一种HIFU生物靶向增效剂及其制备方法与流程

本发明涉及hifu领域，特别是涉及一种hifu生物靶向增效剂及其制备方法。

背景技术：

近年来，hifu(highiintensityfocusedultrasound，高强度聚焦超声)作为一种新型的微无创治疗方法，已广泛应用于临床肿瘤治疗。hifu是利用超声的方向性、穿透性和可聚焦性，将体外发射的超声波聚焦在靶组织，通过超声的热效应、空化效应、机械效应，在焦点区域产生瞬态高温，使靶组织发生不可逆的凝固性坏死。其显著特点是对靶区组织起直接杀伤破坏作用而不损伤周围正常组织，是一种非侵入性治疗恶性实体肿瘤的新技术。但实际临床工作中，hifu技术仍然存在能量衰减、靶区能量沉积少、停留时间短及靶向性不强等缺点。如何更好地提高hifu的治疗作用，是一直在探索的问题。目前，通过改变靶区组织的声环境以提高hifu的治疗效率成为国内外学者的研究热点。碘油、微泡造影剂等增效剂在提高hifu疗效中的作用得到广泛认可，但仍存在靶区停留时间较短、易损伤周边正常组织等问题。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种hifu生物靶向增效剂及其制备方法，用于提高hifu生物靶向治疗效果。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种hifu生物靶向增效剂，包括双歧杆菌以及与其连接的hifu增效剂。

可选地，所述hifu增效剂选自阳离子脂质微球、plga微球(poly(lactic-co-glycolic)acid，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)中的至少一种。

可选地，所述双歧杆菌选自长双歧杆菌atcc15707，当然，不限于上述株系，其他株系也适用于本发明。

本发明第二方面提供上述hifu生物靶向增效剂的制备方法，包括制备所述hifu增效剂，然后将其与双歧杆菌连接，得到所述hifu生物靶向增效剂。

可选地，连接方法选自静电吸附法、化学键连接法中的至少一种。

可选地，所述hifu增效剂为阳离子脂质微球时，采用静电吸附法进行连接。

可选地，先制备所述阳离子脂质微球，再将所述阳离子脂质微球与所述双歧杆菌共孵育，获得连接有阳离子脂质微球的双歧杆菌。

可选地，制备阳离子脂质微球时，采用的原料包括脂质原料、溶剂。

可选地，所述脂质原料包括磷脂酰胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-peg-胺(dspe-peg2000-胺)、dc-胆固醇。

可选地，按质量计，脂酰胆碱：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-peg-胺：dc-胆固醇＝5：2：2。

