肿瘤特异性可断裂的PEG化纳米粒子及制备方法与应用与流程

本发明属于药物载体领域，特别涉及一种肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子及制备方法与应用。

背景技术：

近年来，纳米技术在药物传递系统中的优异表现受到广泛关注，在肿瘤治疗中成果显著，表现出了很大的优势与潜力。纳米药物载体通过物理方法负载药物，具有较高的药物负载量，能够很好地保持药物的活性，并且可通过加强渗透与滞留效应提高药物对肿瘤组织的靶向传递能力和药效学水平，实现药物定点、定时、定量释放，既减少药物对正常组织的毒副作用，又充分发挥药物的疗效，从而达到治愈的目的。

介孔硅纳米粒子(msns)是一种具有多孔道结构的纳米粒子，具有结构稳定、孔径可调、表面易修饰等特点，目前在药物、基因的传输控释方面研究广泛。然而，受限于体内复杂的生理环境，msns纳米载体容易被免疫系统清除，导致细胞内在化率低、药物的生物利用度低等问题。聚乙二醇(peg)具有良好的生物、血液相容性和亲水性，无免疫原性，在生物医用材料领域应用广泛。利用peg修饰msns，能够提高纳米载体的溶液稳定性，降低免疫系统的清除，延长载体的血液循环时间。但是，传统的纳米载体的peg通过共价键偶联到纳米粒子表面，由于共价键的稳定性，导致peg层过于稳定，在肿瘤组织中不能脱落，不利于肿瘤细胞吞噬纳米载体，会降低药物在病灶部位的靶向性释放和生物利用度，因此，理想的peg化纳米载体是在血液循环过程中能够稳定存在，延长循环时间，而进入肿瘤组织后，peg壳层能够脱落，提高肿瘤细胞对纳米载体的吞噬。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子。

本发明的再一目的在于提供上述肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：

(1)将介孔硅纳米粒子分散在有机溶剂中，加入γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)，反应，纯化，得到表面含氨基的介孔硅纳米粒子；

(2)将步骤(1)获得的表面含氨基的介孔硅纳米粒子分散在有机溶剂中，加入丁二酸酐，反应，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子；

(3)将步骤(2)获得的含羧基的介孔硅纳米粒子分散在溶剂中，加入胱胺二盐酸盐以及催化剂，反应，固液分离，得到含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子；

(4)将步骤(3)获得的含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子负载抗肿瘤药物，然后分散到溶剂中，依次加入阳离子单体和交联剂，反应，纯化，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子；

(5)将端基苯甲醛化的peg溶于磷酸盐溶液中，得到溶液a；将步骤(4)制备的表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散于磷酸盐溶液中，得到溶液b；将溶液a和溶液b混合，反应，纯化，得到肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子。

步骤(1)中所述的介孔硅纳米粒子为mcm-41型；优选粒径为100nm、孔径为2～10nm的介孔硅纳米粒子。

步骤(1)中所述的介孔硅纳米粒子优选通过如下步骤制备得到：以正硅酸乙酯(teos)为原料，十六烷基三甲基溴化铵为表面活性剂，1,3,5-三甲基苯为制孔剂，搅拌反应，得到mcm-41型介孔硅纳米粒子。

所述的1,3,5-三甲基苯的用量相当于所述的teos摩尔量的0.5～2倍。

所述的十六烷基三甲基溴化铵的用量相当于所述的teos摩尔量的0.5～2倍。

所述的反应的温度优选为65～75℃；更优选为70℃。

所述的反应的时间优选为1.5～2.5h；更优选为2h。

步骤(1)中所述的有机溶剂优选为无水甲苯。

步骤(1)中所述的有机溶剂仅作为反应介质，不参与反应，其用量优选按有机溶剂：介孔硅纳米粒子＝50～150ml：1g计算；更优选按有机溶剂：介孔硅纳米粒子＝100ml：1g计算。

步骤(1)中所述的γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的质量用量按其与所述的介孔硅纳米粒子＝1～2:1(质量比)配比计算；更优选为按其与所述的介孔硅纳米粒子＝1:1配比计算。

