银杏叶提取物、银杏叶提取物药剂及其应用的制作方法

本发明涉及药物研发领域，具体而言，涉及一种银杏叶提取物、银杏叶提取物药剂及其应用。
背景技术：
：上世纪60年代开始，对银杏叶提取物的研究甚多，发现其具有许多的生理生化功能，例如，扩张血管改善微循环、抗氧化、抗血小板激活因子和保护细胞线粒体等，继而使得银杏叶提取物在临床上有多种应用，例如可以应用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、高血脂、哮喘、糖尿病肾病以及脑梗死等疾病，但是银杏叶提取物还有许多其他的应用未被发现。鉴于此，提出本发明。技术实现要素：本发明提供了一种银杏叶提取物、银杏叶提取物药剂及其应用。该银杏叶提取物对眼部疾病，特别是黄斑变性和糖尿病视网膜病变具有良好的治疗效果，可以用于黄斑变性疾病、糖尿病视网膜病变以及其引起的其他眼部疾病的治疗。本发明是这样实现的：第一方面，本发明实施例提供一种银杏叶提取物，其包括7-去甲基银杏双黄酮、银杏总黄酮醇苷和萜类内酯，所述银杏总黄酮醇苷和所述萜类内酯的总的质量占所述银杏叶提取物质量的50％以上，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物质量的万分之五以上；其中，上述各物质的质量百分数是以干基计。进一步地，在本发明较佳的实施例中，银杏总黄酮醇苷的质量占所述银杏叶提取物质量的18.5-37.7％，所述萜类内酯的质量占所述银杏叶提取物质量的40.4-53.7％，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物质量的万分之五-千分之一；优选地，所述银杏叶提取物还包括银杏总酸；优选地，所述银杏总酸的含量小于1ppm。进一步地，在本发明较佳的实施例中，银杏总黄酮醇苷包括槲皮素糖苷、山奈素糖苷和异鼠李素糖苷；优选地，所述槲皮素糖苷包括以下8种化合物；优选地，所述山奈素糖苷包括下述9种化合物；优选地，所述异鼠李素糖苷包括下述4种化合物：进一步地，在本发明较佳的实施例中，萜类内酯包括白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b以及银杏内酯c。第二方面，本发明实施例提供一种银杏叶提取物药剂，其包括上述银杏叶提取物。进一步地，在本发明较佳的实施例中，银杏叶提取物药剂的剂型为固体制剂或液体制剂；优选地，所述固体制剂包括片剂、颗粒剂和粉剂中的任意一种；优选地，所述液体制剂包括口服液、注射剂和滴眼剂中的任意一种。进一步地，在本发明较佳的实施例中，银杏叶提取物药剂为片剂时，所述银杏叶提取物药剂包括辅料和所述银杏叶提取物；优选地，每片中所述银杏叶提取物质量占所述银杏叶提取物药剂质量的19.75％-20.29％。进一步地，在本发明较佳的实施例中，辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、崩解起泡剂、矫味剂和润滑剂；优选地，所述稀释剂包括乳糖，所述赋形剂包括甘露醇，所述粘合剂包括羧甲基淀粉钠，所述崩解起泡剂包括富马酸和碳酸氢钠，所述矫味剂包括阿斯巴甜和浆果香精，所述润滑剂包括硬脂酸镁；优选地，以重量份计，所述银杏叶提取物药剂中包括31.25-44.13份所述银杏叶提取物、32.5-44.37份乳糖、32.5-44.37份甘露醇、13.5-18.43份羧甲基淀粉钠，25-34.13份富马酸，10-13.65份阿斯巴甜，2.5-3.4份浆果香精，10-13.65份碳酸氢钠以及1-1.37份硬脂酸镁。第三方面，本发明实施例还提供一种上述银杏叶提取物或银杏叶提取物药剂在制备治疗眼部疾病药物中的应用；优选地，所述药物是抑制黄斑区新生血管膜细胞形成的药物；优选地，所述药物是能够清除自由基以及抗血小板凝聚的药物；优选地，眼部疾病包括黄斑变性；优选地，所述眼部疾病包括糖尿病视网膜病变；优选地，所述眼部疾病包括视网膜增厚。进一步地，在本发明较佳的实施例中，在恒河猴动物实验中，所述银杏叶提取物的有效剂量为1.5-3.0mg/kg。本发明的有益效果是：本发明的银杏叶提取物通过采用7-去甲基银杏双黄酮、银杏总黄酮醇苷和萜类内酯并限定其在银杏叶提取物中的含量，使得银杏叶提取物对眼部疾病，特别是黄斑变性和糖尿病视网膜病变具有优异的治疗效果，同时，对黄斑变性或者糖尿病视网膜病变引起的其他的眼部疾病也有良好的治疗效果。