专利名称：银杏叶提取物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物特指制备银杏叶提取物的工艺方法。
背景技术：
银杏叶(Trifolium pratense L.)是银杏科银杏属植物银杏(Ginkgo biloba L.)的叶。银杏叶提取物含有黄酮类、萜内酯类、多酚类、有机酸、聚异戊烯醇多种微量元素等有效成分，具有抗氧化作用、抗血小板激活因子作用、降血脂、血糖作用、改善心、脑血液循环作用、对中枢神经系统、消化系统、呼吸系统的保护作用等药理临床作用。以银杏叶和银杏叶提取物为原料制成的药品、保健品、化妆品及其他相关产品风靡全球，银杏叶提取物多年稳居的全球销售额前列。银杏是我国的特产植物之一，也是我国大宗出口植物原料药品种之一，资源丰富，约占世界总量70％以上，具有广阔的市场前景。
国内外银杏叶提取物的提取方法主要有水或有机溶剂法水或有机溶剂提取，结合树脂精制的方法，如CN116532A；超临界流体提取法，如CN172669；高速逆流色谱提取法；酶法等方法。
用水提法提取银杏叶，近年来也有相关的专利或报道。以水提法工艺生产的银杏叶提取物(EGB)，现在提的最多的是在水中添加HB一96添加剂的水提工艺，以添加HB一96特殊添加剂的水作溶剂，将银杏叶中有效成份充分浸提出来。
这些方法存在一定的不足如有机溶剂法生产成本高，环境影响大；结合树脂精制的方法生产成仍然高，且产品水溶性不好；超临界流体提取法和高速逆流色谱提取法等在用于工业生产时，在设备上需要投入比较多的资金，生产成本高。
用新鲜银杏叶为原料提取，近年来也有相关的专利或报道。
CN1436784A(生产高活性银杏叶提取物的萃取剂及其提取与分析方法)，该发明采用亚硫酸盐或亚硫酸氢盐0.001-0.5水补充至100，pH值为2.0-5.5的萃取剂，用这种萃取剂提取后，提取液过滤，滤液过树脂吸附柱，用低级醇洗脱，洗脱液浓缩，干燥得到银杏叶提取物。在该专利中，有关原料可以是银杏鲜叶，或是经过干燥的银杏叶，所述的叶不需要经过粉碎。该发明在水中添加了硫酸盐或亚硫酸氢盐添加剂，对原料没有作相关处理而是直接进行水进行浸提，因而容易影响后续收率和提取率，其相应的生产成本也较高。
CN1481793(一种银杏叶提取物及含有它的注射液)，该发明涉及一种银杏叶提取物，该提取物通过以下方法制备鲜银杏叶清洗打浆，稠厚浆液用乙醇提取，醇提液用碱调pH8-10，过滤，滤液用酸调pH3-8，优选5-6，过滤，滤液回收乙醇，获得黑棕色粘稠物，热水提取，水提液冷藏过滤，滤液上大孔树脂柱脱盐，梯度乙醇洗脱，回收乙醇，任选检测浓银杏叶提取液总黄酮含量。该发明还涉及银杏叶注射液，其制备包括进一步将上述提取物制成注射液。该发明主要采用的是醇提取，工艺步骤也较多也较为复杂，不利于实际生产操作，生产成本也会相应增加。
发明内容
本发明的目的为提供一种成本低、工艺相对简单、又能提高提取率、产物杂质少、且环境污染少的银杏叶提取物的制备方法。
本发明中提取物的制备是通过下述方式实现的本发明采用新鲜银杏叶为原料，将新鲜银杏叶加水打浆，压榨，得压榨液和压榨渣，将压榨液提取分离制成银杏叶提取物。
本发明中通过压榨得到的压榨液可得到原料中大部分生物活性成分，直接用压榨液提取分离，就可得到具有大部分活性成分的银杏叶提取物。
所述的压榨液通过如下方式提取分离将压榨液，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，用水和乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥后得压榨液的粗提物用90％以上的乙醇提取精制得银杏叶提取物。
由于压榨渣中还有一小部分活性成分，针对压榨渣部分，发明人用水提法，再将压榨渣进行提取分离，这样可进一步综合利用了新鲜银杏叶原料，也同时提高了提取率和收率。
所述的压榨渣通过如下方式提取分离将压榨渣用热水提取，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，用水和乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥后得压榨渣的粗提物用90％以上的乙醇提取精制得银杏叶提取物。
或是将干燥后得到的压榨渣的粗提物和压榨液的粗提物合并用90％以上乙醇提取精制得银杏叶提取物。
所述的加水打浆是用重量比为2-10∶1的水与鲜银杏叶混合匀浆。
所述的银杏叶提取物的原料采用的是新鲜状态的，4-10月份采摘的银杏绿叶，最佳采收季节是6-7月。最佳采收树龄为3-5年。
发明人研究发现在本发明中按下述工艺生产的银杏叶的提取物为最优的工艺路线。首先用新鲜银杏叶加水打浆，压榨后得到压榨液和压榨渣，压榨液过大孔吸附树脂柱，用水和乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥后用90％以上的乙醇提取精制得银杏叶提取物。这一部分压榨液所得到的提取物的含量(银杏叶总黄酮醇苷大于30％，总萜内酯大于10％)。压榨渣用热水提取，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，用水和乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥后经90％以上的乙醇提取精制得银杏叶提取物，这一部分由压榨渣所得的提取物的含量(银杏叶总黄酮醇苷大于24％，总萜内酯大于6％)。这种工艺方法最简便、成本低、杂质量少，环境污染小。
