专利名称：一种以γ-亚麻酸为主要成分的生物制剂、制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术，特别提供了一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂，生产该制剂的菌种及生产该制剂的方法。
γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid，简称GLA)作为人体必需脂肪酸，在机体内具有重要的生理功能。GLA为一种18碳三烯酸，分子式为C1830O2系无色或淡黄色油状液体。GLA是合成具有高度生理活性的前列腺素的前体，是组成人体各组织生物膜的结构材料，存在于人体多种组织中，在人体营养学和医疗方面具有重要作用。当人体摄取了过量的饱和脂肪酸或出现其他代谢紊乱时，正常脂肪酸代谢受阻，造成体内前列腺索缺乏，导致各种疾病产生。此时若及时补充GLA，便可保证体内前列腺素的正常代谢从而消除疾病，因此作为营养物质的GLA对于生命来说是极其重要的。此外，近年来大量的药理和临床研究表明，GLA具有重要的生理功能，如具有明显的降血脂作用；抑制血小板聚集和血栓素A2的合成；具有明显的抗脂质过氧化作用，具有抑制溃疡及胃出血作用；增强胰岛素作用等。随着研究的深入GLA对癌症、酒精中毒、炎症、减肥等均具有一定的疗效和改善作用。总之机体中若缺乏GLA，则会导致多种疾病的发生，由此预示GLA具有广泛的医疗保健前景。
国际上开发GLA的应用研究，始于70年代月见草油的临床应用。但由于资源、环境等因素的影响，月见草籽资源受到限制，应用微生物发酵法生产GLA及其应用开发技术是国际上研究的新领域。1985年日本工业技术院化学研究所首先利用Mortierella(被孢霉)发酵法制取GLA获得成功，后由日本出光石油化学公司实现工业化生产，随后英国Sturge公司利用Mucor(毛霉)发酵法生产GLA也获得成功，由于菌体发酵产物中其它有效成份较少，上述两家公司皆以提取菌体中纯GLA为目的，工艺复杂，以其为原料开发的产品，仅具有GLA单一成分的功能。中国专利91106190.8公开了一种用已知的剌孢小克银汉霉制备γ-亚麻酸为主的生物制剂的方法，用其生产出的生物制剂，γ-亚麻酸含量可达到油脂中8-15％，还含有多种有效成份，如氨基酸，多糖超氧化物岐化酶(SOD)和维生素等，但是除γ-亚麻酸外其他有效成份很不稳定。并且所公开的方法尚处于实验室阶段，通过简单放大不能达到工业生产的目的。另外，所用菌种产率较低，菌体干重在25-27克/升，最终产品成本较高。
本发明的目的在于提供一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂及其制备方法，可以实现工业化生产，并且其产品有效成份含量稳定，工艺简单，成本较低。
本发明提供了一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂，其特征在于组成如下(重量百分比)粗蛋白 脂肪 全糖纤维素18.5-24.9 30-38 3.5-4.0 12.8-16.3可溶性非氮化物 水分24.0-30.2 3.2-4.5其主要有效成分稳定在γ-亚麻酸 多糖 维生素 氨基酸2.4-5.3 2.5-3.5 0.025-0.030 6.20-8.15SOD酶800-920u/g上述生物制剂是本发明所提供菌种的代谢产物，本发明所提供菌种为剌孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata(Thaxter)，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNO.0232，是以中国科学院微生物研究所，菌保库菌种AS3.154为原始菌种，分离其单孢子用微波处理，再将获得的新培养物的原生质球经紫外线诱变，摇瓶发酵筛选获得的新变异菌株。该菌株在葡萄糖土豆培养基上，菌落生长速度较快，25-35℃培养2-3天，直径可达2-3cm，初期为白色棉毛状，逐淅变灰黄色或驼黄色。菌丝体发达多分枝，幼令无横隔，直径15-20微米。分生孢子梗直立，分枝顶端膨大的汽囊表面着生小梗，小梗上形成园型或椭园型具有纤细刺的分生孢子，直径10-15微米。该变异株较始发菌株菌丝体松散，生长速度快，形成孢子量多。并且经发酵后菌粉产量高，可达28-32克/升，其他有效成分稳定。
本发明所提供的生物制备工艺流程如下保存菌株→生产菌株→菌种扩大→种子罐→发酵罐→过滤→冲洗→脱水→干燥→检验。
菌种培养由冻干管或沙土管保存菌株移接至土豆汁琼脂斜面上，于25-35℃培养5天，进行菌种活化，再将活化的斜面菌种移接至茄形瓶中进行扩大培养。
