红花多糖在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是红花多糖在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。

背景技术：

黑色素瘤(melanoma)为交界痣或混合痣发展来的恶性变化的色素斑痣，研究表明，其发病率以中青年人群为首。黑色素瘤较之其他类型的皮肤癌并不常见，但死亡数占皮肤癌相关死亡的73％。患者确诊时多已发生转移，肿瘤转移是致使患者死亡的主要因素，晚期转移性黑色素瘤患者的中位生存期为7.5个月，5年生存率仅为5％。

虽然近年来对于转移性黑色素瘤治疗的研究有了一定进展，但临床上转移性黑色素瘤患者的死亡率并未得到明显的改善。在我国传统医学中，将黑色素瘤归属于“黑子”、“脱疽”等范畴，血瘀是其发生发展的重要原因之一。机体虚损，或外邪搏于血气，或阳气束结而致血瘀结聚，形成乌黑肿块。《诸病源候论·黑痣候》云：“有黑痣者，外邪搏于血气，变化生也。”

中医传统治法主要有扶正法与祛邪法两类，研究证实，扶正类药物黄芪与祛邪类药物苦参的活性成分均可通过调节机体免疫功能发挥抗黑色素瘤的作用。巨噬细胞是一种源自单核细胞的重要固有免疫细胞，具有很强的可塑性，在肿瘤微环境中可极化为m1型(经典激活)或m2型(替代激活)。m1型巨噬细胞为促炎表型，通过分泌相关炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)、白介素-1β(lnterleukin-1β,il-1β)等抑制肿瘤生长与转移，可在体外由lps或ifn-γ诱导产生；m2型巨噬细胞为免疫抑制表型，通过分泌il-10等免疫抑制因子诱使肿瘤细胞发生侵袭、迁移，可在体外由il-4诱导产生。

中药红花是临床上最常用的经典活血化瘀类中药，具有活血祛瘀、通络止痛的功效，属于祛邪治法。相关研究表明，红花可有效抑制包括黑色素瘤在内的多种肿瘤的生长与转移。红花多糖(safflowerpolysaccharide,sps)是中药红花的重要活性成分之一，具有良好的抗肿瘤与免疫调控作用，可通过调控机体免疫系统发挥抗肿瘤作用。研究证实，红花多糖可显著抑制胃癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。

中国专利cn104855982a公开了一种黑色素瘤非全营养配方食品，按下列原料及其用量进行配方，药食两用的提取物及新资源食品:冬虫夏草(冬虫夏草菌丝体)12g、石斛11g、黄芪8g、灵芝孢子粉10g、紫河车9g、土鳖虫9g、灵芝10g、当归8g、红花8g、白茅根7g等。

中国专利：cn201810036837.x公开了一种红花多糖、其制备方法及在抗肿瘤药物中的应用，具体而言，涉及一种红花多糖hh1-1、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的用途。该专利说明书中提到了：用本专利的红花多糖hh1-1或含有其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物中用途，实验过程中筛选了9种常见肿瘤包括乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、肝癌、大肠癌、宫颈癌、黑色素瘤、肺癌，发现红花多糖hh1-1可特异性抑制胰腺癌细胞增殖，但对其他肿瘤细胞包括黑色素瘤细胞无抑制作用。

本专利在现有专利文献给出了相反的技术启示的基础上，克服了其缺陷，提出了红花多糖可作为唯一活性成分用于制备抗黑色素瘤药物的内容。关于本发明红花多糖在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供红花多糖的新用途以及一种新的治疗黑色素瘤的药物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了红花多糖在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。