由本发明所得的银杏叶提取物活性物质黄酮醇苷不小于24％，总萜内酯不小于6％，属于“绿色工艺”，溶剂残留少，生物活性高，可作为银杏叶胶囊、片剂、胶丸、滴丸等，尤其是银杏叶注射液、健康饮料、化妆品等的优质原料，进行深加工，制成相应的产品。
在发明公开号CN1481793中采用新鲜银杏叶打浆，浆液则直接用醇提取，与本发明中压榨液和压榨渣分别处理方法不同，这种分别处理使得本发明其后的工艺程序更有针对性，有利于提高提取率、减少杂质等，且本发明中压榨渣也用水提取，不是用醇提取。本发明由压榨液制得提取物为收率最大部分，这种分开处理是根据压榨液已经将大部分活性成分提取出来，压榨渣部分用水再次进入细胞内部进行提取，在抓住重点的同时综合利用了新鲜银杏叶原料，也在同时提高了提取率和收率。
本发明采用采取水提法，先进行压榨处理，有机溶剂用量大大减少，由于是新鲜银杏叶体内生物活性成分为均态存在，细胞液系统稳定，而其细胞壁比较脆弱，这时进行匀浆压榨，可使细胞壁破坏，活性成分被快速提取出来。而现有技术在多用干叶进行有机溶剂提取，而干叶的细胞壁的角质化，水难以进入细胞内部，细胞液系统环境发生改变，只能用有机溶剂提取。这种提取的原理是有机溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了活性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，有机溶剂又不断进入细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，才尽最大可能将活性成分溶出。而这样的提取不但提高了生产成本，而有机溶剂在提取过程中也增加了分离的难度。本发明由压榨后所得的压榨液获得的银杏叶提取物的收率超过3％，活性成分含量黄酮醇苷大于30％，总萜内酯大于10％，足以证明其优势，用榨汁液过柱，醇洗脱液浓缩干燥，后用90％以上乙醇精制，这是现在所有专利和报道中都未从涉及过的工艺。
而压榨后的压榨渣，虽然活性成分含量没有压榨液高，用水提取，水易于进入细胞内部，获得的提取物活性成分含量黄酮醇苷大于24％，总萜内酯大于6％。
采用本发明的工艺，有机溶剂用量大大减少，而得到具有较高的收率和高含量的成品，尤其体现在由压榨液部分的优化处理所制得的提取物上，表明本发明是低成本，高收率，高含量的环保工艺方法，为以银杏叶提取物深加工成药品、保健品、化妆品等提供基础技术支持，有利于顺利开发相关产品。
发明人通过对银杏叶不同的处理方式对银杏叶中黄酮醇苷和萜内酯的含量的分析，发现常用的干燥银杏叶(烘干或是晒干)的黄酮醇苷和萜内酯类含量与鲜品相比，差距相当明显，鲜银杏叶中黄酮醇苷和萜内酯类含量最高。现有的银杏叶提取工艺多用银杏叶干品为原料提取，而根据对干、鲜成分的对比得知鲜叶中有效成分含量高于干叶，且随贮存时间的增长而含量渐低。因此本发明中采用新鲜状态的银杏叶为原料。具体数据见下表表1不同原药材处理方式的银杏叶的黄酮醇苷和萜内酯的含量
发明人通过对新鲜药材的整个生长周期的考察，发现有效成分生物量最高的时期，以此阶段银杏叶为原料，能大大降低工业化生产成本，提高产品得率。结果发现树龄为3-5年，6-7月的银杏叶的新鲜药材为最佳原料状态方式。具体数据见下表，表2，6月12-16日间收集不同树龄的新鲜银杏叶，进行含量测定的所得到的数据表，表3，对4年生树龄的不同时间新鲜银杏叶的含量测定。
表2 6月12-16日间收集不同树龄的新鲜银杏叶的黄酮醇苷和萜内酯的含量
发明人没有对树龄为三年以下的银杏叶作处理，一方面因为一年和两年生的银杏，植株小，树叶少，也就是说银杏叶生物总量不多，另一方面，在这一阶段的采摘不利于银杏的生长。因此，发明人仅对树龄在3年以上的银杏作研究分析。
在对树龄对银杏叶的黄酮醇苷和萜内酯的含量分析中，发现3-5年生的银杏叶黄酮醇苷和萜内酯的含量最高，是最佳的采收树龄。但是考虑到银杏叶的生产商综合利益，结合对银杏叶的含量分析，3-10年生的银杏叶都可用，只是，随着树龄的增长，原料中黄酮醇苷和萜内酯的含量降低，会影响提取率和收率。
表3 4年生树龄的不同时间的新鲜银杏叶的黄酮醇苷和萜内酯的含量
银杏叶在秋末会变黄，一般为绿叶状态时间在4-10月，4月到5月下旬位于银杏叶的展叶期，银杏叶生物量少，且银杏叶采摘期过早会对银杏的生长产生不利影响，因此本发明中，原料为4-10月采摘的银杏绿叶，而6-7月为原料最佳采收期。
发明人考虑到银杏叶在次生代谢过程中其黄酮醇苷和萜内酯等有效成分在生长期的高水平积累的特征，结合优化的工艺方法，提高了原料的有效成分的提取率，有利于后期的高纯度提取物制备以及提高产品得率，降低成本；以此提取物为原料深加工，开发药品、化妆品、保健品等具有更优的品质。
