专利名称：与生长激素释放抑制因子有关的肽类及其应用的制作方法
技术领域：
本发明总的说来涉及免疫学领域，更专业化地说来涉及生长激素释放抑制因子(Somatostatin)，与生长激素释放抑制因子有关的肽类及其应用。
生长激素释放抑制因子(Somatostatn或SRIF)是抑制某些内源性激素，如生长激素，胰岛素和促甲状腺素释放的一种小肽激素。这些激素进而调节其他物质的释放。例如，现已揭示，只有在胰岛素到达适当水平时，介导垂体生长激素的促蛋白合成作用的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，以前被称作生长调节素(Somatomedin)，才被肝脏释放出来。此外IGF-1刺激生长的能力可依赖于甲状腺素，因此，血循环中的SRIF水平完全影响到IGF-1水平。
SRIF还可影响营养物的消化吸收。餐后血浆中具有SRIF样活性的分子增多。SRIF还抑制胃酸分泌，胆囊排空以及甘油三酯和葡萄糖的吸收。因此，SRIF参与调节营养物从胃肠道的摄取。
SRIF可能通过几种机制影响生殖过程。有关文献已证实，SRIF对垂体分泌促黄体激素(LH)或促卵泡激素(F SH)无直接刺激或抑制作用。对一些饲养动物的研究确证了这点。给公牛体内注射SRIF不能改变血液中LH的水平。给母羊注射SRIF不能改变血清LH水平和生殖功能。SRIF可能通过其他直接或间接作用影响生殖过程。例如，SRIF存在于猪卵巢，未成熟人胎盘细胞滋养层以及猪子宫中的神经内分泌细胞。SRIF还抑制培养的猪卵泡卵子的成熟分裂。并非与某一特定理论有关，作为对SRIF的免疫作用的结果，很可能出现垂体生长激素分泌的增加和/或不依赖生长激素而直接依赖于SRIF的营养物吸收的增加。这两种情况都可导致IGF-1水平提高和生殖行为改变。还有证据表明，给猪注射可引起IGF-1增加的生长激素导致处于动情期的小母猪的排卵率增加。同样，IGF-1刺激培养的猪卵泡内颗粒细胞产生类固醇。此外，SRIF可通过影响表皮生长因子(E GF)受体、组蛋白和血管紧张肽的磷酸化程度，来调节细胞生长。对颗粒细胞上的EGF变体反应性的调节可控制细胞的生长与分化。
对SRIF的免疫作用还可通过影响环一磷酸腺苷(cAMP)水平来提高生殖效应。已知SRIF抑制cAMP活性，但就发明者所知，cAMP在生殖细胞和组织中的作用及对排卵的作用尚无报导。然而，已知cAMP是多种生理机制的重要调节物质，cAMP在控制激素活性上的功能已被描述过。并非与某一特定理论有关，cAMP可按以下方式调节生殖效率。cAMP与血浆酶原激活剂的功能有关，后者是一种催化血浆酶原转化为血浆酶的中性丝氨酸蛋白酶。尤其是，cAMP水平的提高显示出可诱导在母鸡卵巢中最大的排卵前卵泡的膜层上血浆酶原激活剂的活性。血浆酶原激活剂可进一步影响卵巢内的一些生理过程，包括细胞分化、卵泡成熟和排卵。SRIF通过抑制cAMP，可减弱促cAMP因子、促黄体激素和前列腺素E的作用，从而减弱这些因子对生殖行为的作用。
由于cAMP的调节功能有一个可追溯到包括细菌在内的漫长的进化史，影响cAMP水平的物质很可能在很大范围的有机体内将是有用的。
SRIF还可能对免疫功能有影响。尤其是，有人假设，SRIF可能通过阻断核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)合成而抑制淋巴细胞的增殖。SRIF对单核细胞也具有抑制作用，并抑制从脾脏和Peyer's斑分离的浆细胞释放免疫球蛋白A(IgA)。但是，发明者尚未见到表明SRIF直接或间接抑制或刺激骨髓来源的细胞，如多形核中性粒细胞(PMN)的任何报告。
有人报告，淋巴细胞，PMN和单核细胞能合成和分泌少量SRIF。单核细胞分泌的SRIF的确切作用尚未被描述过。而Blalock等于1985年提出，这一SRIF可作为免疫系统细胞间的信号递质而起作用。
有关抗SRIF抗体能增强PMN活性的机制尚不清楚。但对SRIF的免疫作用可减弱SRIF对免疫系统细胞所具有的潜在的抑制作用。抑制作用可有两种类型。其一可能涉及SRIF和PMN之间的直接相互作用;其二SRIF可能引起对T淋巴细胞释放淋巴因子的抑制。淋巴因子是由激活的淋巴细胞所产生，能增强白细胞功能。例如，干扰素α、干扰素γ和白细胞介素-2等均是淋巴因子。SRIF引起的淋巴因子分泌的减少或许可降低PMN的活性。因为免疫系统的很多细胞受淋巴因子的调节，如PMN，B淋巴细胞，巨噬细胞，单核细胞和T淋巴细胞，因此对SRIF的免疫作用可增强免疫功能。
细菌被PMN的吞噬摄取是清除细菌的第一步。结果，PMN在预防动物细菌感染，如乳腺炎和小牛呼吸系疾病等方面起了一个关键性的作用。动物在应激状态，和/或在产期前后，和/或在初次病毒感染后，特别易发生细菌感染。因此在许多情况下PMN的活性是预防细菌感染和感染后康复的关键因素。
SRIF是以直链和环状两种形式存在的十四肽。环SRIF-14的化学结构如下
具有SRIF样活性的分子也可能有从氨基端(N端)和/或羧基端(C-端)延伸的顺序，及在SRIF-14序列内含有添加、缺失或取代基。SRIF的天然形成有如下这些SRIF-14，脯-SRIF，脯-脯-SRIF，SRIF-28，SRIF-25和SRIF-20。