步骤(1)中所述的反应优选为加热回流反应。

所述的加热回流反应的温度优选为100～120℃；更优选为110℃。

所述的加热回流反应的时间优选为20～30h；更优选为24h。

步骤(1)所述的纯化的步骤优选如下：抽滤，使用甲苯和乙醇进行洗涤，干燥。

步骤(2)中所述的有机溶剂优选为乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯和丙酮中的至少一种；更优选为丙酮。

步骤与(2)中所述的有机溶剂的作用与步骤(1)相同。

步骤(2)中所述的丁二酸酐的用量与所述的表面含氨基的介孔硅纳米粒子＝0.5～2:1(质量比)配比计算；更优选为按其与所述的表面含氨基的介孔硅纳米粒子＝2:1配比计算。

步骤(3)和步骤(4)中所述的溶剂为水或磷酸盐缓冲溶液。

所述的磷酸盐缓冲溶液优选为ph值为7.2～7.4、浓度为0.01～0.1m的磷酸盐缓冲液。

步骤(3)中所述的催化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)。

所述的催化剂的用量是催化用量。

所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)的质量用量按其与所述的含羧基的介孔硅纳米粒子＝质量比1:1～5计算；优选为按其与所述的含羧基的介孔硅纳米粒子＝质量比1:2计算。

所述的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的质量用量按其与所述的含羧基的介孔硅纳米粒子的质量比1:1～5计算；优选为按其与所述的含羧基的介孔硅纳米粒子＝质量比1:2.5计算。

步骤(3)中所述的胱胺二盐酸盐的质量用量按其与所述的含羧基的介孔硅纳米粒子的质量比1:0.5～2.5计算；优选为按其与所述的含羧基的介孔硅纳米粒子＝质量比1:1计算。

步骤(4)优选为：将步骤(3)获得的含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子负载抗肿瘤药物，然后分散到溶剂中，氮气保护下，依次加入阳离子单体和交联剂，然后加入引发剂引发聚合反应，纯化，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子；

所述的引发剂优选为过硫酸铵和n,n,n′,n′-四甲基乙二胺；更优选为过硫酸铵和n,n,n′,n′-四甲基乙二胺按质量比1：1配比得到混合物。

所述的引发剂的加入量为0～相当于所述的阳离子单体质量的0.02倍质量。

所述的反应的条件优选0～35℃反应1～24h。

步骤(4)中所述的药物为抗肿瘤药物，优选为阿霉素、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、表阿霉素、紫杉醇、长春花碱、长春新碱、三苯氧胺、福美司坦、阿那曲唑、氟他胺、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、奥沙利铂、卡莫司汀、托瑞米芬和替加氟中的一种或至少两种。

步骤(4)中所述的将步骤(3)获得的含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子负载抗肿瘤药物的步骤优选为：先将药物制备成溶液，然后与步骤(3)获得的含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子混合，搅拌使药物被充分吸附，固液分离，得到的负载抗肿瘤药物的介孔硅纳米粒子。

步骤(4)中所述的阳离子单体为含有氨基的阳离子单体，或是含有氨基的阳离子单体与其他阳离子单体形成的混合物；优选为含有氨基的阳离子单体与其他阳离子单体形成的混合物；更优选为含有氨基的阳离子单体与其他阳离子单体按摩尔比9：12配比得到的混合物。其他阳离子单体指的是不含有氨基的阳离子单体。

所述的含有氨基的阳离子单体优选为n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺中的至少一种。

所述的其他阳离子单体优选为n,n-二甲基丙烯酰胺和n,n-二乙基丙烯酰胺中的至少一种。

步骤(4)中所述的阳离子单体的用量按其与含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子或是负载药物后的含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子的质量比＝1～2:1～2计算；更优选为按其与含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子或是负载药物后的含氨基和二硫键修饰的介孔硅纳米粒子的质量比＝1:1计算。