进一步地，本发明提供了红花多糖在制备抑制黑色素瘤细胞侵袭和/或迁移和/或增殖和/或生长的药物中的应用。

进一步地，本发明提供了红花多糖在制备抑制皮肤恶性黑色素瘤细胞侵袭和/或迁移和/或增殖和/或生长的药物中的应用。

优选地，以上所述的药物剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂或口服液。

优选地，以上所述的药物中红花多糖是作为唯一的活性成分。

优选地，以上所述的药物还包括药学上可接受的辅料。

第二方面，本发明提供了红花多糖联合巨噬细胞在制备抑制体外黑色素瘤细胞活性的试剂中的应用。

进一步地，本发明提供了红花多糖联合巨噬细胞在制备抑制体外黑色素瘤细胞侵袭和/或迁移和/或增殖和/或生长的试剂中的应用。

优选地，所述的黑色素瘤是皮肤恶性黑色素瘤。

第三方面，本发明提供了红花多糖在制备诱导巨噬细胞向m1型极化的试剂中的应用。

本发明优点在于：

在现有专利已给出了红花多糖hh1-1不能用于治疗黑色素瘤的反向教导的基础上，本发明首次创造性的提出红花多糖可用于治疗黑色素瘤疾病的内容，并通过实验验证了该结论。实验表明：红花多糖在体内可抑制黑色素瘤模型小鼠肿瘤的生长、体外抑制黑色素瘤b16-f10细胞的增殖、侵袭和迁移。结果证实，红花多糖对黑色素瘤有很好的抑瘤效果，在40mg/kg浓度时能明显延缓b16-f10荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速度，体外在50ug/ml浓度时能显著诱导巨噬细胞m1型的极化进而抑制黑色素瘤b16-f10细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并且随着药物浓度的增加，对细胞的抑制效果越明显。本发明为红花多糖开辟了新的用途，为临床治疗黑色素瘤疾病提供一种有效药物，可很好的应用于临床上，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1是sps对黑色素瘤细胞体内成瘤能力的影响。(a)干预结束后各组移植瘤的照片；(b)干预结束后各组小鼠肿瘤重量；(c)干预结束后各组小鼠肿瘤体积。

附图2是sps及条件培养基(cm)的细胞毒性作用。(a)sps对巨噬细胞raw264.7增殖能力的影响；(b)sps对黑色素瘤细胞b16-f10增殖能力的影响；(c)cm对黑色素瘤细胞b16-f10增殖能力的影响。与control组相比，^*p＜0.05,^**p＜0.01，认为有统计学差异。

附图3是sps调控巨噬细胞极化形态的影响。

附图4是sps及cm对黑色素瘤细胞侵袭与迁移能力的影响。(a)cm对黑色素瘤b16-f10侵袭能力的影响；(b)cm对黑色素瘤b16-f10侵袭能力的影响，与control组相比，^*p＜0.05,^**p＜0.01，认为有统计学差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1动物实验

一、材料和方法

1、实验试剂：

红花多糖：购于上海源叶生物科技有限公司。

pbs、dmem高糖培养基、胎牛血清：购于美国gbico公司。

双抗、胰酶：购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

红花多糖(sps)溶解于pbs溶液中，制成浓度5mg/ml、40mg/kg、80mg/kg的药物母液，保存于4℃冰箱。

2、细胞

黑色素瘤b16-f10由中科院上海细胞库赠与，使用含有10％胎牛血清的dmem培养液进行常规培养。

3、实验动物

健康雌性c57bl/6小鼠40只，5-6周龄，体重16-18g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，spf级环境喂养。

4、b16-f10细胞悬液制备：

①在超净工作台内按照无菌操作规则进行，实验前4-5d，将细胞用含有10％胎牛血清的dmem培养液复苏、传代于t75细胞培养瓶中，每个培养瓶细胞数大约含0.8×10⁷-1.0×10⁷个细胞；

②待细胞生长至80％时，吸弃培养瓶中的培养基，使用无ca²⁺、mg²⁺的pbs冲洗2次，加入胰酶常规消化；

③细胞分离后，于以三倍体积的完全培养基终止消化，并使用一次性无菌吸管轻柔吹打将细胞冲下，转移至15ml离心管中，800rpm/3min离心，弃上清，加入1ml4℃预冷的pbs，制成1×10⁷个/ml的细胞悬液，置于冰中备用。