附图说明为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1是本发明实施方式提供的槲皮素、山奈素和异鼠李素三种混合标准品的hplc检测结果图；图2是本发明实施方式提供的实施例1的银杏叶提取物槲皮素、山奈素和异鼠李素三种苷元的hplc检测结果图；图3是本发明实施方式提供的白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c四种混合标准品的hplc检测结果图；图4是本发明实施方式提供的实施例1的银杏叶提取物白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c四种萜类内酯的hplc检测结果图；图5是本发明实施方式提供的7-去甲银杏双黄酮标准品的hplc检测结果图；图6是本发明实施方式提供的实施例1的银杏叶提取物7-去甲银杏双黄酮的hplc检测结果图；图7是本发明实施方式提供的银杏总酸标准品的hplc检测结果图；图8是本发明实施方式提供的实施例1的银杏叶提取物银杏总酸的hplc检测结果图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例提供一种银杏叶提取物、银杏叶提取物药剂及其应用具体说明。首先，本发明实施例提供一种银杏叶提取物，其包括7-去甲基银杏双黄酮、银杏总黄酮醇苷和萜类内酯，所述银杏总黄酮醇苷和所述萜类内酯的总的质量占所述银杏叶提取物质量的50％以上，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物质量的万分之五以上。通过采用上述物质并控制上述物质的含量，使得银杏叶提取物对黄斑变性和糖尿病视网膜病变具有优异的治疗效果，同时，药物的毒副作用低。具体地，7-去甲基银杏双黄酮具有一定的细胞毒作用，可以抑制脉络膜新生血管生成，但是若其含量过高则容易损害正常细胞，因此，在上述范围中其即可以抑制新生血管的生成，又能避免对正常细胞的损害。而银杏总黄酮醇苷具有超强的抗氧化活性和部分抗血小板凝聚的作用，萜类内酯具有超强的抗血小板凝聚活性和部分清除自由基的作用，因此，上述三者合用可以有效治疗黄斑变性和糖尿病视网膜病变，且该银杏叶提取物毒副作用低。具体地，银杏总黄酮醇苷占所述银杏叶提取物质量的18.5-37.7％(以干基计)，所述萜类内酯的质量占所述银杏叶提取物质量的40.4-53.7％(以干基计)，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物质量的万分之五-千分之一。进一步分别控制银杏总黄酮醇苷、萜类内酯和7-去甲基银杏双黄酮的含量，进一步保证了银杏叶提取物的治疗效果以及其毒副作用。进一步地，银杏总黄酮醇苷包括槲皮素糖苷、山奈素糖苷和异鼠李素糖苷；其中，上述8种槲皮素糖苷槲皮素糖苷包括以下8种化合物；山奈素糖苷包括下述9种化合物；所述异鼠李素糖苷包括下述4种化合物：而萜类内酯包括白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b以及银杏内酯c。进一步地，所述银杏叶提取物还包括银杏总酸；且所述银杏总酸的含量小于1ppm。控制银杏叶提取物中银杏总酸的含量，能够进一步保证银杏叶提取物的安全性。进一步地，该银杏叶提取物中还包括游离槲皮素、游离山奈素以及游离异鼠李素等，这些物质的含量均满足国家食品药品监督管理总局关于发布银杏叶药品补充实验检验方法的报告(2015年第66号)附件《银杏叶提取物，银杏叶片、银杏叶胶囊中游离槲皮素、游离山奈素以及游离异鼠李素检测项补充检验方法》的规定。进一步地，在恒河猴动物实验中，所述银杏叶提取物的有效剂量为1.5-3.0mg/kg。需要说明的是，上述银杏叶提取物的制备方法可以参照现有技术的方法制备，只要保证制备得到的银杏叶提取物中活性成分类别以及含量满足本发明的实施例的要求即可。进一步地，本发明实施例还提供一种银杏叶提取物药剂，其包括上述银杏叶提取物。也就是可以将上述银杏叶提取物与现有技术中的辅料进行复配得到不同剂型的药剂。具体地，该银杏叶提取物药剂的剂型为固体制剂或液体制剂；其中，所述固体制剂包括片剂、颗粒剂和粉剂中的任意一种；所述液体制剂包括口服液、注射剂和滴眼剂中的任意一种。需要说明的是，也可以根据需求将上述银杏叶提取物制备为其他剂型的药剂，例如乳膏剂和凝胶剂等，该药剂的制备方法为对应剂型的常规制备方法。