种液培养将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为葡萄糖或蔗糖2-4％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％，VB10.0015％，PH5.5-6.5。种子罐培养温度25-35℃；风量1∶0.1-1∶0.5V/V，罐压0.04-0.06MPa；搅拌速度120-180rPm；培养时间24-40小时。
发酵培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，发酵培养基为葡萄糖或蔗糖4-10％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ CaCO30.01％ VB10.0015％，PH为5.5-6.5；接种量5-10％，培养条件同种子罐，培养时间4-5天；菌体收集培养结束后，用三足式离心机离心收集菌体，经水洗脱水后，用振动式干燥机进行菌体干燥，使其含水量达到3.2-4.5％，经检验合格后，冷芷备用。
毒理学、药理学及临床疗效结果急性毒性实验结果表明，本发明100g/kg经口给与小鼠，未见明显毒性，本发明的最大耐受量＞100g/Kg(含GLA3.33g)相当于临床用量的666倍。
长期毒性实验结果表明，本发明按10g/Kg/日给大鼠灌服，7.5g/Kg/日经口投于狗，连续饲服6个月，未见动物出现外观、体重、血象、血液生化学指标及脏器组织的毒性变化。
致畸敏感期毒性试验表明，本发明口服50mg/Kg和150mg/Kg(含GLA量)于胚鼠器官形成期连续给药10天，无论是大剂量还是小剂量，对胎鼠的体重、身长、尾长、死胎、吸收胎、存活胎、窝重与对照组比较，无明显差异，胎鼠在外观、内脏、骨骼检查均未见畸形，表明本品对小鼠的胚胎发育无影响。
致突变作用结果表明，通过Ames试验，染色体畸变试验、微核试验的检测证明本发明的至突变作用为阴性。
药效学试验本发明27mg/kg(以GLA量计，下同)经口给予大鼠，11.5mg/Kg经口给予家兔，对高脂饲料喂养所致的脂代谢紊乱有预防保护作用，其降低甘油三脂作用明显强于32mg/Kg月见草油。
本发明11.5mg/Kg治疗给药对实验性高脂血症家兔有降低胆固醇和甘油三酯，升高高密度脂蛋白作用，其降低胆固醇作用明显强于月见草油。
本发明11.5mg/Kg经口给予家兔，可抑制高脂饲料所至的TC、TG升高，防止HDL下降，降低肝脏脂质沉着，降低肝系数，减轻兔主动脉粥样硬化斑块的程度，其中肝脏TG含量明显低于月见草油组(P＜0.05)，主动泳粥样硬化斑块抑制率明显高于月见草油。
临床疗效观察结果以本发明为主要原料制成的调脂抗栓丸，其初步临床疗效观察表明，对血液流变性，改善血液粘稠度(血浆粘度，全血粘度，红细胞变形性等)具有明显的治疗作用。具有明显调节脂蛋白作用，对降低总胆固醇、甘油三酯有显著作用，对提高抗动脉硬化因子的高密度脂蛋日—胆固醇及其亚组分都有明显的效果。另外对症候的改善如目眩、头痛、无力、头晕、等都有很好的作用。
本发明生物制剂的特点是不仅含有GLA而且还含有微生物多糖、SOD酶、氨基酸(18种必需氨基酸)，维生素(VB1；VB2；VcVPP；VE等)多种营养成分和生物活性物质。
众所周知，多糖和糖结合物在生物学和实际应用中的作用，日益引起重视，微生物多糖是一类具有生物活性的物质，一般认为多糖对机体的免疫功能有促进作用；对机体的损伤具有修复和保护作用；具有抗炎作用；抑瘤作用等功能。SOD酶具有清除自由基功能。因此本生物制剂综合多种营养和生理活性物质的功能，在药效学实验及临床观察中，其作用均优于仅含GLA的月见草油，这正是本发明的创新之外。此外由于采用生物工程技术，故本发明具有原材料广泛易得，工艺流程简单，成本低廉，适于大规模生产等优点。以本发明生物制剂为原料的功能食品，保健药品及治疗药物的新产品正推向市场。下面通过实施例详叙本发明。
实施例1微生物菌体摇瓶发酵培养方法摇瓶种子与发酵培养基配方同发酵工艺中所述培养基。摇瓶装量100ml/500将斜面菌种加入无菌水制成孢子悬浮流，接种于种子培养基中，往复式摇床振荡培养，转数120次/分，温度28-30℃，时间40小时。种液菌丝体生长旺盛，菌球细小均匀，无污染。将其以10％接种量接入发酵培养基中，培养条件同种子液，时间120小时，将菌体过滤、水洗、于燥得菌粉，用石油醚提取法获得GLA的油脂。菌体重30g/l，油脂含量32％，GLA4.16％，多糖3.0％，氨基酸8％，维生素0.03％；SOD酶850u/g。
实施例2，3001罐发酵培养方法斜面、种子液、发酵液培养基配方同实实例1，种子罐投料量601/1001。以孢子悬浮液接种于种子罐中其工艺条件为温度28-30℃，罐压0.05Mpa，风量1∶0.5V/V，搅拌速度180转/分，种令32小时，接种量10％。将生长良好之种液接入300ml发酵罐中，投料量2001/3001，接种量10％，培养条件同种子罐。发酵时间115小时，经菌体收集、水洗、干燥，获干菌体6.6Kg；油脂含量35％；GLA3.63％；多糖3.0％，氨基酸7.3％，维生素0.025％，SOD酶835u/g。