步骤(4)中所述的交联剂是具有二硫键的化合物，优选为n,n'-双(丙烯酰)胱胺和胱胺中的至少一种。

所述的交联剂的用量按其与阳离子单体的摩尔比1～2:21计算。

步骤(4)所述的纯化的步骤优选如下：离心分离，使用水和乙醇进行洗涤，干燥。

步骤(5)中所述的端基苯甲醛化的peg为具有如下特点的聚乙二醇：一端基为苯甲醛化，另一端基为甲氧基，分子量为500～10000。

步骤(5)中所述的端基苯甲醛化的peg优选通过如下步骤制备得到：将氨基聚乙二醇单甲醚和n-琥珀酰亚胺4-甲酰苯甲酸酯按质量比20：3配比混合溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，4℃下搅拌反应4h，用相当于n,n-二甲基甲酰胺10倍的过量冷乙醚沉淀，粗产物用丙二醇重结晶，得到端基苯甲醛化的peg。

步骤(5)中所述的端基苯甲醛化的peg的用量按其与介孔硅表面氨基的摩尔比1.1～1.5:1计算；优选为按其与介孔硅表面氨基的摩尔比1.1:1计算。

步骤(5)中所述的磷酸盐缓冲溶液优选为ph值为7.2～7.4、浓度为0.01～0.1m的磷酸盐缓冲液。

步骤(5)中所述的反应的时间优选为24h。

步骤(5)所述的纯化的步骤优选如下：离心分离，使用水和乙醇进行洗涤，干燥。

一种肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子，通过上述制备方法得到。

所述的肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子水分散性良好、生物相容性良好、具有较强的药物负载能力、血液循环时间长、毒性低、靶向传递药物、粒径尺寸为100～200nm、孔径尺寸为2～10nm且分布均匀。

所述的肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的原理：本发明以介孔硅纳米粒子为核，负载抗肿瘤药物，在介孔硅纳米粒子表面修饰含有氨基和二硫键的阳离子聚合物层，然后加入端基苯甲醛化的peg，通过苯甲醛基与氨基之间的反应形成在弱酸性条件下可断裂的苯甲亚氨键，在纳米粒子表面引入peg壳层，构建具有肿瘤微环境中peg分子可脱落、可响应细胞内谷胱甘肽氧化还原特性的多功能性药物传递载体。由于peg壳层的存在，纳米载体能够有效抵御免疫系统的清除，在血液中循环可长时间保持稳定；当进入肿瘤组织后，在肿瘤组织弱酸性环境下，苯甲亚氨键断裂，peg壳层脱离纳米载体表面，载体表面电荷由中性转正，能够提高细胞的吞噬效率；进入肿瘤细胞后，高谷胱甘肽(gsh)浓度迅速提高，阳离子聚合物层中的二硫键断裂，从而使负载的药物在细胞内特异性释放，提高抗肿瘤药物的靶向传递和生物利用度。通过上述设计，制备水分散性良好、生物相容性良好、具有较强的药物负载能力、血液循环时间长、毒性低的肿瘤靶向药物传输载体。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明提供的肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子，peg通过动态共价键偶联修饰表面，具有在肿瘤微环境中peg壳层可脱落、响应细胞内谷胱甘肽氧化还原特性。纳米载体进入肿瘤组织的弱酸性环境后，peg与聚合物层偶联的苯甲亚氨键断裂，peg壳层脱离纳米载体表面，载体表面电荷由中性转正，提高细胞的吞噬效率；进入肿瘤细胞后，在胞内谷胱甘肽的作用下，表面的聚合物层断裂解离，负载的药物靶向释放在肿瘤细胞内，能够有效提高药物生物利用度。

2.本发明提供的肿瘤特异性可断裂的peg化纳米粒子水分散性良好、生物相容性良好、具有较强的药物负载能力、血液循环时间长、毒性低、靶向传递药物、粒径尺寸为100-200nm、孔径尺寸为2-10nm且分布均匀。