虽然可以根据现有剂型将银杏叶提取物与辅料混合制备对应的剂型，但是不同剂型辅料的选择不同，即使相同的剂型，其不同的辅料选择，也会对药物的释放、崩解以及稳定性等造成一定影响，因此，需要选择适宜的辅料，才能保证制备得到的银杏叶提取物药剂具有能够实际应用于临床。例如，银杏叶提取物药剂为片剂时，选择的辅料包括稀释剂、赋形剂、粘合剂、崩解起泡剂、矫味剂和润滑剂；具体地，稀释剂包括乳糖，所述赋形剂包括甘露醇，所述粘合剂包括羧甲基淀粉钠，所述崩解起泡剂包括富马酸和碳酸氢钠，所述矫味剂包括阿斯巴甜和浆果香精，所述润滑剂包括硬脂酸镁。进一步地，银杏叶提取物药剂为片剂时，以重量份计，所述银杏叶提取物药剂中包括31.25-44.13份所述银杏叶提取物、32.5-44.37份乳糖、32.5-44.37份甘露醇、13.5-18.43份羧甲基淀粉钠，25-34.13份富马酸，10-13.65份阿斯巴甜，2.5-3.4份浆果香精，10-13.65份碳酸氢钠以及1-1.37份硬脂酸镁。控制各个辅料以及银杏叶提取物的配比，保证制备得到的片剂具有良好的崩解度、释放度以及稳定性等，继而保障片剂的药效。进一步地，制备得到的片剂，每片的片重一般为158.25毫克-217.50毫克，银杏叶提取物的含量一般为31.25-44.13毫克，换算后每片中所述银杏叶提取物质量占所述银杏叶提取物药剂质量的19.75％-20.29％。控制每片的片剂中银杏叶提取物的含量，有利于保证片剂的药效。因此，本发明实施例还提供一种上述银杏叶提取物或上述银杏叶提取物药剂在制备治疗眼部疾病药物中的应用，该药物为抑制黄斑区新生血管膜细胞形成的药物；也可以是能够清除自由基以及抗血小板凝聚的药物，而眼部疾病包括黄斑变性和糖尿病视网膜病变以及所述眼部疾病包括视网膜增厚。本发明实施例提供的银杏叶提取物或者上述银杏叶提取物药剂还可以应用于眼部血流及神经障碍，例如，老年性及糖尿病引起的视网膜病变及神经障碍、视力模糊、慢性青光眼和白内障；急慢性心、脑机能不全及其后遗症，例如，心肌缺血、中风、注意力不集中、记忆力衰退、老年性痴呆；耳部血流及神经障碍，例如，耳鸣、眩晕、听力减退、耳迷路症候征；末梢循环障碍，例如，各种动脉闭塞症、间歇性跛行症、手脚麻痹冰冷、四肢酸痛；支气管平滑肌痉挛，例如，花粉、粉尘及冷空气诱发过敏导致的支气管痉挛性哮喘；消除或减轻化疗药尤其是阿霉素所致的心脏毒性等疾病的治疗。以下结合具体实施例对本发明提供的一种银杏叶提取物、银杏叶提取物药剂及其应用进行具体说明。实施例1本实施例提供一种银杏叶提取物，其中，银杏总黄酮醇苷占所述银杏叶提取物质量的37.7％，所述萜类内酯的质量占所述银杏叶提取物质量的37％，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物质量的0.521‰，银杏总酸的含量小于1ppm，游离槲皮素为1.85‰，游离山奈素为1.04‰，游离异鼠李素为0.127‰。该银杏叶提取物的制备方法，步骤如下：本品以符合中国药典2015版药用标准的银杏叶提取物为原料，经提取加工制成的提取物纯化品。取标准银杏叶提取物，热水溶解、超声、离心分离沉淀、依次采用乙酸乙酯：正庚烷(8:1)、乙酸乙酯：丁醇(6:1)两种萃取剂分别萃取、减压浓缩、洗脱残留溶剂、冻干、粉碎、分测两种纯化品中总黄酮醇苷和萜类内酯含量、复配、过筛，即得。实施例2本实施例提供一种银杏叶提取物，其中，银杏总黄酮醇苷占所述银杏叶提取物质量的36.10％，所述萜类内酯的质量占所述银杏叶提取物质量的36.00％，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物质量的0.51‰，银杏总酸的含量小于1ppm，游离槲皮素为1.96‰，游离山奈素为1.24‰，游离异鼠李素为0.14‰。该银杏叶提取物的制备方法参见实施例1。实施例3本实施例提供一种银杏叶提取物，其中，银杏总黄酮醇苷占所述银杏叶提取物质量的18.50％，所述萜类内酯的质量占所述银杏叶提取物质量的53.70％，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物的1.03‰，银杏总酸的含量小于1ppm，游离槲皮素为2.58‰，游离山奈素为0.55‰，游离异鼠李素为0.22‰。该银杏叶提取物的制备方法，步骤如下：本品以符合中国药典2015版药用标准的银杏叶提取物为原料，经提取加工制成的提取物纯化品。