含有增加活性化合物生物利用度的胆汁盐和缓冲剂的药物组合物的制作方法

专利名称：：含有增加活性化合物生物利用度的胆汁盐和缓冲剂的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种药物组合物，特别是通常不易被胃肠道吸收的蛋白质，肽类和其它活性分子的口服组合物。多年的医疗实践已经使用或建议使用许多用于治疗或预防多种疾病或病症的生物活性物质。最为人知的但不是唯一的处方生物活性蛋白质是胰岛素，它被用于控制糖尿病。其它生物活性蛋白质包括生长因子，白介素和降钙素，非蛋白质生物活性物质包括低聚核苷酸和多糖类。一种最容易的给药方法是口服。这种可以使用糖浆，酏剂，片剂，胶囊剂，颗粒剂，粉剂或其它任何常用制剂形式的给药途径通常是简单且直接的，并且对于患者来说经常是最少不便和痛苦的给药途径。然而，不幸的是，当口服大多数这类物质时，它们极不易被吸收。首先，蛋白质类药物和其它生物活性物质的优选给药途径是使这些物质通过胃，而胃是许多物质包括蛋白质不适应的环境。由于胃的酸性，水解和蛋白酶解环境已经有效地将蛋白质类物质消化为氨基酸和寡肽类，然后进行合成代谢，因此，很难想象，如果简单地采用口服给药，多种生物活性蛋白质类物质中能否有或能有几种在通过胃时幸存下来而在小肠中被身体吸收。采用肠包衣制剂可使其不受胃酸环境的侵蚀，但尽管如此，相对大的分子如肽类和蛋白质类也很难在小肠内被身体吸收。结果，对许多糖尿病患者来说，许多蛋白质类药物必须经非肠道给药，即经常用皮下，肌内或静脉内注射方式给药，因而，患者要承受由此带来的所有不便，缺点和困难。这不是孤立的问题，因为需要用蛋白质类物质控制疾病是非常普遍的。例如，在世界上许多国家有大量的糖尿病患者，而且有许多其它疾病需要使用蛋白质类化合物或其它大分子来治疗。骨质疏松症是另一种能用蛋白质(在此情况下使用降钙素)治疗的疾病，而且，蛋白生长激素可用于治疗侏儒症。因此，明显地需要一种蛋白质和其它大分子类药物制剂，它们可以口服，并且提供可接受的活性物质的生物利用度。已知，当药物活性化合物与某些胆汁盐一起给药时，它们的生物利用度增加。柯开米(Kakemi)等人曾讨论过这个问题，[《化学药物通讯》(Chem.Pharm.Bull，)18(2)275-280(1970)]，他认为当多种物质与牛磺胆酸盐或甘胆酸盐一起给药时，能增加其生物利用度。柯几玛(Kojima)等人的进一步实验[《化学药物通讯》(Chem.Pharm.Bull)，25(6)1243-1248(1977)]说明胆酸钠能增加多种物质的吸收，但也加速细胞膜部分的释放。另外，在现有技术的一些其它文献中是用胆汁盐作为吸收增强剂，其中包括GB-A-22444918，它告诉我们，当促生长素抑制素与胆酸衍生物如鹅胆酸或乌索脱氧胆酸一起给药时，促生长素抑制素的生物利用度可以得到改善。据信，胆汁盐改进生物活性物质的吸收是由于它们作用于表皮细胞的细胞膜。细胞膜变得更容易透过可能是由于胆汁盐的去垢作用从细胞膜上除去了脂，并且使它们变得更易流动。一种理论认为，细胞膜增加通透性能使活性物质穿过表皮细胞。此外，由于细胞膜通透性增加引起的细胞质钠或钙水平的改变，可能会改变表皮细胞的细胞骨架结构，这将导致紧密连接完整性的变化，从而使活性物质能够穿过细胞间的间隙。不论何种机理，似乎都表明，增加细胞膜通透性会使吸收增加。然而，包含胆汁盐的药物制剂总是有问题，因为，当使用需要量的胆汁盐以改进生物利用度时，它们具有不可接受的高毒性。有人已经指出，与胆汁盐接触的表皮细胞的通透性增加会增加离子流进或流出细胞。为使这些细胞保持存活，细胞内离子如钠，钾和钙离子的浓度必须保持在相对窄的范围内，并且该范围可能是由于胆汁盐的存在引起的离子流动增加而使细胞内离子浓度超出细胞存活的范围。因此，用胆汁盐作为吸收增强剂的问题是它们总被认为具有不可接受的低治疗指数。在整个说明书中使用的术语“治疗指数”指下列之比毒性剂量增强吸收剂量因此，能够减小胆汁盐毒性且有效地增加胆汁盐在某点的治疗指数是极为有用的，在该点胆汁盐可被用于药物组合物而没有不可接受的毒副作用。本发明第一方面是提供一种药物和/或兽医用组合物，该组合物含有生物活性物质，胆汁酸或盐以及一种将肠内pH调节到7.5-9的缓冲剂。WO-A-9012583公开了含有活性成份，胆汁盐和胆汁附加成份的药物组合物。然而该文献认为可能只有附加成份在这种组合物中是有用的，这种附加成份是附加胆汁盐和胆汁脂，特别是磷脂。虽然碳酸氢盐(本发明优选的pH调节剂)是胆汁的一个组分，但在WO-A-9012583中没有提到碳酸氢盐，很明显，碳酸氢盐没被指望作为含有胆汁盐和药物活性剂的组合物的有用成份。因此，碳酸氢盐或其它pH调节剂在有效增加胆汁盐治疗指数方面的作用在该已有文献中肯定没有公开。