一个熟为人知的SRIF的类似物是(SRIF)SM S201-995。这类结构已由Moreau等(1987)综述。SRIF的其他类似物为RC-121和RC-160。
在迄今研究过的所有脊椎动物中均发现了SRIF，并且整个机体均合成SRIF。因此，SRIF的水平是不易被降低的，有关SRIF浓度调节方面的研究也受到限制。但是，免疫调节提供了一个能检测抗SRIF活性作用的方法。这一技术利用抗SRIF抗体调节SRIF样活性。抗SRIF抗体既可直接给予受试者(被动免疫)，也可用SRIF和佐剂和/或载体一起给予，使体内产生可调节SRIF样活性的抗体(主动免疫)。
SRIF最初以其对生长激素分泌的抑制作用而被认识。在大鼠，SRIF由于被动免疫而从血液循环中的除去，提高了血浆中生长激素的浓度，并防止了由于应激和饥饿而出现的生长激素浓度的降低。然而用主动免疫来进行SRIF的免疫调节作用的较早期试验产生了混合的结果。例如，据报导，用主动免疫除去SRIF，在羊中导致较高的血浆生长激素水平，但这对于生长无确定的作用。Spencer等在已经过抗SRIF免疫的羊中观察到伴喂饲效率提高，生长加速，而Varner等报告了明显降低的生长速度。此外，对SRIF的主动免疫在绵羊中既未见产奶量增加，也未见到生长速度增加。上述文献中报告的时常矛盾的发现可能是由于难于获得一致的和可测量的对SRIF的免疫反应。
至今尚无关于与动物的生殖效应有关的SRIF样免疫调节作用(主动或被动)的研究。美国专利第3，863，008号揭示，SRIF水平的提高，在体外刺激促黄体激素分泌，但这一效应与免疫学现象无关。脊椎动物生殖效率的提高，从经济角度讲是可行的。
本发明在于发现SRIF样活性的免疫调节可以增强试验的脊椎动物的生殖效应和免疫学功能。本发明也基于，调节内源性SRIF水平的高效、新颖的疫苗制剂的发现。这一制剂不但在促进生殖效率上，而且在调节各种与SRIF有关的其他生理功能上得到应用，如背景部分所述。SRIF的免疫调节可通过主动或被动免疫来实现。
本发明的一个实例是针对通过引起免疫反应而促进试验的脊椎动物生殖效率的制剂的，该制剂包括一种在药理学上可行的载体和一种与SRIF有关的肽。
在其他实例中，本发明是针对通过调节SRIF活性而增强试验的，脊椎动物免疫功能的一种制剂，以及促进巨噬细胞功能的一种制剂。这些制剂包括一种药理学上可行的载体和与SRIF有关的肽类。
在更进一步的实例中，揭示了一些制剂，这些制剂在药理学上可行的赋形剂中包裹着具有抗SRIF样活性分子的抗体。
在另外一些实例中，本发明针对一些方法通过免疫反应，调节试验的脊椎动物的SRIF活性，提高试验的脊椎动物的生殖效率，促进试验的脊椎动物的巨噬细胞功能。这些方法系给予脊椎动物一种由药理学上可行的载体和治疗上有效量的与SRIF有关的肽组成的制剂。在特佳实例中，与SRIF有关的肽是连接于一种载体上的SRIF-14。
在其它一些实例中，本发明通过引起一种免疫反应，即给予脊椎动物一些包括一种药理学上可行的载体和足以在脊椎动物中调节SRIF样活性的数量的抗SRIF样活性抗体，来提高脊椎动物生殖效率和增强巨噬细胞活性。有鉴于此，本发明的这些或其他实例将易被对本技术熟练的人员所理解。
附
图1描述在第1228号羊上产生的抗SRIF-14抗血清与SRIF相关肽类的交叉反应概况。
附图2显示在第1277号羊上产生的抗SRIF-14抗血清与SRIF相关肽类的交叉反应。
附图3显示从成熟的卵巢卵泡中分离出来的颗粒细胞中SRIF和cAMP水平的抑制关系。试验细胞在含有促黄体激素(LH)或Forskolin(FK)的培养基中进行培养。
附图4描述从成熟卵巢卵泡中分离出的颗粒细胞中的cAMP水平。试验细胞在存在或缺乏SRIF，同样也在存在或缺乏抗SRIF抗体的情况下，和FK一起培养。
附图5显示SRIF对猪黄体细胞基础cAMP水平的抑制效应。
附图6显示SRIF对从免疫羊身上采得的标本中PMN活性的效应。
附图7描述单独的卵清蛋白载体(实线)和与SRIF结合的卵清蛋白载体(虚线)的反相高压液相(HPLC)色谱。
本发明的实施，除非另外指出，将应用免疫学、蛋白质化学、生物化学和分子生物学的常规技术，这些技术全部在这一领域的技术范围之内，这样一些技术在文献中已作了完全的阐述。例如见《实验免疫学手册》第Ⅰ-Ⅳ卷(DM.Weir，C.C.Blackwell主编，1986，Blackwell科学出版物);丛书《酶学方法》(S.Colowick，N.Kaplan主编，学术出版公司)。
在描述本发明时，将使用下列术语，并打算给出如下定义所谓“脊椎动物”指的是具有功能性免疫系统的任何动物，没有限制地包括鸟类，如鸡、火鸡、鹌鹑、观赏鸡、鹦鹉等、鱼类，和哺乳动物，如人类、牛、猪、马、狗、猫、羊、象和其他家畜或野生动物。
“提高生殖效率”定义为脊椎动物生殖或繁殖行为的任何提高。这种提高包括，但并不限于，排卵率、怀胎率的提高，动情期发生率的增加，雌雄动物生育力的提高，同窝仔的大小的增加，卵或胚胎存活率的提高，以及后代数目的增加。这一定义中还包括由于抑动情期、多产、不育和流产等因素引起的生殖不能的治疗。