取标准银杏叶提取物，热水溶解、超声、离心分离沉淀、采用乙酸乙酯：正庚烷(8:1)萃取剂萃取、减压浓缩、洗脱残留溶剂、冻干、粉碎、测定纯化品中总黄酮醇苷和萜类内酯含量、过筛，即得。实施例4本实施例提供一种银杏叶提取物，其中，银杏总黄酮醇苷占所述银杏叶提取物质量的20.80％，所述萜类内酯的质量占所述银杏叶提取物质量的53.40％，所述7-去甲基银杏双黄酮的质量占所述银杏叶提取物的0.89‰，银杏总酸的含量小于1ppm，游离槲皮素为2.58‰，游离山奈素为0.55‰，游离异鼠李素为0.22‰。该银杏叶提取物的制备方法参见实施例3。实施例5本实施例提供一种银杏叶提取物药剂，其为片剂，其包括实施例1的银杏叶提取物25.86g，乳糖26克，甘露醇26克，羧甲基淀粉钠10.8克(其中，7.2克内加，3.6克外加)，富马酸20克，阿斯巴甜8克，浆果香精2克，碳酸氢钠8克以及硬脂酸镁0.8克，总共制备了800片，每片重159.3毫克，每片中银杏叶提取物含32.325毫克，即每片银杏叶提取物药剂中银杏叶提取物含20.29％。本实施例片剂的银杏叶提取物药剂的制备为常规片剂的制备方法，包括混匀—制软材—制粒—干燥—整粒—混合—压片。实施例6本实施例提供一种银杏叶提取物药剂，其为片剂，其包括实施例2的银杏叶提取物25g，乳糖26克，甘露醇26克，羧甲基淀粉钠10.8克(其中，7.2克内加，3.6克外加)，富马酸20克，阿斯巴甜8克，浆果香精2克，碳酸氢钠8克以及硬脂酸镁0.8克，总共制备了800片，每片重158.3毫克，每片中银杏叶提取物含31.25毫克，即每片银杏叶提取物药剂中银杏叶提取物含19.74％。本实施例片剂的银杏叶提取物药剂的制备为常规片剂的制备方法，包括混匀—制软材—制粒—干燥—整粒—混合—压片。实施例7本实施例提供一种银杏叶提取物药剂，其为片剂，其包括实施例3的银杏叶提取物25.86g，乳糖26克，甘露醇26克，羧甲基淀粉钠10.8克(其中，7.2克内加，3.6克外加)，富马酸20克，阿斯巴甜8克，浆果香精2克，碳酸氢钠8克以及硬脂酸镁0.8克，总共制备了586片，每片重217.5毫克，每片中银杏叶提取物含44.13毫克，即每片银杏叶提取物药剂中银杏叶提取物含20.29％。本实施例片剂的银杏叶提取物药剂的制备为常规片剂的制备方法，包括混匀—制软材—制粒—干燥—整粒—混合—压片。检测对实施例1制备得到的银杏叶提取物各成分进行含量检测，样品即为实施例1提供的银杏叶提取物，具体检测如下：(1)总黄酮醇苷仪器:高效液相色谱仪(配紫外检测器)；电子天平(万分之一)；超声波清洗器；恒温水浴锅。试剂:槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品；乙腈(色谱纯)；水(去离子水)；甲醇、盐酸、磷酸(分析纯)。对照品溶液的配制：取槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含槲皮素、山柰素和异鼠李素均为30μg的混合溶液，即得。样品处理:取样品约35mg于250ml平底烧瓶中，加甲醇-25％盐酸(4:1，临用新配)混合溶液50ml，于80℃水浴回流30min，迅速冷却至室温，转移至100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，取滤液上机测定。色谱条件:色谱柱：c18柱(4.6mm×250mm，5.0μm)；流动相：乙腈：水：磷酸＝40:60:0.25；流速:1.0ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；检测波长：360nm。样品测定：准确称取样品溶液和对照品溶液各10μl(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分离测定，以对照品溶液的保留时间进行定性，外标法进行定量。结果计算：式中：xi——样品中槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，％；as——样品溶液的峰面积；astd——对照品溶液的峰面积；cstd——对照品溶液的浓度；单位为微克每毫升(μg/ml)；v——样品定容体积，单位为毫升(ml)；m——样品的称样量，单位为克(g)；10000——单位换算系数。x＝(x1+x2+x3)×2.51式中：x——样品中总黄酮醇苷含量，％。