附图说明

图1为实施例1、4、6制备的纳米载体的透射电镜照片图；其中，图a～c分别依次对应实施例1、4、6制备的纳米载体。

图2为实施例1制备的纳米载体的xrd衍射谱图；其中，曲线1是未修饰的介孔硅纳米粒子的xrd衍射谱图，曲线2是实施例1制备得到的介孔硅纳米载体的xrd衍射谱图。

图3为氮气吸附法测定实施例1制备的纳米载体内部孔道吸附作用对比图；其中，曲线1代表未修饰的介孔硅纳米粒子，曲线2代表实施例1制备得到的介孔硅纳米载体。

图4为实施例1制备的纳米载体在不同时间内与蛋白相互作用粒径的变化柱形图。

图5为实施例1、2和4制备的纳米载体所负载的阿霉素在模拟血液gsh浓度(0.01mm)和肿瘤细胞微环境的gsh浓度下(10mm)累计释放曲线图；其中，曲线1为实施例1制备的纳米载体在ph5.0+10mm谷胱甘肽环境中的累积释放曲线，曲线2为实施例4制备的纳米载体在ph5.0+10mm谷胱甘肽环境中的累积释放曲线，曲线3为实施例1制备的纳米载体在ph7.4+10mm谷胱甘肽环境中的累积释放曲线，曲线4为实施例4制备的纳米载体在ph7.4+10mm谷胱甘肽环境中的累积释放曲线，曲线5为实施例2制备的纳米载体在ph5.0+10mm谷胱甘肽环境中的累积释放曲线，线6为实施例2制备的纳米载体在ph7.4+10mm谷胱甘肽环境中的累积释放曲线。

图6为实施例1、2和4制备的纳米载体在不同条件下阿霉素在hela细胞内的释放结果照片图；其中，图a为实施例1制备的纳米载体在染色后2h和4h的荧光变化照片图，图b为实施例2制备的纳米载体在染色后2h和4h的荧光变化照片图，图c为实施例4制备的纳米载体在染色后2h和4h的荧光变化照片图。

图7为通过流式细胞测定实施例1和4制备的纳米载体对hela细胞凋亡率的影响结果图；其中，图a为实施例1制备的纳米载体对hela细胞凋亡率的影响结果图，图b为实施例4制备的纳米载体对hela细胞凋亡率的影响结果图。

图8为实施例1制备的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg的核磁氢谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)将预先合成的mcm-41型介孔硅纳米粒子(按colloidsandsurfacesb:biointerfaces,2017,155:41–50.中的方法合成，粒径为100nm、孔径为2～10nm)60℃真空干燥24h，称取0.50g加入50ml无水甲苯中，然后加入0.20mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀后，升温至110℃，氮气保护下回流反应24h。反应完毕后抽滤，使用甲苯洗涤二次，乙醇洗涤一次，于60℃真空干燥24h，得到含氨基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含氨基的介孔硅纳米粒子分散在丙酮中，加入丁二酸酐0.20g，室温下搅拌反应24h，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含羧基的介孔硅纳米粒子分散到磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，0.1m)中，加入0.10g胱胺二盐酸盐、0.05gedc以及0.04gnhs，室温下搅拌反应24h，离心分离，于60℃真空干燥24h，，得到含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子。

(2)将0.10g含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子加入到2.0ml含有10mg阿霉素的丙酮溶液中，搅拌吸附24h，离心分离，于60℃真空干燥24h，得到负载阿霉素的介孔硅纳米粒子，通过紫外光谱法测定纳米粒子中阿霉素的负载量。

(3)取50mg负载阿霉素(dox)的介孔硅纳米粒子分散在2.0mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，氮气保护下，加入50mg阳离子单体(n,n-二甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺)，搅拌均匀后，然后加入n,n'-双(丙烯酰)胱胺作为交联剂，调整n,n-二甲基丙烯酰胺/n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺/交联剂的摩尔比为12:9:1。然后加入30μl过硫酸铵(100mg/ml脱氧水溶液)和3μln,n,n′,n′-四甲基乙二胺引发聚合反应，室温下反应1h，将产物离心分离，使用水和乙醇洗涤并离心三次，于60℃真空干燥过夜，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子。