“增强免疫功能”定义为脊椎动物免疫学行为的任何提高。这些提高包括，但并不限于，白细胞活性的增加，抗体分泌的增加，淋巴因子分泌的增加，细胞因子(Cytokine)分泌的增加和抗病能力的提高。
所谓“增强巨噬细胞功能”指的是脊椎动物免疫学行为，特别是与PMN功能有关的免疫行为的提高。PMN功能的这种提高包括，但不限于，超氧化物产生的增加，化学趋向素的增加和移动的减弱。PMN功能的提高为脊椎动物提供了对大量生物体的抵御作用。这些生物体包括，但不限于，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，无乳链球菌，增殖链球菌(Streptococcus oberis)，牛棒状杆菌，溶血性巴斯德化菌。在应激状态下，病毒感染后和产期前后时，脊椎动物对这些生物体特别敏感。例如乳腺炎就是这样的细菌感染的疾病之一。
所谓“生长激素释放抑制因子”即SRIF，指的是具有SRIF样活性的任何分子，包括有从SRIF-14的N端和/或C端延伸序列的分子，及在SRIF-14序列上有添加、缺失或取代基的分子。任何上述分子可以是直链的或环状的。这些肽类的实例包括，但不限于，环状或直链的SRIF-14，[酪′]-SRIF-14，[酪″]-SRIF-14，SRIF-25和SRIF-28(环状或直链)。
所谓“SRIF相关肽”指的是，有SRIF免疫活性的任何蛋白质，多肽或肽。此术语所包括的还有，具有SRIF受体结合活性，并阻止其他SRIF相关肽结合SRIF受体的SRIF结构类似物。这种物质与抗直链或环状的SRIF的抗体有交叉反应。
“轮状病毒VP6蛋白”指的是呼肠弧病毒属(Reoviridae)由任何种或株的可经人工识别的主要内壳病毒蛋白。例如见Kapikian等，1985。从中可分离得VP6蛋白并应用于本发明的轮状病毒实例包括，但不限于，猿猴SA-11，人D轮状病毒，牛UK轮状病毒，人Wa或W轮状病毒，人DS-1轮状病毒，猕猴轮状病毒，“0”型剂，牛NCDV轮状病毒，人S2轮状病毒，人KUN轮状病毒，人390轮状病毒，人P轮状病毒，人M轮状病毒，人Walk57/14轮状病毒，人Mo轮状病毒，人Ito轮状病毒，人Nemoto轮状病毒，人YO轮状病毒，人MCM2轮状病毒，猕猴MMU18006轮状病毒，犬Cu-1轮状病毒，猫Taka轮状病毒，马H-2轮状病毒，人St.Thomas3号、4号轮状病毒，人Hosokawa轮状病毒，人Hochi轮状病毒，猪SB-2轮状病毒，猪Gottfried轮状病毒，猪SB-1A轮状病毒，猪OSU轮状病毒，马H-1轮状病毒，鸡chz轮状病毒，火鸡Ty.l轮状病毒，牛C486轮状病毒，以及从这些病毒派生出来的株。因此本发明包括从任何轮状病毒株得到的VP6的应用。这些轮状病毒株可以来自不论亚群Ⅰ、亚群Ⅱ或至今未确定的亚群以及血清型1-7的任何一种，和至今未定血清型的任何一种。这样的VP6蛋白可被用作多肽的免疫载体。这些载体分子由轮状病毒VP6的氨基酸序列所构成。这种氨基酸序列对于该类VP6多肽或其中任何一种是独特的。这种VP6蛋白独特的序列被称为“轮状病毒VP内壳蛋白氨基酸序列”。
载体实质上与轮状病毒VP6内壳蛋白或其功能性片断是同源的，其中至少85%氨基酸，更可取的是至少90%，最好至少95%氨基酸在一个限定的分子长度上是相配的。轮状病毒VP内壳蛋白的“功能性片断”是具有充当上面定义的SRIF相关肽的载体分子能力的一个片断。
所谓“调节SRIF或SRIF样活性”是指改变SRIF或SRIF相关肽的内源性水平，以获得所期望的效应。如提高生殖效率或促进非特异免疫。给受试体使用肽类及其抗体后，出现内源性SRIF水平的改变。正常情况下，这些肽类和抗体会降低内源性SRIF水平。
术语“治疗有效量”是指当给予受试者本发明的制剂时，给予在受试者中是以调节内源性SRIF样活性的SRIF相关肽或抗SRIF抗体的量。
所谓“免疫学反应”是指在脊椎动物内发展由细胞或抗体介导的针对重要的肽的免疫反应。通常，这样的反应是指由脊椎动物产生对重要的肽直接特异的抗体和/或细胞毒性T细胞。
本发明主要的是，发现SRIF相关肽可改变正常脊椎动物和生殖畸形的无脊椎动物的生殖行为。这些物质可单独或联合用药给予脊椎动物，得到有利的结果。同样重要的是，发现了调节SRIF水平和增强巨噬细胞功能的高效、新颖制剂。
在所附方法和配方中，具有SRIF样活性的分子及其类似物是有用的。这些分子在商业上是可利用的。可以几种形式中的任何一种获得。这些分子包括，而不限于SRIF-14，SRIF-28，SRIF-15，SRIF-20，RC-121，RC-160和SM S-201-995，既可是环状的，也可是直链形式。
因为SRIF及相关化合物相当少，故可按已知的氨基酸序列经化学合成，如固相肽合成而容易地被生产。这些方法已为技术熟练的人所了解。用于本发明的物质由Bachem公司合成。SRIF相关肽类也可用本领域已知的重组DNA方法来制备。
SRIF或其他显示SRIF免疫活性的物质可用于脊椎动物以刺激免疫反应的活性。它们也可用于生产多克隆和单克隆抗体。这些抗体继而可用于脊椎动物以调节内源性SRIF，从而提高受试者的生殖能力和非特异免疫。
