咪康唑在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及咪康唑在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

咪康唑为人工合成的1－苯乙基咪唑衍生物，是一种广谱抗真菌药物，对念珠菌、酵母菌、子囊菌、隐球菌、皮肤癣菌及其它藻类等具有抑制和杀灭作用。咪康唑作为咪唑类药物中的一种，其作用机理主要是通过干扰细胞色素cyp450的活性，来抑制真菌细胞膜中的主要固醇类-麦角固醇的生物合成，从而损伤真菌的细胞膜，以改变其通透性而使重要的胞内物质外漏。另外，咪康唑也可抑制真菌内三酰甘油和磷脂的生物合成，抑制其氧化酶和过氧化酶的活性，从而引起细胞内过氧化氢积聚导致细胞亚微结构变性和细胞坏死。

咪康唑于1968年获得专利，并于1971年批准用于医疗用途。它位列世界卫生组织的基本药物清单，是目前健康系统所需的最有效和最安全的药物之一。咪康唑在4μg/ml浓度时即可抑制大部分真菌生长，芽生菌属、组织浆胞菌属对其呈现高度敏感，隐球菌属、念珠菌属、球孢子菌属等亦对其敏感。另外，咪康唑对葡萄球菌、链球菌及炭疽杆菌等革兰阳性菌也有抗菌作用。目前医疗界主要将咪康唑用于深部真菌病治疗，对五官、阴道、皮肤等部位的真菌感染也有效。

肿瘤是一类严重危害人类身体健康的疾病，在全世界范围内，肿瘤是造成死亡的最重要原因之一。对肿瘤的研究，已成为人类社会关注的焦点。为了获得能够有效和安全地适用于癌症病人的抗肿瘤药物，人们已经付出了不懈的努力。随着人们对肿瘤细胞信号转导途径的不断深入，新型抗肿瘤药物的设计与研究越来越受到关注。但是，现有的抗肿瘤药物仍远远无法满足日益增长的癌症患者的需求，且目前市售的抗肿瘤药物均有各种不良反应，因此寻找新型的低副作用抗肿瘤药物成为生物医药领域的一大热点，而从已经批准的上市药物中挖掘其抗肿瘤活性也成了抗肿瘤药物发展的新方向。

技术实现要素：

本发明的目的是提供咪康唑在抗肿瘤中的新应用。咪康唑作为一种安全、有效、性质稳定、毒副作用小的药物，具有极高的临床使用价值，所述咪康唑，又名miconazole，结构如式(1)所示：

其相关性质如下：

【别名】双氯苯咪唑、霉可唑、monistat等

【英文名】miconazole

【分子式】c18h14cl14n2o

【分子量】416.12900

【cas号】22916-47-8

【性状】白色结晶粉末

本发明中，所述肿瘤可以是胰腺癌、肝癌、肺癌或者胃癌。

其中，所述胰腺癌细胞优选为panc-1、bxpc-3、panc-28。

其中，所述肝癌细胞优选为hepg2、sk-hep1、huh7。

其中，所述肺癌细胞优选为a549、pc9、h522。

其中，所述胃癌细胞优选为mgc-803、mkn-45、ags。

本发明中，所述抗肿瘤药物的剂型可以是针剂、片剂、丸剂、胶囊、膏剂。

本发明中，所述咪康唑可以用于抑制肿瘤细胞的增殖、生长、迁移、侵袭、浸润。

本发明中，所述咪康唑可以用于促进肿瘤细胞的凋亡。

本发明还提供了一种体外抑制肿瘤细胞增殖的方法，将咪康唑加入体外培养的肿瘤细胞的培养液中，所述咪康唑的终浓度为1-100μm；优选地，为30-50μm。所述咪康唑的结构如式(1)所示：

本发明中，所述肿瘤细胞可以是胰腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞或者胃癌细胞。

其中，所述胰腺癌细胞优选为panc-1、bxpc-3、panc-28。

其中，所述肝癌细胞优选为hepg2、sk-hep1、huh7。

其中，所述肺癌细胞优选为a549、pc9、h522。

其中，所述胃癌细胞优选为mgc-803、mkn-45、ags。

在一个具体实施方案中，本发明采用的胰腺癌细胞是panc-1。一般而言，加入咪康唑的终浓度为1-100μm；优选地，为30-50μm。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物含有活性成分咪康唑及药学上可接受的载体。

利用本发明所述的抗肿瘤药物，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将抗肿瘤药物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中形成药物组合物。其中，所述水性载体介质可以是pbs、生理盐水。

其中，所述药物组合物的ph值通常约为5-8；优选地，ph值约为6-8。ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。

所述药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括但并不限于：肌内、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。

以本发明的咪康唑为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括但并不限于：生理盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖溶液、蒸馏水、甘油、乙醇、及其组合。其中，所述药物组合物应与给药方式相匹配。

在一个具体的实施方式中，本发明的咪康唑可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10-50毫克/千克体重。此外，本发明的咪康唑还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的咪康唑被用作药物时，可将治疗有效剂量的咪康唑施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10毫克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约80毫克/千克体重，较合适的用药剂量约为20毫克/千克体重。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素。

本发明的有益效果包括：本发明提供了咪康唑在制备抗肿瘤药物中的应用。咪康唑能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明将咪康唑作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，性质稳定，将为肿瘤治疗提供了一种新的途径和手段。