x1、x2、x3——分别为样品中槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，％。计算结果用平行测定的算数平均值表示，保留3位有效数字。检测结果参见图1和图2，计算得到银杏总黄酮醇苷含量为37.70％(以干基计)。(2)萜类内酯仪器：高效液相色谱仪(配蒸发光散射检测器)；电子天平(万分之一)；超声波清洗器。试剂：银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c和白果内酯对照品；甲醇(色谱纯)；乙酸乙酯、四氢呋喃、盐酸、乙酸钠(分析纯)；水(去离子水)。对照品溶液的配制：取银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c和白果内酯对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c和白果内酯均为0.30mg的混合溶液，即得。样品处理：精密称取样品40mg于50ml聚丙烯刻度离心管中，加水10ml，置超声波中超声溶解，加2滴37％盐酸，用乙酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％乙酸钠溶液20ml洗涤，分取乙酸钠溶液，再用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，将得到的萃取液减压浓缩至干，用甲醇转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，取滤液上机测定。色谱条件：色谱柱：c18柱(4.6mm×250mm，5.0μm)；流动相：甲醇：四氢呋喃：水＝25:10:65；流速:1.0ml/min；柱温：35℃。检测器参数：agilenttechnologieselsd；evaporatortemperature：35℃；nebulizertemperature：35℃；gasflowrate：1.5slm。样品测定：分别精密吸取对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl，供试品溶液10～l00μl,注入液相色谱仪，测定,以对照品溶液的保留时间进行定性，用外标四点法对数方程分别计算银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c和白果内酯的含量，即得。结果计算：xi＝exp[(lnsy-a)/b)]/vj×vd×f/m/10式中：xi——样品中银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c和白果内酯的含量，％；sy——样品峰面积；a——截距；b——斜率；vj——样品进样量，单位为微升(μl)；vd——样品定容体积，单位为毫升(ml)；f——样品溶液的稀释倍数；m——样品的称样量，单位为克(g)；10——单位换算系数。x＝x1+x2+x3+x4式中：x——样品中萜类内酯含量，％。x1、x2、x3、x4——分别为样品中银杏内酯a、银杏内酯b、银杏内酯c和白果内酯的含量，％。计算结果用平行测定的算数平均值表示，保留3位有效数字。检测结果参见图3和图4，计算得到的萜类内酯含量为37.00％(以干基计)。(3)7-去甲基银杏双黄酮仪器：高效液相色谱仪(配紫外检测器)；电子天平(万分之一)；超声波清洗器。试剂：7-去甲基银杏双黄酮对照品；甲醇、乙腈(色谱纯)；水(去离子水)；甲醇、二甲亚砜、磷酸(分析纯)。对照品溶液的配制：标准储备液：精密称取7-去甲基银杏双黄酮0.0300g，置于100ml容量瓶中，加入二甲基亚砜2.0ml进行超声溶解，再加入75％甲醇80ml超声混匀后，用75％甲醇定容；标准工作液：用75％甲醇溶液将标准储备液逐级稀释成浓度分别为29.4μg/ml、5.88μg/ml、1.18μg/ml、0.236μg/ml、0.0588μg/ml的系列标准工作液。样品处理：精密称取样品0.1000g，置于50ml容量瓶中，加入75％甲醇45ml，超声波辅助提取10min，冷却至室温后用75％甲醇定容，用0.45μm滤膜过滤，取滤液上机测定。