如果需要多克隆抗体，可用SRIF，更佳地是用SRIF-14或它的一个免疫原片段，或一种突变的形式。来免疫选定的哺乳动物(如小鼠、家兔、山羊、马等)。收集免疫动物的血清，按已知的顺序进行处理。如果在含有对决定性蛋白质的多克隆抗体的血清中含有对其他抗原的抗体，可用已知的方法通过免疫亲和层析加以纯化。
抗本发明的蛋白质及其片段的单克隆抗体也可容易地由技术熟练者生产。杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法学已被熟知。产生永久性抗体的细胞系可通过细胞融合形成，也可采用其他技术，如用肿瘤DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染。见M.Schreier等，杂交瘤技术(1980);Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤(1981);Kennett等，单克隆抗体(1980);亦见于美国专利号4341761，4399121，4427783，4444887，4452570，4466917，4472500，4491632和4493890。产生的抗SRIF或其片断的单克隆抗体可因其不同性质，如同型、表型、亲和性等而进行筛选。
动物可按本发明的配方，用决定性蛋白质或其片断或其类似物或抗体进行免疫。若用片段或类似物，它应包括表位的氨基酸系列，该表位可与免疫系统互相作用，以使该动物对其和结构上相类似的表位产生免疫。
在免疫前先连接到载体上可增强SRIF相关肽的免疫原性。典型的载体是大的，缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、如琼脂糖珠，琼脂糖，纤维素，纤维素珠等等;氨基酸聚合体，如聚谷氨酸，聚赖氨酸等;氨基酸缩聚物，胞壁酰二肽和其他细菌细胞壁成份，以及灭活的病毒颗粒。特别有用的蛋白质底物是血清白蛋白、如牛血清的蛋白(BSA)或卵清蛋白，锁服帽贝血篮蛋白，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白和其他该领域中熟知的蛋白质。
蛋白质底物可以其天然形式被使用，也可以在功能基团上被修饰。例如赖氨酸残基的琥珀酰化，或与半胱氨酸硫代内酯起反应。例如巯基也可借助氨基与2-亚氨基硫醇(2-iminothiolane)反应或与3-(4-二硫代吡啶)丙酸盐的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应结合到载体(或抗原)上。合适的载体还可被修饰，结合到间隔臂(例如六甲烯二胺或其他类似大小的双功能团分子)上来连接肽类。
本发明中所用的尤其合适的载体是轮状病毒的VP6多肽，或其功能性片段，如公众已知的美国专利申请号为092，120，申请日为1987年9月2日中所公开的，在这儿结合作为参考。用如美国专利申请号4，722，840所公开的方法做的病毒蛋白和决定性表位的融合产物也同样有用。另外其它合适的载体包括一种特别的抗原显示系统，如PCT申请号GB87/00764所公开，也包括细胞，例如淋巴细胞。这种形式的显示模拟在受试者体内的自然的显示形式，它能导致免疫状态的产生。或者，本发明的蛋白质可以偶合到红细胞上，较佳的是受试者自己的红细胞。将肽偶合到蛋白质或细胞上的方法对本领域的普通技术人员是已知的。
本发明的蛋白质和抗体在使用前最好先用药理学上可行的载体或赋形剂混合。典型地，将制剂制成可注射剂，最好是肌内和/或皮下注射，可以是溶液或悬浮液。也可制成适当的固体形式，在注射前用液体载体制成溶液或悬浮液。制剂也可乳化，或将浮活性组分包裹在脂质体载体中，或通过固定在脂质体膜上而在脂质体载体的外部表达。活性免疫原组分常与载体混合，该载体含药理学上可行的及与活性组份相容的赋形剂，合适的载体例如有水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，或其类似物，及其结合物。另外，如需要的话，载体可含辅助成分，例如湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，或能增强疫苗效果的佐剂。佐剂可包括，例如胞壁酰二肽，avridine，氢氧化铝，油，皂角苷及本领域已知的其它物质。制备这种剂型的实际方法对本领域的熟练人员是已知的，或将是显然的。参考，如Rcmington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，15 edition，1975。
已发现一个调节SRIF活性的特别有用的制剂包括与25%-30%作为佐剂的Al(OH)3结合的连接卵清蛋白的SRIF，或SRIF有关肽。