可选地，所述溶剂包括三氯甲烷、全氟己烷。

可选地，先将脂质原料与第一溶剂混合，然后去除第一溶剂，形成脂质膜，将所得脂质膜与水混合进行水合反应，形成悬浮液，加入第二溶剂，乳化处理，制得所述阳离子脂质微球。

可选地，所述第一溶剂选自三氯甲烷。

可选地，所述第二溶剂选自全氟己烷。

可选地，通过旋转蒸发的方式去除第一溶剂。

可选地，采用超声波对加有所述第二溶剂的悬浮液进行乳化处理。

可选地，所述hifu增效剂为plga微球时，采用化学键连接法进行连接。

可选地，先制备表面带有活化羧基的plga微球，再将所述plga微球与所述双歧杆菌共孵育，获得连接有所述plga微球的双歧杆菌。

可选地，制备所述plga微球时，包括先制备表面带羧基的plga微球，然后进行羧基活化处理，制得表面带有活化羧基的plga微球。

可选地，采用的原料包括plgacooh、溶剂、羧基活化剂。

可选地，所述溶剂包括三氯甲烷。

可选地，所述羧基活化剂包括碳二亚胺(edc)、sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)。

可选地，按摩尔量计，碳二亚胺：sulfo-nhs：表面带羧基的plga微球＝30∶30∶1。

可选地，先将plgacooh溶于所述溶剂中，得到初乳，然后，将所述初乳与pva水溶液混合，得到复乳，再加入异丙醇水溶液，制得表面带羧基的plga微球。

可选地，所述pva水溶液的质量浓度为4％。

可选地，所述异丙醇水溶液的质量浓度为2％。

可选地，活化时，将羧基活化剂、表面带羧基的plga微球、mes缓冲液混合，制得表面带有活化羧基的plga微球。

可选地，所述mes缓冲液的ph为5.5。

本发明第三方面提供上述hifu生物靶向增效剂在制备高强度聚焦超声治疗药物中的应用。

如上所述，本发明的一种hifu生物靶向增效剂及其制备方法，具有以下有益效果：本发明公开了一种高强度聚焦超声(highintensityfocusedultrasound,hifu)生物(双歧杆菌)靶向增效剂及其制备方法，具体是将双歧杆菌和hifu增效剂结合而成。双歧杆菌是一种对人体健康有益的益生菌，生物安全性高，且其专性厌氧特性可以靶向肿瘤乏氧区，并在其内进行定向增殖，有抗肿瘤的作用。hifu增效剂可以提高hifu能量沉积。本发明将双歧杆菌与hifu增效剂通过静电吸附法、共价键结合法进行连接，制得的hifu生物靶向增效剂可以更精准地靶向肿瘤组织，并能够提高hifu能量沉积，延长停留时间，进而达到提高hifu靶向消融肿瘤的目的。

附图说明

图1-1显示为本发明实施例1中阳离子脂质纳米粒的粒径分布图。

图1-2显示为本发明实施例1中阳离子脂质纳米粒的电位分布图。

图1-3显示为本发明实施例1中双歧杆菌与阳离子脂质纳米粒的体外连接图。

图1-4的左图为本发明实施例1中pbs组荷mda-mb231瘤鼠肿瘤组织的革兰氏染色图(×400)，右图为本发明实施例1中双歧杆菌组荷瘤鼠肿瘤组织的革兰氏染色图(×400)。

图1-5显示为本发明实施例1中hifu辐照后各组肿瘤组织的凝固性坏死体积对比图。

图2-1显示为本发明实施例2中双歧杆菌与plga微球结合的激光共聚焦显微图。

图2-2显示为本发明实施例2中干燥24小时后的plga微球-双歧杆菌原子力显微图。

图2-3显示为本发明实施例2中的荧光成像图。

图2-4显示为本发明实施例2中的肿瘤体积变化图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

新型hifu造影剂(增效剂)的研究不仅要考虑靶向浓聚问题，同时还要兼顾生物的安全性和治疗的有效性。

双歧杆菌是一种存在于人体内的益生菌，已成为人体健康的重要指标之一。作为微生态制剂，其对机体有营养、拮抗、通便、增强免疫力，抗肿瘤，抗衰老等多种益生功能，双歧杆菌的生物安全性和肿瘤靶向性已得到证实。病理学证实，绝大多数实体瘤因肿瘤实质细胞增生迅速，而血管形成相当缓慢，造成实体瘤内部大面积缺氧，肿瘤组织的中心区域出现大片的坏死区域。而双歧杆菌的专性厌氧特性,使其入血后能够特异性地向肿瘤组织的坏死区集中和繁殖,表现出对实体瘤的靶向性。利用这一特性，我们将双歧杆菌与hifu增效剂以不同方式结合，真正达到hifu靶向治疗肿瘤的目的。

以下实施例采用长双歧杆菌atcc15707进行实验。

实施例1

静电吸附法制备阳离子脂质微球-双歧杆菌

1、阳离子脂质微球的制备及表征

将一定质量的脂质(脂质原料购自avantipolarlipids,inc,alabaster,al,usa)混合在一起，具体是将5mgdppc、2mgdspe-peg(2000)-amine、2mgdc-胆固醇溶解于10ml三氯甲烷中，将溶液移至旋转蒸发器，在50℃下去除有机溶剂并形成薄脂质膜。1小时后，将所得的薄脂质膜在2ml双蒸水中水合，形成半透明的乳白色悬浮液。然后将100μlpfh(全氟己烷)逐滴加入悬浮液中，用超声波将悬浮液乳化，功率为130w，持续5分钟(5秒开和5秒关)，得到阳离子脂质液体纳米颗粒(即阳离子脂质微球)。为了制备荧光纳米液滴，将dii(1mg)或dir(1mg)荧光染料添加到脂质溶液中，采用铝箔纸防止光照射。用激光共聚焦扫描显微镜检测荧光，并使用malvernzetasizernanozs测定粒度分布和zeta电位。结合细胞计数器和光密度(od)值，记录阳离子脂质纳米粒的浓度。