本发明中将新鲜银杏叶加水打浆，压榨后得压榨液和压榨渣，将压榨液和压榨渣分别提取分离，制成银杏叶提取物。经压榨所得的压榨液和压榨渣的提取分离方法也可用其它现有方法进行制备，如有机溶剂法例如对压榨渣采用乙醇提法，将压榨渣用乙醇回流提取，提取液浓缩，热水提取，过滤，滤液过柱，用水和乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥得银杏叶提取物；如超临界流体提取法，例如采用超临界二氧化碳提取法、酶法、高速逆流色谱提取法等。
具体实施例方式
以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1选取新鲜状态的、无腐坏、于7月采摘的树龄为3年的鲜银杏叶1kg，加2kg水破碎成匀浆，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物，将压榨液粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得8.2g提取物，测得含量为黄酮醇苷34.4％，萜内酯14.1％。
原料折干计总收率为2.79％。
实施例2选取新鲜状态的、无腐坏、于7月采摘的树龄为4年的鲜银杏叶1kg，加2kg水破碎成匀浆，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物，将压榨液粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得6.0g提取物，测得含量为黄酮醇苷32.6％，萜内酯14.1％。
压榨渣用5倍量热水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨渣粗提物，将压榨渣粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得3.4g提取物，测得含量为黄酮醇苷26.8％，萜内酯8.3％。
原料折干计总收率为3.10％。
实施例3选取新鲜状态的、无腐坏、于7月采摘的树龄为4年的鲜银杏叶1kg，加2kg水破碎成匀浆，再加1kg的水搅拌1小时，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物。
压榨渣用5倍量热水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨渣粗提物。
将压榨液粗提物和压榨渣粗提物合并，用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得9.8g提取物，测得含量为黄酮醇苷28.9％，萜内酯11.2％。
原料折干计总收率为3.23％。
实施例4选取新鲜状态的、无腐坏、于6月采摘的树龄为3年的鲜银杏叶1kg，加4kg水破碎成匀浆，再加4kg的水搅拌1小时，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物。将压榨液粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得8.1g提取物，测得含量为黄酮醇苷34.9％，萜内酯14.4％。
压榨渣用5倍量热水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨渣粗提物，将压榨渣粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得3.5g提取物，测得含量为黄酮醇苷27.2％，萜内酯7.8％。
原料折干计总收率为3.89％实施例5选取新鲜状态的、无腐坏、于6月采摘的树龄为3年的鲜银杏叶1kg，加2kg水破碎成匀浆，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物，压榨渣用5倍量热水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨渣粗提物。
将压榨液粗提物和压榨渣粗提物合并，用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得12g提取物，测得含量为黄酮醇苷32.3％，萜内酯12.1％。
原料折干计总收率为4.02％实施例6选取新鲜状态的、无腐坏、于6月采摘的树龄为7年的鲜银杏叶1kg，加4kg水破碎成匀浆，再加6kg的水搅拌1小时，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物，将压榨液粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得5.4g提取物，测得含量为黄酮醇苷26.9％，萜内酯13.2％。
压榨渣用5倍量热水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨渣粗提物，将压榨渣粗提物用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得3.6g提取物，测得含量为黄酮醇苷26.5％，萜内酯7.3％。