(4)将氨基聚乙二醇单甲醚(mpeg-nh2,m.w.＝2000)0.2g和n-琥珀酰亚胺4-甲酰苯甲酸酯0.03g溶解在2.0mldmf中，4℃下搅拌反应4h，用10倍的过量冷乙醚沉淀，粗产物用丙二醇重结晶，得到α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg(端基苯甲醛化的peg)，产物用核磁表征(见图8)。

(5)将50mg表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散在5mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液a；将20mg分子量为2000的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg溶于2mlpbs溶液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液b。将溶液a和溶液b混合，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，于60℃真空干燥过夜，得到表面peg化的负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

实施例2

实施例2和实施例1的区别主要在于：本实施步骤(4)和(5)将单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯替代实施例1的氨基聚乙二醇单甲醚，使表面偶联的peg从微酸性条件下可断裂转化成稳定的共价键。

(1)将预先合成的mcm-41型介孔硅纳米粒子(colloidsandsurfacesb:biointerfaces,2017,155:41–50.)(粒径为100nm、孔径为2～10nm)60℃真空干燥24h，称取0.50g加入50ml无水甲苯中，然后加入0.20mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀后，升温至110℃，氮气保护下回流反应24h。反应完毕后抽滤，使用甲苯洗涤二次，乙醇洗涤一次，于60℃真空干燥24h，得到含氨基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含氨基的介孔硅纳米粒子分散在丙酮中，加入丁二酸酐0.20g，室温下搅拌反应24h，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含羧基的介孔硅纳米粒子分散到磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，0.1m)中，加入0.10g胱胺二盐酸盐、0.05gedc以及0.04gnhs，室温下搅拌反应24h，离心分离，于60℃真空干燥24h，得到含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子。

(2)将0.10g含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子加入到2.0ml含有10mg阿霉素的丙酮溶液中，搅拌吸附24h，离心分离，于60℃真空干燥24h，得到负载阿霉素的介孔硅纳米粒子，通过紫外光谱法测定纳米粒子中阿霉素的负载量。

(3)取50mg负载阿霉素(dox)的介孔硅纳米粒子分散在2.0mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，氮气保护下，加入50mg阳离子单体(n,n-二甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺)，搅拌均匀后，然后加入n,n'-双(丙烯酰)胱胺作为交联剂，调整n,n-二甲基丙烯酰胺/n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺/交联剂的摩尔比为12:9:1。然后加入30μl过硫酸铵(100mg/ml脱氧水溶液)和3μln,n,n′,n′-四甲基乙二胺引发聚合反应，室温下反应1h，将产物离心分离，使用水和乙醇洗涤并离心三次，于60℃真空干燥过夜，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子。

(4)将50mg表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散在5mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液a；将20mg分子量为2000的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯溶于2mlpbs溶液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液b。将溶液a和溶液b混合，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，于60℃真空干燥过夜，得到表面共价键偶联的peg化负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

实施例3

实施例3和实施例1的区别主要在于：本实施步骤(3)将n,n-二乙基丙烯酰胺替代实施例1的n,n-二甲基丙烯酰胺。

(1)将预先合成的mcm-41型介孔硅纳米粒子60℃真空干燥24h，称取0.50g加入50ml无水甲苯中，然后加入0.20mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀，升温至110℃，氮气保护下回流反应24h。反应完毕后抽滤，甲苯洗涤二次，乙醇洗涤一次，于50℃真空干燥24h，得到含氨基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含氨基的介孔硅纳米粒子分散在丙酮中，加入丁二酸酐0.20g，室温下搅拌反应24h，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含羧基的介孔硅纳米粒子分散到磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，0.1m)中，加入0.10g胱胺二盐酸盐、0.05gedc以及0.04gnhs，室温下搅拌反应24h，离心分离，于50℃真空干燥24h，得到含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子。

(2)将0.10g含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子加入到2.0ml含有10mg阿霉素的丙酮溶液中，搅拌吸附24h，离心分离，于50℃真空干燥24h，得到负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