所服用的组合物或制剂将包括一定量的SRIF相关肽或其抗体，该量足以调节受试的脊椎动物中的内源性SRIF，其确切的量可由本领域熟练人员容易地决定。活性组分一般在占制剂约1%到约95%(w/w)之间，如合适的话可能更高或更低，所服用的量取决于所处理的动物，及动物免疫系统调节SRIF样活性的能力。已发现在现有制剂中，每毫升注射溶液中125微克活性组分，每个动物服用2到4毫升剂量时已足够引起免疫应答。本技术领域的普通技术人员通过常规试验得出剂量应答曲线，可以容易得出其它有效剂量。通过服用SRIF相关肽或其的一个免疫原性片段，或其类似物，至少一剂，最好多于一剂，而使动物免疫，动物可以服用所需要的剂量，以维持一种状态，在该状态下SRIF样活性可被调节到一个足够的量而产生生物作用。另外适宜于其它服用形式的制剂包括栓剂，在有些情况下是气溶胶，鼻内及口服制剂。对栓剂来说，载体成份包括传统性结合物和载体，如聚碱性1，2-乙二醇，或甘油三酯。这些栓剂可以从含约0.5%到约10%(w/w)，最好是约1%到约2%的活性组分的混合物中形成。口服载体包括通常使用的赋形剂如药用级的甘露醇，乳糖，淀粉，镁，硬脂酸盐，糖精钠纤维素，碳酸镁等。这些口服制剂可以是溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，缓释剂，或粉未形式，含约10%到约95%的活性组分，最好是含约25%到70%。
鼻内制剂通常包括既不引起的对鼻粘膜的刺激又不显著干扰鼻毛功能的载体。在本发明中稀释剂可用水，盐水或其它已知材料。鼻内制剂也可含有防腐剂，例如，但不局限于，氯丁醇和氯化苄烷铵，可加入一表面活性剂促进鼻粘膜吸收主要蛋白。
另外，主要的SRIF肽可以中性或盐的形式存在于主要的制剂中。药理学上可行的盐包括酸加成盐(与活性多肽的游离氨基形成)，它们是与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等形成的。通过游离酸基形成的盐也可以与无机碱或有机碱而产生，这些无机碱有氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙，或氢氧化铁，有机碱有异丙胺，三甲胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸普鲁卡因等。
以下是实行本发明的特定实施例，它们仅用于说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
C.实验材料和方法SRIF14(环状)(SS-14)，[Tyr′]-SRIF，[Tyr″]-SRIF，SRIF 28(环状)(SS-28)及SRIF28(1-14)[SS-28(1-14)]是从Bachem Inc.，Torrance，CA.购买的。碳化二亚胺(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺HCl;Pierce)和卵清蛋白(99%纯;Sigma)分别用作结合剂和载体。弗氏完全和不完全佐剂来源于商业渠道(Sigma或Difco)。Al(OH)3-铝胶来自Superfos(丹麦)。
在Saskatchewan大学绵羊研究单位的杂种绵羊根据一般商业性管理方法饲养。绵羊群得到细致的管理，以研究其繁殖。母羊每8个月繁殖一次，每二年得3头小羊。这导致在繁殖季节处有一次繁殖(5-6月)，其余的在1月或9月。用浸渍醋酸甲羟孕酮(60毫克)的阴道内海绵使发情期同步。对繁殖季节外的繁殖用光周期操作引起发情。公羊每两年测试一次精子，在去除海绵后，按10头母羊对1头公羊的比例，留置25天，免疫母羊及它们的同龄的母羊(对照)作为一组饲养。按一般情况下对母羊及公羊进行营养管理，包括在繁殖前先冲洗母羊。
所有对猪进行的实验都是在Saskatchewan大学Prairie Swine Center进行的。根据一般商业管理饲养猪群，包括小母猪和大母猪的自然繁殖。
实施例1免疫原性制剂的制备用碳化二亚胺按以下方式使SRIF结合到卵清蛋白上。
106毫克SRIF-14溶解于26.5毫升蒸馏水中;
424毫克卵清蛋白溶解于50毫升蒸馏水中，及;
742毫克碳化二亚胺溶解于22毫升蒸馏水中。
碳化二亚胺溶液与卵清蛋白溶液混合。在10分钟内一边滴加入SRIF溶液，一边在室温下不断搅拌，室温下在暗处继续搅拌，使反应继续进行24小时。完成后，反应混合物在4℃对蒸馏水渗析(1∶20)，共48小时，每12小时换水。渗析管隔离分子量为3000。SRIF与卵清蛋白结合的效率由125I-[Tyr′]-SRIF-14的内含物决定。几个反应的效率在55-60%之间。SRIF与卵清蛋白的摩尔比估计是3∶1。最终制剂在二倍体积的弗氏完全佐剂中乳化。
使人惊奇的是，当SRIF-卵清蛋白制剂用反相高压液相色谱法分析时，色谱图(图7)表示该结合物的组成是几个分子的SRIF偶联到一个卵清蛋白分子上。没有观察到卵清蛋白的高分子量聚合体。这对用化学联接方法，如用碳化二亚胺，产生的制剂来说是不寻常的，因为通常会产生载体分子的交联聚合体。用所描述的连结方法可产生非常有效的免疫原性制剂，当它接种于脊椎动物后，引起中性抗体应答，如以下所举例说明的。
实施例2测量抗SRIF的抗体滴度在血中抗SRIF的抗体滴度是由采用125I-[Tyr′]-SRIF-14液相直接结合试验，及通过炭抽提分离结合/非结合配体决定(Laarveld et al.，1986)。所报告的滴度是，为获得50%结合的8000cpm单碘化[Tyr′]-SRIF-14(大约1.8pg)所需的血浆最终稀释。在有些情况下，对滴度加以说明是为获得35%结合所需的最终稀释。