实施例3.5001发酵罐制备方法培养基与培养条件同实施例2，发酵罐投料量为3001/5001发酵时间113小时，获于菌体8.8Kg；油脂含量35.3％；GLA含量3.05％；多糖3.2％；氨基酸7.9％；维生素0.028％；SOD酶890U/g实施例4.1200L发酵罐培养方法培养基与培养条件同实施例2，发酵罐投料量900L/1200L。发酵时间为90小时。获得于菌体23.5Kg；油脂含量31.5％；GLA含量4.41％；多糖3.3％；氨基酸7.5％；维生素0.026％；SOD875U/g。
实施例5.生物制剂的开发应用将经发酵获得的干菌体，粉碎过80目筛得到本制剂，以其为主要原料与蜂蜜等配合调制成预防与治疗心脑血管疾病的药物剂型；经毒理学、药理学及临床疗效观察表明，无毒性、无致畸、致突变等不良作用，药理学功能及临床疗效结果与前述发明内容相一致，保健功能作用与治疗效果均明显优于月见草油。
综上所述，本发明提供了包括生产菌株、发酵工艺、毒理学、药理学、临床疗效观察结果以及产品开发应用等一系列产GLA微生物菌体制备及应用技术。本发明具有原材料广泛易得，工艺流程简单，成本低廉，适于大规模生产等优点。其提供的生物制剂不仅含有GLA而且还含有微生物多糖、SOD酶、多种氨基酸和维生素等营养成分及生物活性物质。以其为主要原料调制成预防、改善、治疗高血压高血脂、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的治疗药物和保健食品。经毒理学、药理学及临床疗效观察证明，无毒、无致畸，致突变等不良作用，疗效显著，明显优于月见草油及被孢霉，毛霉发酵制取的单纯GLA，具有广阔的开发应用前景。
权利要求
1.一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂，其特征在于组成如下(重量百分比)粗蛋白 脂肪 全糖纤维素18.5-24.930-38 3.5-4.0 12.8-16.3可溶性非氮化物 水分24.0-30.23.2-4.5其主要有效成分稳定在γ-亚麻酸 多糖 维生素 氨基酸2.4-5.32.5-3.5 0.025-0.030 6.20-8.15SOD酶800-920u/g
2.一种生产权利要求1所述生物制剂的菌种，剌孢小克银汉霉Cunnighamella echinulata(Thaxter)，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNO.0232.
3.一种权利要求1所述生物制剂的制备方法，其特征在于用权利要求2所述菌种制备过程如下----菌种培养由冻干管或沙土管保存菌株移接至土豆汁凉脂斜面上，于25-35℃培养2-7天，进行菌种活化，再将活化之斜面菌种移接至茄形瓶中进行扩大培养----种液培养将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为葡萄糖或蔗糖2-4％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ VB10.0010-0.0020％，PH为5.5-6.5；种子罐培养温度25-35℃，风量1∶0.1-0.5V/V；罐压0.04-0.06MPa，搅拌速度120-180rPm，培养时间24-40小时；----发酵培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，发酵培养基为葡萄糖或蔗糖4-10％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ CaCO30.07-0.13％ VB10.0010-0.0020％，PH为5.5-65；接种量5-10％，培养条件同种子罐，培养时间4-5天；----菌体收集，水洗，干燥，使其水分含量达到3.2-4.5％。
4.权利要求1所述生物制剂可用于制造治疗心脑血管疾病药物或保健品及功能食品。
全文摘要
一种以γ-亚麻酸为主要成分的生物制剂，其特征在于组成如下(重量百分比)粗蛋白18.5-24.9；脂肪30-38；全糖3.5-4.0；纤维素12.8-16.3；可溶性非氮化物24.0-30.2；水分3.2-4.5；其主要有效成分稳定在γ-亚麻酸2.4-5.3；多糖2.5-3.5；维生素0.025-0.030；氨基酸6.20-8.15；SOD酶800-920u/g。本发明具有原材料广泛易得，工艺流程简单，成本低廉，适于大规模生产等优点。
文档编号A61K38/43GK1134840SQ95119429
公开日1996年11月6日 申请日期1995年12月28日 优先权日1995年9月4日
发明者赵振英, 周连甲, 马清禄 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所