原料折干计总收率为3.06％。
实施例7选取新鲜状态的、无腐坏、于6月采摘的树龄为7年的鲜银杏叶1kg，加5kg水破碎成匀浆，再加2kg的水搅拌1小时，压榨。压榨液用滤纸抽滤后过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨液粗提物。
压榨渣用5倍量热水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到压榨渣粗提物。
将压榨液粗提物和压榨渣粗提物合并，用90％乙醇回流提取，提取液经醇回收、提取液浓缩、干燥后得9.3g提取物，测得含量为黄酮醇苷26.1％，萜内酯10.6％。
原料折干计总收率为3.16％。
实施例8选取新鲜状态的、无腐坏、于6月采摘的树龄为3年的鲜银杏叶600kg，加入2000kg水，破碎成浆，再加水1000kg，搅拌1小时，稀释液过板框压滤机制成澄清透明的压滤液，滤液过D101大孔吸附树脂柱，用水洗脱后，用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至10-15波美，真空干燥得压滤液粗提物，压滤液粗提物以90％乙醇回流提取1小时，过滤，干燥得银杏叶提取物4.02kg，测得含量为黄酮醇苷34.6％，萜内酯14.7％。
压滤渣以5倍量水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥得压滤渣粗提物，压滤渣粗提物以90％乙醇回流提取1小时，过滤，干燥得银杏叶提取物1.9kg，测得含量为黄酮醇苷25.7％，萜内酯7.6％。
原料折干计总收率为3.46％。
实施例9选取新鲜状态的、无腐坏、于6月采摘的树龄为3年的鲜银杏叶600kg，加入2400kg水，破碎成浆，再加水3000kg，搅拌1小时，稀释液过板框压滤机制成澄清透明的压滤液，滤液过D101大孔吸附树脂柱，用水洗脱后，用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至10-15波美，真空干燥得压滤液粗提物。
压滤渣以5倍量水提取2小时，过滤，滤液过D101大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，后用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥得压滤渣粗提物。
将压滤液粗提物和压滤渣粗提物合并，以90％乙醇回流提取1小时，过滤，干燥得银杏叶提取物7.03kg，测得含量为黄酮醇苷30.6％，萜内酯12.2％。
原料折干计总收率为3.71％。
权利要求
1.银杏叶提取物的制备方法，将新鲜银杏叶加水打浆，压榨，得压榨液和压榨渣，将压榨液进行提取分离，制成银杏叶提取物。
2.根据权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，所述的压榨液通过如下方式提取分离将压榨液过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水，然后用乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥后得压榨液的粗提物用90％以上乙醇提取精制得银杏叶提取物。
3.根据权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，再将压榨渣进行提取分离，制成银杏叶提取物。
4.根据权利要求3所述的银杏叶提取物的制备方法，所得的压榨渣通过如下方式提取分离用热水提取，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，先用水，然后用乙醇洗脱，收集醇洗脱液，浓缩、干燥后得压榨渣的粗提物用90％以上乙醇提取精制得银杏叶提取物。
5.根据权利要求2或4所述的银杏叶提取物的制备方法，将压榨渣的粗提物和压榨液的粗提物合并用90％以上乙醇提取精制得银杏叶提取物。
6.根据权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，所述的新鲜银杏叶加水打浆是用重量比为2-10∶1的水与鲜银杏叶混合打浆。
7.根据权利要求1所述的银杏叶提取物的制备方法，所述的新鲜银杏叶是4-10月采摘的银杏绿叶。
8.根据权利要求7所述的银杏叶提取物的制备方法，所述的新鲜银杏叶是由树龄为3-5年银杏树，于6-7月采摘的银杏绿叶。
全文摘要
银杏叶提取物的制备方法，将新鲜银杏叶加水打浆，压榨后得压榨液和压榨渣，将压榨液提取分离，制成银杏叶提取物。本发明基于原料选择的优势基础和对工艺的优化，尤其是针对压榨液部分的优化处理和不使用有机溶剂提取，使得本发明为成本低、工艺相对简单、又能提高收率和提取率、减少杂质和环境污染的方法。
文档编号A61P9/10GK1957958SQ20061003207
公开日2007年5月9日 申请日期2006年8月9日 优先权日2006年8月9日
发明者曾建国, 缪建荣, 欧阳勇, 罗琪, 袁莉 申请人:湖南九汇现代中药有限公司