实施例3制备动物体内抗SRIF的被动免疫的抗血清用实施例1的免疫原性制剂对绵羊进行超免疫。免疫后二周，从颈静脉处取500毫升血样。使血液凝结，然后离心，将细胞与血清分离。从动物中得的血清或直接应用，或用传统技术，如(NH4)2SO4沉淀法，或蛋白A琼脂糖凝胶或蛋白G琼脂糖凝胶亲和层析法进一步纯化血清中的抗体。这些方法对本领域熟练人员是熟悉的，在Harlow和Lane(1988)中得以描述。
实施例4多克隆抗血清与各种SRIF样或SRIF相关肽的交叉反应的检测在一定数目的绵羊上进行由实施例1的免疫原产生的抗血清的定性分析。在一般放射免疫测试步骤中，抗血清在磷酸缓冲盐溶液中(PBS)合适稀释，以与放射性示踪剂125I-[Tyr′]-SRIF-14(6000-8000cpm)形成一定量结合，此抗血清与以下肽的系列稀释液孵育SRIF-14，[Tyr′]-SRIF-14，[Tyr″]-SRIF-14，SRIF-28，SRIF-28(1-14)。不断测定放射性示踪剂的置换情况(B/Bo×100;结合%)。
SRIF-卵清蛋白结合物诱导产生多克隆抗血法，后者与SRIF-14，SRIF-28和[Tyr′]-SRIF-14产生交叉反应。与[Tyr″]-SRIF-14的交叉反应很少，与SRIF-28(1-14)无交叉反应。可在图1和2中见到绵羊抗血清的两个交叉反应试验的例子。结果表明为常见交叉反应模式(Patel 1984)，及SRIF的初级抗原决定簇在环上，因为在11位上氨基酸用酪氨酸取代，导致活性大部分丧失。
实施例5经抗SRIF免疫的绵羊的繁殖行为将实施例1的免疫原性制剂在颈部的二个地方皮下注入绵羊，及肌内注入小母猪。剂量为每头动物0.25到0.50毫克SRIF-14，即给的量为5到15微克/千克。加强免疫用同样的量，注入颈部区域，用弗系不完全佐剂给予。在3周后及间隙4周或根据需要，给予辅助药剂。动物通常在繁殖前10天接受加强疫苗接种。在母羊中，抗SRIF的抗体滴度范围很宽，从104到3×105(倒数)。
在繁殖季节中绵羊的繁殖行为由于抗SRIF的免疫而加强(表1)。第一次交配的怀孕率增加(p＜0.05)15%，总的怀孕率增加(p＜0.01)15%。经免疫的母羊具100%怀孕率。
表1在秋季和冬季抗SRIF免疫对母羊繁殖行为的影响对照 SRIF-免疫观察数 89 48第一次交配怀孕数 55 37怀孕率 61.8% 77.1%＊第二次交配怀孕数 21 11怀孕率 23.6% 22.9%未定数 13 0总的怀孕率 85.4% 100%＊＊每次出生的小羊 2.05 2.06抗-SRIF-14滴度- 10到3×101九月和一月2滴度倒数的范围＊平均值有显著差异(p＜0.05);Fisher's精密试验＊＊平均值(p＜0.01)有显著差异在繁殖季节外繁殖常导致不良的繁殖行为(Rawlongs et la.，\1987)。但是，在这一情况下抗SRIF免疫的则可使总的怀孕率从对照的30.8增加到免疫动物的70.8%(表2)。
表2在繁殖季节外的繁殖期间抗SRIF免疫对母羊繁殖行为的作用对照 SRIF-免疫观察数 13 24
第一次交配怀孕数 4 15怀孕率 30.8% 62.5%？总的怀孕率第二次交配后怀孕数 4 17怀孕率 30.8% 70.85%＊抗-SRIF-14滴度- 10到5×101在6月繁殖2模拟秋天长度的光周期3滴度倒数的范围？P-0.066;Fisher's精密试验＊P-0.022实施例6经抗SRIF免疫的羊繁殖季节外的繁殖行为用25%Al(OH)3水凝胶佐剂代替Fisher's佐剂来制得实施例1的免疫原性制剂，将该制剂在半腱肌/半膜位置处肌肉内注入羊体中。每只动物所用的剂量是100μg结合的SRIF-14。在初次免疫后的第三周和第五周分别注入相同剂量和相同的位置，进行加强免疫。在繁殖前约7天进行最后一次注射。通过肉眼检查动物及识别母羊背上的图案来监测繁殖行为，母羊背上的图案是由于被带有颜色笔标记的挽具的公羊骑了以后得到的。在早晨的第一件事就是进行上述观察，然后在白天间隔一定的时间进行观察。
抗SRIF的免疫增强了羊的繁殖季节外繁殖行为增长了(见表3)，该试验的结果表明，动物的发情次数增加，证实了在其它实施例中所发现的怀孕率也增加。
表3繁殖季节处的繁殖行为组 动物号 标记动物号 动物繁殖%经免疫 31 22 71对照 28 13 46实施例7抗SRIF免疫的猪的繁殖行为小母猪在体重达35-45kg时进行第一次抗SRIF的免疫，并在21天后进行第二次免疫。使用剂量为5-15μg/kg。体重为95kg时，用PM SG(500IU)(Kirkwood et al.，1988)诱导小母猪发情，在7天后给予一个加强免疫。观察到第一次自然发情后，小母猪进行自然繁殖，如果需要，可在自然繁殖后让小母猪第二次发情循环。将免疫的小母猪与在初次免疫时选择的同期小母猪进行比较。
用这些小母猪进行两种研究。许多经免疫小母猪和对照小母猪在第一次自然发情后被宰杀以测定其排卵率。在第二种研究中使小母猪如上所述繁殖并让其产下小猪。
如表4所示，抗SRIF 17免疫提高了小母猪的排卵比率(p＜0.10)。
表4抗SRIF免疫的小母猪和对照小母猪首次自然发情后的排卵率对照 SRIF-免疫 P观察数 17 15
