％、70％、90％、100％甲醇水溶液依次进行洗脱，最终得到五段，编号a-e，取c段上硅胶柱，用石油醚/丙酮洗脱，可得到c-1、c-2、c-3、c-4四段，其中c-2经反向柱、制备薄层色谱、hplc半制备，最终得到ingol型千金烷型二萜，其结构如下所示(结构式10)，将c-3部分，通过硅胶柱层析、sephadexlh-20色谱、hplc半制备，得到ingol型千金烷型二萜，其结构如下所示(结构式10、11)。

实施例4

取实施例1、2、3制备得到的11个ingol型千金烷型二萜，进行逆转肿瘤多药耐药实验，具体步骤如下：

(1)取对数生长期的肝癌耐药株hepg2/adr细胞，接种于96孔板中，接种密度为1×10⁴个/孔，37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞贴壁后，将细胞分成空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和实验组:

①空白对照组加入完全培养基；

②阳性对照组选用维拉帕米与阿霉素联用，终浓度均为20μmol/l；

③阴性对照组为实施例1、2、3中得到的11个不同分子结构的ingol型千金烷型二萜单独使用，终浓度均为20μmol/l；

④实验组ⅰ为不同浓度的阿霉素(终浓度分别为40μmol/l，20μmol/l，5μmol/l，1.25μmol/l，0.3125μmol/l)与终浓度为4μmol/l的ingol型千金烷型二萜化合物联用；

实验组ⅱ为不同浓度的阿霉素(终浓度分别为40μmol/l，20μmol/l，5μmol/l，1.25μmol/l，0.3125μmol/l)与终浓度为20μmol/l的ingol型千金烷型二萜化合物联用；

(2)将步骤(1)的各组细胞继续培养48h后490nm进行检测，分别计算细胞活度(viability)、增殖抑制率(ir)、逆转倍数(rf)，其中，

细胞活度(viability)＝100％×实验组od值/阴性对照组od值；

增殖抑制率(ir)＝100％×(阴性对照组od值－实验组od值)/阴性对照组od值；

逆转倍数(rf)＝化合物ic50/阿霉素ic50。

图1为空白对照组hepg2/adr细胞株的显微电镜图，从图中可知，在光学倒置显微镜下，对hepg2/adr细胞株不进行任何处理时，细胞的形态图；本型细胞在培养皿支持物上呈现不规则多边形单层贴壁生长的特点，细胞中央有多个卵圆形细胞核，细胞间紧密相连。

图2为阳性对照组hepg2/adr细胞株的显微电镜图，从图中可知，在光学倒置显微镜下，维拉帕米与阿霉素联合作用于hepg2/adr细胞株时，细胞的形态图；本型细胞飘浮于培养皿支持物上方，胞质浓缩，胞体减小，并与周围细胞分离。

图3为ingol型千金烷型二萜(结构式为4，终浓度为20μmol/l)与阿霉素(终浓度为20μmol/l)联用时hepg2/adr细胞株的显微电镜图，从图中可知，在光学倒置显微镜下，ingol型千金烷型二萜与阿霉素联合作用于hepg2/adr细胞株时，细胞的形态图；本型细胞半飘浮于培养皿支持物上方，胞体减小，并与周围细胞分离。

图4为ingol型千金烷型二萜单独作用于hepg2/adr细胞株时的细胞活度结果示意图，即阴对照组，实施例1、2、3中得到的11个不同分子结构的ingol型千金烷型二萜单独使用，终浓度分别为20μmol/l，图中显示结果，单独使用ingol型千金烷型二萜在浓度为20μmol/l时对hepg2/adr细胞株的增殖无影响。

图5为ingol型千金烷型二萜(20μmol/l)与阿霉素(20μmol/l)联用时hepg2/adr细胞株时的细胞活度结果示意图，结果显示，ingol型千金烷型二萜在20μmol/l时与20μmol/l阿霉素联合用药时，明显抑制hepg2/adr细胞株的增殖。

图6为ingol型千金烷型二萜(4μmol/l)与不同浓度的阿霉素联合作用于hepg2/adr细胞株时的影响结果示意图，即实验组ⅰ的结果，ingol型千金烷型二萜均能明显抑制hepg2/adr细胞株的增殖。

图7为ingol型千金烷型二萜(20μmol/l)与不同浓度的阿霉素联合作用于hepg2/adr细胞株时的影响结果示意图，即实验组ⅱ的结果，ingol型千金烷型二萜均能明显抑制hepg2/adr细胞株的增殖，对比图6和图7可知，ingol型千金烷型二萜在使用时，存在一定的浓度依赖性。

实验结果显示，终浓度为20μmol/l的ingol型千金烷型二萜单独作用于肝癌耐药株hepg2/adr时，对肝癌耐药株hepg2/adr的增殖没有影响，4μmol/l的化合物与阿霉素联用时，能在一定程度上抑制肝癌耐药株hepg2/adr的增殖，阿霉素的ic50在10～80μmol/l范围内，逆转倍数为6～100；当20μmol/l化合物与阿霉素联用时，则能明显的抑制肿瘤的多药耐药，阿霉素的ic50在5～50μmol/l范围内，逆转倍数为10～150，总之，不同浓度的ingol型千金烷型二萜与不同浓度的阿霉素联用时，对肝癌耐药株hepg2/adr的增殖有不同的影响，即表现为不同的逆转倍数。

将阿霉素替换为紫杉醇等药物时，也可以得到和使用阿霉素同样的效果。