(3)将50mg负载阿霉素的介孔硅纳米粒子分散在2.0mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，氮气保护下，加入50mg阳离子单体(n,n-二乙基丙烯酰胺和n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺)，搅拌均匀后，然后加入n,n'-双(丙烯酰)胱胺作为交联剂，调整n,n-二乙基丙烯酰胺/n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺/交联剂的摩尔比为12:9:1。然后加入30μl过硫酸铵(100mg/ml脱氧水溶液液)和3μln,n,n′,n′-四甲基乙二胺引发聚合反应，室温下反应1h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，于50℃真空干燥过夜，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子。

(4)将50mg表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散在5mlpbs缓冲液(ph7.4，0.1m)中，得到溶液a；将20mg分子量为2000的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg(按实施例1步骤(4)制备)溶于2mlpbs溶液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液b。将溶液a和溶液b混合，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，于50℃真空干燥过夜，得到表面peg化的负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

实施例4

实施例4与实施例1的不同主要在于：所用的交联剂不同以及交联反应条件不同。

(1)将预先合成的mcm-41型介孔硅纳米粒子60℃真空干燥24h，称取0.50g加入到50ml无水甲苯中，然后加入0.20mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀，升温至110℃，氮气保护下回流反应24h。反应完毕后抽滤，甲苯洗涤二次后乙醇洗涤一次，60℃真空干燥24h，得到含氨基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含氨基的介孔硅纳米粒子分散在丙酮中，加入丁二酸酐0.20g，室温下搅拌反应24h，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含羧基的介孔硅纳米粒子分散到磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，0.1m)中，加入0.10g胱胺二盐酸盐、0.05gedc以及0.04gnhs，室温下搅拌反应24h，离心分离，60℃真空干燥24h，得到含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子。

(2)将0.10g含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子加入到2.0ml含有10mg阿霉素的丙酮溶液中，搅拌吸附24h，离心分离，60℃真空干燥24h，得到负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

(3)将50mg负载阿霉素的介孔硅纳米粒子分散在2.0mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，降温至0℃，氮气保护下加入50mg阳离子单体(n,n-二甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺)，搅拌均匀，加入胱胺作为交联剂，调整n,n-二甲基丙烯酰胺/n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺/交联剂的摩尔比为12:9:2，0℃下反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子。

(4)将50mg表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散在5mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液a；取20mg分子量为2000的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg(按实施例1步骤(4)制备)溶于2mlpbs溶液中，得到溶液b。将溶液a和溶液b混合，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面peg化的负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

实施例5

实施例5与实施例1的不同主要在于：所用的a-甲氧基-w-苯甲醛-peg分子量不同，用量不同。

(1)将预先合成的mcm-41型介孔硅纳米粒子60℃真空干燥24h，称取0.50g加入到50ml无水甲苯中，然后加入0.20mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀，升温至110℃，氮气保护下回流反应24h。反应完毕后抽滤，甲苯洗涤二次后乙醇洗涤一次，60℃真空干燥24h，得到含氨基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含氨基的介孔硅纳米粒子分散在丙酮中，加入丁二酸酐0.20g，室温下搅拌反应24h，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含羧基的介孔硅纳米粒子分散到磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，0.1m)中，加入0.10g胱胺二盐酸盐、0.05gedc以及0.04gnhs，室温下搅拌反应24h，离心分离，60℃真空干燥24h，得到含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子。

(2)将0.10g含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子加入到2.0ml含有10mg阿霉素的丙酮溶液中，搅拌吸附24h，离心分离，60℃真空干燥24h，得到负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

(3)将50mg负载阿霉素的介孔硅纳米粒子分散在2.0mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，在氮气保护下加入50mg阳离子单体(n,n-二甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺)，搅拌均匀，然后加入n,n'-双(丙烯酰)胱胺作为交联剂，调整n,n-二甲基丙烯酰胺/n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺/交联剂的摩尔比为12:9:1。然后加入30μl过硫酸铵(100mg/ml脱氧水溶液液)和3μln,n,n′,n′-四甲基乙二胺引发聚合反应，室温下反应1h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子。