附图说明

图1为本发明实施例5咪康唑对肺癌细胞a549的促进凋亡图，其中，图a为流式细胞仪检测结果；图b为凋亡细胞所占比例统计结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

本实施例中，采用下述实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养皿，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。细胞培养在含10％胎牛血清的dmem或者rpim1640培养基中，培养基中含100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2.细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养皿中长至约90％汇合时传代，约每隔2-4天传代一次。一皿传代成三皿，或一个6cm传代于一个10cm的培养皿中。

具体实施方法:

1)用l×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入1-2ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手轻轻拍打细胞培养皿，使细胞分离。

3)用含10％胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养皿中，继续培养。

3.细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％dmso，40％dmem和50％gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷cell/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

实施例1mts法测定咪康唑对胰腺癌细胞的生长抑制作用

胰腺癌细胞panc-1细胞(购自atcc)3×10³/孔接种至96孔板，培养24小时使之贴壁后加入咪康唑(购自上海陶素生化科技有限公司)，设8个浓度梯度，分别为300μm、100μm、30μm、10μm、3μm、1μm、0.3μm、0.1μm，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％co2条件下培养72小时后，倒掉培养液，用mts试剂盒(promega公司)测定细胞存活率。

测试方法为：将胰腺癌细胞panc-1细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的mts显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μ1溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。将细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算咪康唑对胰腺癌细胞panc-1细胞的ic50值。

ic50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为胰腺癌细胞panc-1细胞数量为对照的一半时咪康唑的浓度。

结果如表1所示：咪康唑对胰腺癌细胞panc-1细胞的ic50值约为25.36μm。

用同样的方法测试胰腺癌细胞panc-28细胞(购自atcc)，结果咪康唑对胰腺癌细胞panc-28细胞的ic50值约为21.52μm。

用同样的方法测试胰腺癌细胞bxpc-3细胞(购自中科院细胞库)，结果咪

表1本发明实施例1中的咪康唑抑制胰腺癌细胞增殖的ic50

上述结果表明，咪康唑对胰腺癌细胞panc-1、panc-28均有较好的抑制效果，对胰腺癌细胞bxpc-3细胞也有一定的抑制作用。

实施例2咪康唑对肝癌细胞的生长抑制作用

按照实施例1的方法检测咪康唑对人肝癌细胞的生长抑制作用，结果显示，咪康唑对肝癌细胞sk-hep1细胞(购自中国科学院细胞库)的ic50值为13.87μm，对肝癌细胞hepg2细胞(购自atcc)的ic50值为27.89μm，对肝癌细胞huh7细胞(购自中科院细胞库)的ic50值为24.50μm，具体结果见表2。

表2本发明实施例2中的咪康唑抑制肝癌细胞增殖的ic50

上述结果表明，咪康唑对肝癌细胞sk-hep1、hepg2、huh7均有较好的抑制效果。

实施例3咪康唑对人肺癌细胞的生长抑制作用

按照实施例1的方法检测咪康唑对人肺癌细胞的生长抑制作用，结果显示，咪康唑对肺癌细胞a549细胞(购自atcc)的ic50值为19.40μm，对肺癌细胞pc9细胞(购自atcc)的ic50值为16.83μm，对肺癌细胞h522细胞(购自中科院细胞库)的ic50值为25.90μm，具体结果见表3。

表3本发明实施例3中的咪康唑抑制肺癌细胞增殖的ic50

上述结果表明，咪康唑对肺癌细胞a549、pc9、h522均有一定的抑制作用。

实施例4咪康唑对人胃癌细胞的生长抑制作用

按照实施例1的方法检测咪康唑对人胃癌细胞的生长抑制作用，结果显示，咪康唑对胃癌细胞mgc-803(购自atcc)细胞的ic50值为29.18μm，对胃癌细胞mkn-45细胞(购自atcc)的ic50值为24.95μm，对胃癌细胞ags(购自atcc)细胞的ic50值为24.56μm，具体结果见表4。

表4本发明实施例4中的咪康唑抑制胃癌细胞增殖的ic50

上述结果表明，咪康唑对胃癌细胞mgc-803、mkn-45、ags抑制效果较好。

实施例5咪康唑对肺癌细胞a549的促进凋亡作用

1.将未处理过的a549细胞(作为对照组)以及用浓度分别为10μm和30μm的咪康唑处理过的a549细胞进行消化，重悬后细胞直接收集到15ml的离心管中。

2.800r/min离心5min，倒掉上清。

3.用凋亡试剂盒中的孵育缓冲液洗涤1次。

4.800r/min离心5min，弃上清。

5.用100ul的缓冲液重悬细胞。

6.室温下避光孵育annexinv-fitc15min。

7.500～1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。

8.加入pi避光染色10min。

9.流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测fitc荧光，另一波长大于560nm的滤器检测pi。

10.统计凋亡细胞所占比例。

结果显示，与对照组相比，经咪康唑处理过的细胞的凋亡数明显增加，由此说明，咪康唑可以诱导肺癌细胞a549的凋亡；且随着咪康唑浓度的增加，肺癌细胞a549的凋亡数也增多，因此，咪康唑可以浓度依赖的诱导肺癌细胞a549的凋亡，具体结果见图1。

本发明保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。