色谱条件：色谱柱：c18柱(4.6mm×250mm，5.0μm)；流动相：0.1％磷酸(a)-乙腈(b)，梯度洗脱：30％b(0～4min)；30～100％b(4～25min)；100％b(25～30min)；100～30％b(30～31min)；30％b(31～35min)；流速:1.0ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；检测波长：330nm。样品测定：准确称取样品溶液和对照品溶液各10μl(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分离测定，以对照品溶液的保留时间进行定性，外标法进行定量。结果计算：样品中7-去甲银杏叶双黄酮的含量以质量分数x表示，数值以毫克每克(‰)表示，计算公式如下：式中：as——样品溶液中7-去甲基银杏双黄酮的峰面积；astd——对照品溶液中7-去甲基银杏双黄酮的峰面积；cstd——对照品溶液中7-去甲基银杏双黄酮的浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；v——样品定容体积，单位为毫升(ml)；m——样品的称样量，单位为克(g)；1000——单位换算系数。计算结果用平行测定的算数平均值表示，保留3位有效数字。检测结果参见图5和图6，计算得到7-去甲基银杏双黄酮含量为0.521‰。(4)银杏总酸照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm,柱内径为4.6mm,粒径为5μm)；以含0.1％三氟乙酸的乙腈为流动相a,含0.1％三氟乙酸的水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。对照品溶液的制备取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含1μg的溶液，作为对照品溶液；另取总银杏叶酸对照品适量，用甲醇制成每lml含20μg的溶液，作为定位用对照溶液。供试品溶液的制备取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml,称定重量，趄声使其溶解，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各50μ1,注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏叶酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏叶酸含量，即得。本品含总银杏叶酸不得过1.0mg/kg。检测结果参见图7和图8，检测结果：银杏总酸未检出，(＜1ppm)。(5)乙酸乙酯不得过0.5％照气相色谱法(通则0521)测定。正庚烷不得过0.5％照气相色谱法(通则0521)测定。正丁醇不得过0.5％照气相色谱法(通则0521)测定。黄酮苷元峰面积比按上述含量测定项下的总黄酮醇苷色谱计算，槲皮素与山柰素的峰面积比应为0.8～1.2。对实施例2-实施例4的银杏叶提取物也采用相同方法进行上述检测，检测结果与对应实施例各物质含量匹配。实验例1检测实施例1的银杏叶提取物(供试品1)和实施例3的银杏叶提取物(供试品2)对dpph自由基的清除能力。检测方法如下：试验设一个参比对照组，注射液，实验方法同供试品，比较供试品与参比对照品的清除dpph自由基能力。准确称取dpph试剂7.9mg，用无水乙醇(分析纯)溶解，并定容至100ml，配制成最终浓度为0.2mmol/l的dpph乙醇溶液，放置于棕色瓶中，现用或2～8℃冷藏保存备用。分别将实施例1和3银杏叶提取物配制成以银杏总黄酮醇苷浓度为基准的供试品—无水乙醇溶液；为消除96孔板的边缘效应，弃去周边的孔不用，从2b孔开始，每孔加入20μl供试品和200μldpph溶液，重复3孔，此为实验组，测定值记为ai；对照组每孔加入20μl无水乙醇和200μldpph溶液，重复3孔，测定值记为aj；空白组加入20μl供试品和200μl无水乙醇，重复3孔，测定值记为a0。避光保存，室温下反应40min，517nm下用酶标仪测定吸光值。根据测得的数据，计算供试品的dpph清除率，采用excel和origin8.0进行数据处理和分析，以供试品浓度的对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，绘制出供试品清除自由基作用的量效关系曲线，求得受试样品的ec50浓度。