5、建立c57bl/6皮下荷瘤小鼠模型：

①实验前一天小鼠前右下肢备皮，造模当天上午开始给药，实验当天记为day0，称重记录；

②在超净台内，将装有细胞的ep管做好标记置于冰上，用异氟烷经口鼻吸入对小鼠进行麻醉；

③用左手抓捏小鼠颈背部皮肤提起小鼠，暴露其右侧腋下皮肤，用75％酒精消毒移植处皮肤；注射器针尖朝上，于腋前线1-1.5cm左右处右手持针水平刺入小鼠右侧胁肋部皮下，使针尖沿皮下到达腋窝部，针头刺入后能水平摆动，以防止打入肌肉层；

④将100μl细胞悬液缓慢均匀的注入，在皮下形成包块，缓慢退针，然后用酒精棉球按压针孔，以防渗漏；

⑤继续饲养，观察成瘤情况，自造模第0天开始，每天检测小鼠体重,瘤体可以触及后，每天用数字卡尺测量肿瘤大小，并计算为(2×d×d)/2，其中d为肿瘤的大直径，d为肿瘤的小直径。

6、给药方式：

所有动物于造模后当天开始给药，记为day0，连续灌胃给药28天，1次/天，小鼠分为正常组、模型组、低剂量组、高剂量组，每组10只。

①正常组：生理盐水，每只0.1ml灌胃给药；

②模型组：生理盐水，每只0.1ml灌胃给药；

③sps低剂量组：生理盐水配制，浓度40mg/kg，每只0.1ml灌胃给药；

④sps高剂量组：生理盐水配制，浓度80mg/kg，每只0.1ml灌胃给药。

二、实验结果见图1。

由图1可见，与模型组比较，sps低、高剂量组的瘤体生长较缓，且sps高剂量组模型小鼠的瘤体体积最小，抑瘤率效果更高，提示sps能明显抑制b16-f10荷瘤小鼠瘤体的生长，具有抗黑色素瘤的效果。

实施例2细胞实验

本实施例主要研究红花多糖对黑色素瘤细胞生长的作用。

一、材料和方法

1.实验试剂

cck-8assay：购于上海碧云天生物技术有限公司。

8μmtranswell小室、matrigel胶：购于美国corning公司。

2.实验仪器

生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)

hf90二氧化碳恒温培养箱(中国上海力康生物医疗科技控股有限公司)

bsg-26电热恒温水浴锅(中国上海一恒科学仪器有限公司)

ckx53倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)

multifugex1r台式离心机(美国赛默飞世尔科技公司)

ldzf-75kb-iii压力蒸汽灭菌器(中国申安医疗器械厂)

3.cck-8比色法检验细胞增殖及毒性

常规培养小鼠raw264.7巨噬细胞及小鼠b16-f10黑色素瘤细胞，调整细胞密度为5×10³个/ml。铺96孔板，于每孔内加入细胞混悬液100μl，待细胞贴壁后，加入不同浓度的sps或cm继续培养，24h后分别于各孔细胞内加入10μl的cck-8，37℃作用4h，并于酶标仪上读取各孔细胞在450nm波长处的吸光度，以检测不同浓度sps或cm的细胞毒作用。细胞存活率＝(对照组od值-实验组od值)/(对照组od-空白组od)×100％。

4.cm的制备

取对数生长期的raw264.7巨噬细胞计数后以3×10⁵个/孔移植于含无血清dmem的六孔板中，加入sps使培养基中药物的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml，加入lps使培养基中药物的终浓度为1μg/ml，加入il-4使培养基中药物的终浓度为20ng/ml，24h后吸取上清，1000rpm/5min，收集上清，得到条件培养基(conditionedmedium,cm)，于-80℃储存，备用。