排卵率 10.7±0.4 11.8±0.6 0.096抗SRIF-14滴度 0 38001平均±滴度2Fisher's精密试验3在首次繁殖时滴度(35%结合)倒数的平均值如表5所阐述的那样，繁殖时的体重不受该处理的影响。但是，与对照动物相比，抗SRIF免疫的动物的一窝产仔数显著增加。出生时小猪体重与出生时窝重无明显不同。
表5抗SRIF免疫对小母猪生殖行为的影响对照 SRIF-免疫 可能性观察数 11 11繁殖时体重(kg) 99.0±1.5 97.1±2.5 0.55一窝产仔数 8.5±0.56 10.4±0.61 0.042出生时小猪重量 1.47±0.05 1.41±0.04 0.337出生时的窝重(kg) 11.7±0.75 12.8±0.65 0.285抗SRIF-14滴度 0 38001平均±SRIF;同一种不同的上标平均值不同(p＜0.05)2Fisher's精密试验3首次繁殖时滴度倒数的平均值(35%结合)实施例8SRIF免疫对母鸡繁殖作用的研究A.重组VP6的生产为了生产重组VP6，将牛轮状病毒(rotavirus)C486的基因6首先克隆到pBR322的PstⅠ位点上。所得的克隆用AhaⅢ和HpaⅢ酶切并亚克隆到pAC373的SmaⅠ的位点上。转染入Escherichia coli后，通过用限制性内切酶分析在正确转录起始位点上的插入而筛选重组氨比西林抗性菌落中的质粒。将来自PAC373载体的基因6 cDNA转移到Antographa californica细胞核多面体病毒(A cNPV)DNA中，用前述的磷酸钙沉淀方法(Smith et al.，1983)使Spodoptera fruqiperda细胞与野生型的A cNP VDNA共转染。然后在27℃下孵育7小时，除去培养基，用倒置显微镜观察细胞感染的信号。在感染后第5天收集细胞外病毒并在Spodoptera frugiperda细胞单层上形成噬菌区。用倒置显微镜通过识别堵塞的阴性噬菌区来筛选重组子。让阳性的噬菌斑在微量滴定盘中进一步生长，对这此盘中的感染细胞进行核酸点印迹，以证实基因6的存在。对微滴定井中阳性悬浮液的进行噬菌斑纯化并采用来自这些噬菌斑的病毒来繁殖病毒子。
为了从感染的细胞中分离VP6，首先用含1%NP40，0.137M Na Cl、1mMCa Cl2，0.5mMMg Cl2和0.1mg/ml抑肽酶的缓冲液细胞溶解。然后将溶解物在透析袋中于0.01M枸橼酸盐缓冲液，pH4.0透析48小时，在此期间透析袋中形成了沉淀物(重新装配的VP6)。通过离心收集沉淀，随后用0.05M EDTA，pH5.0处理1小时并再次离心，所得的颗含有纯化的VP6重新装配的小球。
在美国保藏中心(ATCC)，12301 Paeklawn Dr.Rockville，MD 20852，USA中可以获得轮状病毒C486，它是在1981年4月15日保藏在第VR-917号中。含有轮状病毒基因6 cNDA的pAC373载体称为pAC373BRV6，它在1987年8月31日保藏在ATC C中，登记号为40362，在那里它将在布达佩斯条约下进行保藏。
B.将VP6接合到SRIF上用下列方法通过碳化二亚胺交联使上述产生的重组VP6小球接合到SRIF上，其接合比率为1 SRIF 1VP6单体。将5mg环SRIF(Bachem)溶于0.5毫升10mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。将5mg VP6小球溶于2.5毫升相同的缓冲液中。将2mg EDAC(水溶性碳化二亚胺)加至VP6溶液中并混合2分钟。然后加入SRIF溶液，充分混匀，在4℃下在搅拌机平板上持续振摇，孵育过夜。在室温下用重蒸水每小时换水3次来透析样品，仅在振摇时沉淀出来的产物能均匀地分散。
C.母鸡用SRIF-VP6免疫Hyline CV16白菜克亨(White Leghorn)母鸡用于最初实验中以研究SRIF免疫繁殖的影响。将产蛋母鸡分成4组，每组10个，各自称重。
1)未注射对照(UC);
2)盐水注射对照(SC);
3)每毫升25μg SRIF(25 S);
4)每毫升100μg SRIF(100 S)。
用白菜克亨公鸡的精液给每组母鸡授精。在免疫前观察母鸡和蛋。然后用0.5-2.0毫升，最好用1毫升SRIF-VP6复合物免疫母鸡。观察母鸡并测定SRIF的血浆抗体滴度。用0.5-2.0毫升SRIF-VP6载体复合物对母鸡进行加强免疫。测定血浆抗SRIF抗体的滴度并观察母鸡和蛋。然后用收集白菜克亨鸡的精液给母鸡授精，收集蛋进行抗体分析。对蛋进行观察计数并称出蛋重。对孵出的小鸡称重并监测生长率。试验组与对照母鸡相比蛋的数目无明显差别。但是，在试验组蛋中发现了明显多的抗SRIF抗体，这表明免疫是成功的。在新孵出的小鸡中也有SRIF免疫存在。观察得到的结果表明该母鸡繁殖已是非常多产的实施例9SRIF对颗粒状细胞和黄体素细胞(Luleal)的作用A.如Rajkumar et al.，1989中所述，通过轻刮卵泡内膜而从成熟的卵巢的卵泡中分离出颗粒状细胞。将细胞在有或没有2μg黄体素激素(LH)或25μM(FK)的时进行孵育。在加入LH或FK以前5分钟将如表3所示滴定量的SRIF加至孵育管中。在磷酸二酯酶抑制剂的存在下于37℃内孵育1小时。将样品煮沸15分钟以终止孵育。然后离心样品，如Brooker et al.，1979所述的用RIA来测定上清液中的cAMP。