dpph自由基清除率(％)＝[1-(ai-aj)/a0]×100％为验证试验的可靠性，采用已知强还原剂维生素c(抗坏血酸钠)作为阳性对照，配制抗坏血酸钠的系列溶液，按上述方法测定其自由基清除率，同时，为进一步验证试验的可重复性，所有试验完成后再重复进行一次。两次试验中，阳性对照品抗坏血酸钠的清除dpph自由基ec50值分别为65.72μg/ml和70.06μg/ml，进而验证了本试验方法的可靠性，供试品1～2和参比对照品对dpph清除能力的两次试验结果汇总如下：备注：ec50值＝银杏总黄酮醇苷浓度在本试验条件下，实施例1的银杏叶提取物(供试品1)和实施例3的银杏叶提取物(供试品2)及参比对照品对dpph自由基清除的有效性成立。供试品(1～2)清除dpph自由基的能力相当，均明显强于金纳多。实验例2检测实施例1的银杏叶提取物(供试品1)和实施例3的银杏叶提取物(供试品2)、参比对照(金纳多注射液)抗血小板凝聚活性。通过测定小鼠凝血时间(ct)，检测实施例1的银杏叶提取物对小鼠的抗凝血效果。具体方法如下：取检疫合格的km小鼠30只，4～6周龄，雄雌各半，按性别随机分为5组(即阴性对照组、阳性对照组、实施例1的银杏叶提取物(供试品1)组、实施例3的银杏叶提取物(供试品2)组、参比对照品组)，每组6只。采用单次尾静脉注射方式给药，实施例1的银杏叶提取物(供试品1)组给予实施例1的银杏叶提取物，实施例3的银杏叶提取物(供试品2)组给予实施例3的银杏叶提取物，参比对照品组给予金纳多注射液，给药剂量均为2.45mg/kg，给药容积均为0.07ml/10g，阴性对照组给予同体积的生理盐水，阳性对照组给予同体积肝素钠注射液(给药浓度为1250单位/ml)。给药后10分钟，用折断的毛细管(约1.5cm长)对小鼠进行眼内眦取血，去掉第1滴血后，在载玻片上滴1滴血，立即用秒表计时，每隔30s用大头针自血滴边缘向中间轻挑1次，当有血丝挑起时停止计时，并记录时间，即为体外凝血时间。试验结果以均数±标准差(x±s)表示，采用excel软件进行统计学处理，各组与阴性对照组间的凝血时间差异采用配对t检验比较，检验水准p值为0.05。阳性对照品(肝素钠)组所有小鼠凝血时间均＞600s，统计学显著长于阴性对照组，认为本试验方法可靠。检测结果如下：备注：1：供试品1～2及金纳多组给药剂量以银杏叶提取物计，2：肝素钠预试验给药剂量为12500单位/kg，正式试验剂量为8750单位/kg；*：p＜0.05；**：p＜0.01。在本试验条件下，实施例1的银杏叶提取物(供试品1)和实施例3的银杏叶提取物(供试品2)及参比对照品延长小鼠凝血时间的有效性成立。与阴性对照品相比，各供试品及参比对照品在近似金纳多临床剂量下均可延长小鼠凝血时间，且供试品1～2效果强于金纳多。实验例3检测实施例1的银杏叶提取物对视网膜增厚影响。检测方法如下：对4只恒河猴进行眼底激光造模，具体地，以氯胺酮8mg/kg肌肉注射麻醉。动物双眼均在黄斑区围绕中心凹以激光光凝8个点。激光参数为：波长532nm，能量0.6-0.7w，光斑直径50μm。激光光凝3周后进行眼底血管荧光造影和oct检查。眼睛形成三级或四级荧光渗漏光斑被认为造模成功，总共造模成功5只眼。造模后21天开始口服给予实施例1的银杏叶提取物1.5mg/kg。给药前16天为每天单次给药(1.5mg/kg/d)，给药17-28天为每天给药两次(也就是总共3.0mg/kg/d)。造模后每天观察动物临床症状，并分别在给药后14天、28天进行检查并计算荧光素渗漏面积改善率、眼底视网膜增厚改善率。表1荧光素渗漏面积改善率(％)根据表1可知，本发明实施例提供的银杏叶提取物中有1个眼的cnv荧光素渗漏面积降低，两个眼在d28的cnv荧光素渗漏面积比d14更小。表2眼底视网膜增厚改善率(％)眼球编号给药d14给药d281-64.1-75.32-142.3-151.93113.9188.9418.276.15-25.9-21.5根据表2可知，给药后5个眼中有3个眼的cnv视网膜增厚降低，有1个眼在d28的cnv视网膜增厚比d14更低。说明本发明实施例提供的银杏叶提取物对视网膜增厚有一定的降低作用趋势。同时，检测上述实验过程中动物的特征的变化，上述实验动物的采食、行为活动、体表毛色、血液生化、体重等未见异常情况，说明本发明实施例提供的银杏叶提取物毒副作用低。以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12