5.划痕实验

取对数生长期的b16-f10细胞消化离心，使用dmem完全培养液重悬按

1.5×10⁵个/孔细胞移植于6孔板，使其贴壁生长，待细胞呈单层融合时，吸弃培养基，使用10μl无菌枪头进行划痕，pbs清洗，加入不同浓度sps作用巨噬细胞后的cm或sps，于24h对固定的划痕区拍摄，比较细胞迁移率(％)＝(0h划痕愈合平均宽度-24h后划痕愈合平均宽度)/0h划痕愈合平均宽度×100％，由此评估cm与sps对b16-f10细胞迁移能力的影响。

6.transwell侵袭实验

使用具有8μm孔的transwell小室在24孔细胞培养室中进行侵袭试验。上室使用50μl的matrigel胶(1:5稀释)包被，将2×10⁵个b16-f10细胞移植于transwell上室，无血清dmem培养，下室加入含10％fbs的培养基。于37℃含5％co2的培养箱中培养24h；4％多聚甲醛固定30分钟，0.1％结晶紫室温避光染色20min，湿棉棒擦去小室内表面细胞，显微镜下随机挑选5个视野观察计数，统计结果；每组设置3个复孔，实验重复3次。

二、实验结果见图2-图4。

2.1sps通过调控巨噬细胞抑制黑色素瘤细胞活性

不同浓度sps作用raw264.7巨噬细胞及b16-f10黑色素瘤细胞24h后，均无明显的细胞毒性(图2a；图2b)。不同浓度sps作用巨噬细胞后的上清作为条件培养基(cm)加入黑色素瘤细胞中，结果显示，cm对黑色素瘤细胞的活力有明显抑制作用，阳性对照lps组的cm也明显抑制了黑色素瘤细胞的活力，而阴性对照il-4组对黑色素瘤细胞活力没有影响(图2c)。可见，sps可通过调控巨噬细胞抑制黑色素瘤细胞活性。

2.2sps诱导巨噬细胞向m1型极化

根据2.1中细胞毒性试验，选用对巨噬细胞无毒性作用浓度为150μg/ml的sps，并设立lps诱导的m1型与il-4诱导的m2型巨噬细胞作为对照，干预巨噬细胞24h后，光学显微镜下观察细胞形态变化，结果显示，sps组巨噬细胞出现伪足，胞体变大，形态学改变与lps组相近，呈m1样变化(图3)。

2.3sps通过调控巨噬细胞m1型极化从而抑制黑色素瘤细胞侵袭与迁移

分别采用transwell侵袭实验和迁移实验观察sps作用巨噬细胞后上清条件培养基(cm)对黑色素瘤细胞的侵袭与迁移能力的影响，transwell侵袭实验中，与control组相比，不同浓度spscm组的黑色素瘤细胞的侵袭数目显著减少，其差异具有统计学意义(p<0.01)，趋势与lps组一致，提示sps可通过调控巨噬细胞显著抑制b16-f10黑色素瘤细胞的侵袭能力(图4a)。在划痕实验中，与control组相比，不同浓度cm组黑色素瘤细胞的迁移率显著降低，差异具有统计学意义(p<0.01)，提示sps可通过调控巨噬细胞抑制b16-f10黑色素瘤细胞的迁移能力(图4b)。

三、结论

红花多糖是临床上最常用的经典活血化瘀类中药，具有活血祛瘀、通络止痛的功效，属于祛邪治法，至今尚未见红花多糖作为抗黑色素瘤药物的报道。本发明提供了红花多糖在抑制黑色素瘤模型小鼠体内肿瘤的生长，抑制黑色素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移的应用。实验表明，红花多糖在40mg/kg时可显著抑制模型小鼠体内黑色素瘤的生长。本发明为中药红花多糖开辟了新的用途，不但能提高药物的抗黑色素瘤疗效，而且在临床黑色素瘤发病率日趋增高的形势下，降低传统抗黑色素瘤药物的用药剂量，减少毒、副作用，为临床治疗黑色素瘤疾病提供新的候选药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。