如图1-1所示，粒径大小约为280±60nm，如图1-2所示，电位大小约为+38mv，结合细胞计数器和光密度(od)值，记录阳离子纳米粒的浓度，经稀释后阳离子纳米粒的浓度约为2×10⁶个/ml，实际记录阳离子纳米粒的密度用的是吸光度a值，a450＝0.3。

2、双歧杆菌与阳离子脂质微球连接及表征

先加入100μl用fitc标记的双歧杆菌(1×10⁶个/ml，双歧杆菌由重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系提供)，再加入300μl用dii标记的上述方法制备的阳离子脂质微球(1mg/ml)，常温下，共孵育10min后，稀释200倍，直接在激光共聚焦显微镜下观察，如图1-3所示为激光共聚焦显微图，绿色荧光代表细菌，红色荧光代表阳离子脂质微球(800x)，从图中可以看出，fitc标记的双歧杆菌(绿色荧光)的周围，粘附了数量不等的由dii标记的阳离子脂质纳米粒(红色荧光)。

实验方法：将10只荷mda-mb-231乳腺癌移植瘤裸鼠随机分为2组，每组5只。标记为a组(pbs)、b组(双歧杆菌)。a组荷瘤鼠经尾静脉注射0.2mlpbs,b组荷瘤鼠经尾静脉注射0.2ml(浓度为5×10⁶个/ml)双歧杆菌溶液。于a、b组分别注射pbs和双歧杆菌后3d，将荷瘤裸鼠全部处死，取出荷瘤鼠的肿瘤组织，4％多聚甲醛固定，革兰氏染色。

如图1-4显示为肿瘤部位革兰染色图(x400)，左图为对照组，即无双歧杆菌生长的肿瘤部位革兰染色图，右图为有双歧杆菌生长的肿瘤部位革兰染色图片，说明肿瘤部位有菌繁殖。

hifu辐照实验

将48只荷mda-mb-231乳腺癌移植瘤裸鼠随机分为4组，每组12只。标记为a组(pbs)、b组(双歧杆菌)，c组(阳离子脂质纳米粒)、d组(双歧杆菌+阳离子脂质纳米粒)。b、d两组荷瘤鼠分别经尾静脉注射0.2ml(浓度为5×10⁶个/ml)双歧杆菌溶液。于b、d组注射双歧杆菌后3d，a组和b组两组荷瘤鼠分别经尾静脉注射0.2ml无菌pbs，c组和d组荷瘤鼠分别经尾静脉注射0.2ml包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒溶液(0.1mg/ml)，a、b、c、d四组分别于注射pbs和包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒后24h，超声监控下对荷瘤鼠肿瘤进行hifu辐照。

hifu辐照方法及及评价指标

治疗参数：治疗头频率0.94mhz，焦距145mm，超声换能器直径220mm。荷瘤鼠用1％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，固定于实验架上使肿瘤组织浸没在治疗仪的脱气水中，超声监测到肿瘤后，找到肿瘤组织的最大切面后固定，辐照方式为点辐照，辐照功率120w，辐照时间2s。辐照后，可以观察到声像图上灰度的变化，用仪器自带软件计算出灰度变化值，并进行比较。评价指标包括：①灰度值变化(值越高代表超声信号越强，肿瘤消融效果越好，本研究比较的是hifu辐照前后灰度值的变化)；②凝固性坏死体积：v(mm³)＝(π/6)×长度×宽度×深度；③eef(j/mm³)＝p×t/v(p表示声功率(w),t表示治疗时间(s)，v表示总消融体积(mm³))，eef用于判断hifu消融肿瘤效果，eef越小表明消融效果强。

组织学观察

于hifu辐照前1d，从四组荷瘤鼠中各随机取2只荷瘤鼠处死(共8只)，完整剥离肿瘤，4％多聚甲醛固定，革兰氏染色后于镜下观察肿瘤组织中双歧杆菌的生长情况，证明双歧杆菌的肿瘤靶向性。余下各组10只荷瘤鼠(共40只)行hifu辐照后1d全部处死，完整剥离肿瘤后沿最大面切开，37℃条件下，2％ttc染色50min后，测量并计算各组肿瘤组织的凝固性坏死体积，并对凝固性坏死体积进行比较。

结果分析：

hifu的消融效果

1)声像图表现

hifu辐照后，各组的声像图表现为不同程度的灰度变化(如表1所示)。各组灰度值变化的比较：d组>c组>b组>a组。各组两两比较，差异均有统计学意义(p均<0.001)。各组的灰度值变化如表1所示。结果提示，hifu辐照时，肿瘤组织中双歧杆菌联合包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒增加了声像图的灰度值变化。