(4)将50mg表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散在5mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液a；取5mg分子量为500的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg(按实施例1步骤(4)制备，区别仅在于使用的mpeg-nh2的分子量为500)溶于pbs溶液中，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面peg化的负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。将20mg分子量为2000的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg溶于2mlpbs溶液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液b。将溶液a和溶液b混合，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面peg化的负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

实施例6

实施例6与实施例1的不同主要在于：所用的a-甲氧基-w-苯甲醛-peg分子量不同，用量不同。

(1)将预先合成的mcm-41型介孔硅纳米粒子60℃真空干燥24h，称取0.50g加入到50ml无水甲苯中，然后加入0.20mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌均匀，升温至110℃，氮气保护下回流反应24h。反应完毕后抽滤，甲苯洗涤二次后乙醇洗涤一次，60℃真空干燥24h，得到含氨基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含氨基的介孔硅纳米粒子分散在丙酮中，加入丁二酸酐0.20g，室温下搅拌反应24h，离心分离，得到含羧基的介孔硅纳米粒子。将0.10g含羧基的介孔硅纳米粒子分散到磷酸盐缓冲溶液(ph7.4，0.1m)中，加入0.10g胱胺二盐酸盐、0.05gedc以及0.04gnhs，室温下搅拌反应24h，离心分离，60℃真空干燥24h，得到含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子。

(2)将0.10g含二硫键和氨基的介孔硅纳米粒子加入到2.0ml含有10mg阿霉素的丙酮溶液中，搅拌吸附24h，离心分离，60℃真空干燥24h，得到负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

(3)将50mg负载阿霉素的介孔硅纳米粒子分散在2.0mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，在氮气保护下加入50mg阳离子单体(n,n-二甲基丙烯酰胺和n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺)，搅拌均匀，然后加入n,n'-双(丙烯酰)胱胺作为交联剂，调整n,n-二甲基丙烯酰胺/n-(3-氨基乙基)甲基丙烯酰胺/交联剂的摩尔比为12:9:1，然后加入30μl过硫酸铵(100mg/ml脱氧水溶液液)和3μln,n,n′,n′-四甲基乙二胺引发聚合反应，室温下反应1h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子。

(4)将50mg表面引入阳离子聚合物层的介孔硅纳米粒子分散在5mlpbs缓冲液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液a；将分子量为10000的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg(按实施例1步骤(4)制备，区别仅在于使用的mpeg-nh2的分子量为10000)50mg溶于2mlpbs溶液中(ph7.4，0.1m)，得到溶液b。将溶液a和溶液b混合，搅拌反应24h，产物离心分离，用水和乙醇洗涤离心三次，60℃真空干燥过夜，得到表面peg化的负载阿霉素的介孔硅纳米粒子。

效果实施例

对所制备的peg化多重响应纳米载体进行分析：

1、将实施例1、4、6的样品粉末分散在乙醇中，取适量滴加到铜网上，透射电镜观察纳米粒子形态。图1为实施例1、4、6(分别对应图a、b、c)制备的纳米载体的透射电镜照片图。从电镜照片中可以看出，纳米载体的粒径在100nm左右，并且粒子与粒子之间产生了一定的粘连，为粒子表面的聚合物层。同时，在纳米粒子表面能够观察到纳米粒子的平行条带，这表明纳米载体可有效地维持纳米粒子的介孔结构。

2、对实施例1制备的纳米载体颗粒进行结构的xrd衍射。xrd衍射谱图如图2所示，曲线1是未修饰的介孔硅纳米粒子，曲线2是实施例1得到的介孔硅纳米载体。从图中观察到100、110以及200中三个分辨良好的反射峰，证实了纳米粒子具有特征性布拉格峰的有序介孔结构。