从图3中可见SRIF抑制FK刺激cAMP以在某种程度上LH刺激cAMP。
与其它关于垂体细胞的文献报告一致，SRIF不抑制基础cAMP活性。只有当cAMP水平被刺激后超出基础水平20-30%时才有作用。
B.在有或没有SRIF抗-SRIF存在时也将颗粒状细胞与FK一起孵育。在加入FK前将SRIF加入孵育5分钟，对与抗SRIF一起孵育的样品来说将SRIF与足以中和SRIF活性的预定抗体预卵育1小时。抗体如实施例3所述进行制备。
如图4所示，在某些情况下，例如，单独有SRIF存在时，或当用SRIF特异性抗血清处理时有SRIF加上FK存在时，可以解除对cAMP的活性的抑制，使受抑制的cAMP回复至对照水平。
C.黄体素细胞用上述对颗粒状细胞所述的方法进行分离，用实施例9A所述的方法测定滴度。
如图5所示，在黄体素细胞中基础cAMP活性也受极低剂量的SRIF影响。
这些结果提示用SRIF免疫得到一种免疫应答，它进而阻止对cAMP活性的抑制从而增加生殖效率。
实施例10由于抗生长激素抑制因子样或生长激素抑制因子相关的肽的多克隆抗血清引起的PMN活性的增加在羊颈部两点处皮下注射实施例1中制得的免疫制剂。剂量为每个动物0.24mg-0.50mg SRIF-14。在第3周时用实施例6制得的免疫制剂以与初次注射相同的剂量进行加强免疫，然后如果需要的话间隔4周再加强一次。在繁殖前10天及在产小羊前两周(估计)通常动物再接受加强疫苗接种，测定母羊中的SRIF的滴度，其范围为104-3×105。
为了达到该实施例的目的，在产小羊前21天、-14天和-7天、在产小羊时以及产小羊后+3天、+7天和+14天从SRIF-14免疫组或从只给予载体蛋白而没有SRIF-14的安慰组中取血样。从颈静脉中收集周围血放入枸橼酸钠中。将枸橼酸盐化的血进行离心并除去淡黄色覆盖层。通过用如Chmann et al.，1984中所述的红细胞高张力溶血使PMN组分从红血球中分离出来。
在Johnson et al.，1978中所述的方法通过产生超氧化物阴离子来测量细胞的功能性活性，并用Ohmann et al.，1984中所述的方法修饰。简言之，通过使氮蓝四唑(NBT)还原来测定过氧化物阴离子的产生及释放。将约10°细胞置于0.05% NBT与酵母多糖(2.52毫克)一起在37℃下孵化30分钟使其活化。终止反应，细胞集结，NBT的还原则在572nm处用分光光度法测定。
SRIF免疫动物的PMN活性显著高于对照组中观察到的水平(见图6)。分娩后7天增长的活性减少，这与平时观察到的动物分娩时的免疫抑制一致。
这样，我们已经阐述了在脊椎动物中用来增强生殖行为及免疫功能的制剂和方法。虽然已较详尽地描述了本发明的较好实例，但应当明白可以作一些显而易见的变化而不违背本发明权利要求所定义的精神及范围。
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权利要求
1.一种组合物，其特征在于它包含一种药理学上可行的载体及一种SRIF相关肽。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于所述的SRIF相关肽为SRIF-14。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于所述的SRIF相关肽与一个载体相连结。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于所述的载体实质上同源于轮状病毒VP6的内壳蛋白，或其功能性片段。
5.一种制剂，其特征在于它包括药理学上可行的载体，与卵白蛋白相连的SRIF相关肽及一种包含Al(OH)3的佐剂。
6.一种制剂，其特征在于它含药理学上可行的载体及抗SRIF抗体。
7.一种通过诱导免疫反应而增强脊椎动物生殖效率的方法，其特征在于该方法包括给所述的脊椎动物服用有效治疗剂量的根据权利要求1，5或6的制剂。
8.一种通过诱导免疫反应而增强脊椎动物免疫功能的方法，其特征在于该方法包括给所述的脊椎动物服用有效治疗剂量的根据权利要求1，5或6的制剂。
9.一种通过诱导免疫反应增强脊椎动物体内SRIF活性的方法，其特征在于该方法包括给所述的脊椎动物服用有效治疗剂量的根据权利要求1，5或6的制剂。
10.一种通过诱导免疫反应增强脊椎动物吞噬细胞功能的方法，其特征在于该方法包括给所述的脊椎动物服用有效治疗剂量的根据权利要求1，5或的制剂。
全文摘要
本发明揭示了调节脊椎动物体内SRIF活性，及增强脊椎动物生殖行为和免疫功能的制剂及方法。可以给动物服用含SRIF相关肽或抗体的制剂以调节内源性SRIF样活性。SRIF相关肽能与载体例如卵清蛋白连结，及在Al(OH)
文档编号A61P15/00GK1048328SQ9010316
公开日1991年1月9日 申请日期1990年6月22日 优先权日1989年6月22日
发明者伯纳德·拉维尔德, 罗伊·内维尔·科克沃德, 菲利普·阿尔弗雷德·撒克, 洛兰·M·索尔迪洛, 马克·雷德蒙 申请人:萨斯喀彻温大学