表1各组的灰度值变化、凝固性坏死体积、eef的比较表

2)消融体积及评价指标的比较

各组均可见肿瘤组织的凝固性坏死，凝固坏死区为灰白色，未坏死区表现为红色(如图1-5所示)。各组的凝固性坏死体积及eef值如表1所示。凝固性坏死体积的比较：a组<b组<c组<d组。各组两两比较，差异均有统计学意义(p均<0.05)。各组的eef值比较：a组>b组>c组>d组，各组两两比较，差异均有统计学意义(p均<0.01)。结果表明，肿瘤组织中双歧杆菌联合包裹液态氟碳的阳离子脂质纳米粒增大了凝固性坏死体积，减小了所需的eef值。

实施例2

共价键结合法制备plga微球-双歧杆菌

1、表面带有活化羧基的plga微球制备

40mgplgacooh溶于2ml三氯甲烷中，加入荧光物质dii，声振40s得初乳。将初乳与适量4％pva水溶液(即聚乙烯醇水溶液)混合后再次声振，得复乳，再加入10ml2％异丙醇水溶液，常温下磁力搅拌2h，离心，双蒸水漂洗3-5次，制得表面带羧基且标记荧光物质dil的plga微球；将羧基活化剂碳二亚胺(edc)、sulfo-nhs与表面带羧基的plga纳米粒按照摩尔比30∶30∶1充分混合于ph5.5的mes缓冲液中，室温下孵育反应60min，活化纳米粒表面所带的羧基。3500r/min×5min离心、双蒸水漂洗3-5次，去除未反应的羧基活化剂，即得表面带有活化羧基的plga微球。

2、双歧杆菌与plga微球结合

将上述edc活化羧基的plga微球与双歧杆菌本身带有的氨基共价偶联形成牢固的酰胺键，将二者分别用不同荧光信号标记，经反复漂洗后激光共聚焦显微镜下观察，如图2-1所示，可见到二者的结合，从而可以证实双歧杆菌与plga微球的有效结合。

利用上述方法，取微量溶液静置于云母片上，自然条件下干燥24小时后，在原子力显微镜下观察，如图2-2所示，即使部分双歧杆菌由于在脱水状态下皱缩变形，其细菌表面仍然可见plga纳米粒缀合。

采用小动物活体荧光成像仪进行荧光成像观察，如图2-3所示，dir标记plga呈红色荧光。24小时后，plga组肿瘤区可见强荧光信号，与b.longum+plga组相比有显著的统计学差异。随着时间的推移，两组肿瘤区的荧光信号逐渐减弱，第216小时，plga组肿瘤区荧光信号变得非常微弱甚至消失，而实验组肿瘤部位仍然可见看到较强的荧光信号，二者相比有显著统计学差异。我们认为，这可能与双歧杆菌的生物相容性和不活动的特性，以及与plga结合后的稳定性有关。

如图2-4所示，在治疗时间不变的条件下，使用梯度的hifu治疗功率观察肿瘤的消融体积，hifu治疗条件分别为90w、3s；120w、3s；150w、3s，24小时后处死瘤鼠，剖开肿瘤后采用2％ttc水溶液在37℃条件下静置染色30分钟。可见，单纯hifu治疗组肿瘤内白色的凝固性坏死体积明显小于plga组和b.longum+plga组，而plga组的凝固性坏死体积也小于b.longum+plga组，有统计学差异(p<0.05)。

综上所述，本发明公开一种高强度聚焦超声(highintensityfocusedultrasound,hifu)生物(双歧杆菌)靶向增效剂及其制备方法，具体是将双歧杆菌和hifu增效剂结合而成。双歧杆菌是一种对人体健康有益的益生菌，生物安全性得到认证，且其专性厌氧特性可以靶向肿瘤乏氧区，并在其内进行定向增殖，有抗肿瘤的作用。hifu增效剂可以提高hifu能量沉积。本发明将双歧杆菌与hifu增效剂通过电转化法、静电吸附法、共价键结合法及生物素-亲和素法的方式进行连接。本发明的hifu生物靶向增效剂可以更精准地靶向肿瘤组织，并能够提高hifu能量沉积和时间，进而达到提高hifu靶向消融肿瘤的目的。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。