3、氮气吸附法测定实施例1制备的纳米载体比表面积和内部孔道结构。结果如图3所示，在相对压力(p/p0)为0.2～0.4时，纳米载体具有典型的iv型等温线。伴随毛细管凝结作用，吸附通过多层吸附作用进行。二次吸附过程(p/p0～0.90)有助于研究冷冻干燥后的纳米粒子内部空间形态。通过barrett-joyner-halenda(bjh)模型计算，表面积约为300m²g^-1。

4、通过粒度分析仪测定的粒径变化情况。图4为实施例1制备的纳米载体在不同时间内与蛋白相互作用，从粒径的变化可以看出，表面带氨基的纳米粒子与蛋白之间具有较强的吸附作用，粒径随着时间逐渐变大，而peg化的纳米粒子，粒径随着时间基本没有变化，一直保持在100nm左右，说明peg能够有效抵御蛋白的吸附，有利于在血液中长时间循环而不被免疫系统清除。

5、测定实施例1、2和4制备的纳米载体在模拟血液和肿瘤细胞环境中负载药物的累计释放量。结果如图5所示，从图中可以看出，在模拟血液环境中(ph7.4+2μm谷胱甘肽)，实施例1和4制备的纳米载体在24h测定时间范围内，累计释放小于或约等于20％。结果说明，在血液循环过程中，载体能够有效避免药物提前释放；在模拟肿瘤细胞微环境环境中(ph5.0+10mm谷胱甘肽)，24h内累计释放均超过60％，并且在前6h药物释放量不低于40％。与实施例1和4制备的纳米载体相比，实施例2制备的纳米载体，无论ph是在5.0还是7.4，药物的累积释放量都低于10％，这是由于peg壳层牢固的附着在纳米载体表面，阻碍了药物从载体中顺利的释放出。

6、通过激光共聚焦显微镜观察实施例1、2和4制备的纳米载体在hela细胞内药物的释放结果。将hela细胞接种于6孔培养板(1×10⁴细胞/孔)中培养24h(培养基为deme)，在细胞孔中加入实施例1、2和4制备的纳米载体，维持培养皿中dox浓度为2μg/ml，继续培养3h后加入hoechst33342对细胞核进行染色，分别于2h和4h后在激光共聚焦显微镜下观察阿霉素的荧光变化(红色为阿霉素荧光，蓝色为细胞核染色后发出的荧光)。结果如图6所示(图a是实施例1制备的纳米载体，图b是实施例2制备的纳米载体，图c是实施例4制备的纳米载体)：从图6a和图6c可见，在不同的时间内(2h和4h)，细胞内的红色荧光都随着时间的增加而增长，这说明实施例1和4制备的纳米载体在hela细胞内能够顺利的释放出阿霉素；相反，图6b制备的纳米载体，由于peg壳层牢固的附着在纳米载体表面，阻碍了药物从载体中顺利的释放出，因此经过2小时和4小时的培养后，在细胞中红色荧光的强度很弱，并基本没有变化。因此从实例1、4与实例2的对比来看，在肿瘤中可断裂的peg壳层既能提高载体在血液中的稳定性，又能提高细胞的吞噬效率和胞内的药物累积释放量。

7、通过流式细胞测定实施例1和4制备的纳米载体对hela细胞凋亡率的影响结果。hela细胞以1×10⁵/孔密度种于24孔板内，将实施例1和3制备的纳米载体分别加入各孔中(2μg/孔)，37℃、5％co2环境下培养72h，然后采用流式细胞仪定量检测hela细胞凋亡。结果如图7所示，图7a为实施例1制备的纳米载体，图7b为实施例4制备的纳米载体。从图中可以看出，实施例1和4制备的纳米载体负载阿霉素后，都能引起非常明显的细胞凋亡，实施例1细胞凋亡率达到40.2％，实施例3细胞凋亡率也达到了39.1％，证明了所设计纳米载体的有效性。

8、对实例1制备的α-甲氧基-ω-苯甲醛-peg(2000)进行核磁氢谱检测。结果如图8所示，从谱图中可以看出在8.0-8.4ppm出现苯环的质子吸收峰，表明在peg分子链末端成功引入了苯甲醛基。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。