应该理解，在本发明中术语“胆汁盐”和“胆汁酸”可以交换使用，因为，无论是盐或其相应的酸是否存在，都将取决于周围环境的pH值。因此，本发明固体制剂既可以包含胆汁盐，也可以包含胆汁酸。但是，如果药用组合物经常是使用胆汁酸，则其pH要能够使胆汁酸在溶液中被转化成盐的形式。当本发明组合物使用胆汁盐时，优选有适当的平衡离子存在，如钠或钾。还可以使用，例如，铵离子，但不作为优选离子。胆汁盐是天然产生的表面活性剂。它们是一组具有基于胆甾烷酸的普通“骨架”结构的化合物，在所有哺乳动物和高等蔬菜中都发现有胆甾烷酸。胆汁盐可以是一，二或三羟基化物；它们通常包含一个3α-羟基，而其它羟基，最常见的是在C6，C7或C12，既可以在分子平面的上方(β)也可以在下方(α)。在这类化合物中所说胆汁盐包括在带有作为伯侧链部分的羧基的两亲多元甾醇中。在哺乳动物中它们最普通的实例来自于胆甾醇代谢，而且被发现于胆汁，并以衍生物形式存在于整个肠道。在本说明书中，该术语也可以用于天然产生胆汁盐的合成类似物，因为它们也表现出类似的生物作用。或用于微生物衍生分子，如梭链孢酸及其衍生物。胆汁盐既可以是非结合的也可以是结合的。术语“非结合的”指其中伯侧链有单个羧基的胆汁盐，该羧基在端位且未被取代。非结合胆汁盐的实例包括胆酸盐，乌索脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐和脱氧胆酸盐。结合胆汁盐是其中伯侧链有一个取代羧基的胆汁盐。取代基通常是通过氮原子连到胆汁盐的羧基上的氨基酸衍生物。结合胆汁盐的实例包括牛磺胆酸盐，甘胆酸盐，牛磺脱氧胆酸盐和甘脱氧胆酸盐。在单剂量制剂中胆汁酸的含量取决于所选的具体胆汁酸，以及胆汁酸在肠道内水性流体中的溶解度和溶解范围。对于鹅脱氧胆酸和大多数其它酸，该含量应在10mg-1g范围内，优选20-200mg，最优选30-100mg。对于脱氧胆酸，考虑到它活性稍大，因此该含量的最大值一般不超过500mg。许多动物(尤其是人和其它哺乳动物)的肠道对中性以下的pH有天然适应作用。本发明组合物含有将肠道的pH调节到pH7.5-9的缓冲剂。该试剂既可以依靠其本身的化学性质或通过控制用量，但通常是依靠两者“适应性地”调节pH值。对肠道来说，最佳pH是调节到7.8-8.3的范围。如果在本发明中可以成功地使用简单的缓冲剂来调节肠道的pH为上述指定范围，那么最好该pH调节剂还有缓冲肠道pH至上述范围的能力。这样就可以得到更长的持续药效，这在许多场合是需要的。而且，缓冲剂有更大的适应患者与患者本身肠道pH之间差别的能力，以及对任何单个患者观察期间肠道pH的存活力；特别是，缓冲剂能起到安全屏障作用，保证患者肠道的pH在本发明制剂给药过程中基本上不会变化到安全限以外。用于本发明调节pH至适当值的最佳试剂中的两种是碳酸和碳酸氢根离子，它们可以分别使用，也可以结合使用。在下面的讨论中，主要用碳酸氢盐说明所涉及的原理，但同样的原理适用于能对肠内pH产生类似效果的其它试剂。直接确定将pH调节到预期范围内所必需的试剂用量是很困难的，因为肠内pH可以在5-7变化，而且其中水含量以及其本身的缓冲能力也在变化，其作用是维持一个低的pH。因此，要确定控制pH的试剂的适当用量就需要考虑到“最坏情况”。通过观察将潜在pH调节剂加到pH6.0的50mMMES(吗啉代乙磺酸)溶液中pH的变化情况，可以获得一个指导用量。用于本发明的浓度是要将pH调节到7.5-9；优选浓度是调节到7.8-8.3。(由于下面将要解释的原因，pH调节剂的重量含量表示一般是在10ml液体中产生所需浓度的量)。下面列出分散在蒸馏水或MES中的不同浓度的优选碳酸氢盐所得到的pH值。碳酸氢盐浓度水MES(摩尔数)0.0028.866.420.0048.676.580.0088.636.860.0168.577.140.0318.557.400.0628.497.680.1258.417.930.2508.308.140.5008.168.051.0008.027.96因此，大多数情况下本发明碳酸氢盐的最小用量约为0.045M，它在肠内产生的pH约为7.5。对10ml分散液，这等价于40mg碳酸氢钠。碳酸氢钠的饱和水溶液(＜2M)的pH约为8.01。由此可见，不必考虑所用的优选碳酸氢盐的浓度，pH不会达到9.0以上。在某些情况下，胆汁酸本身的盐溶液浓度已足以使pH升到适宜的水平，尽管其作用没有优选碳酸氢盐强。因此，虽然不总需要，但用胆汁盐本身或其它胆汁盐作为pH调节剂也是可能的。组合物的缓冲能力越大，上述指定范围内的pH在肠内保持的时间越长，进而，本发明效果时间也将越长。适用于本发明的最佳缓冲剂中的两种是碳酸和碳酸氢根离子，它们可以分别使用，也可以结合使用。如上所述，本发明组合物的优点在于它们能够有效地增加组合物中的胆汁盐的治疗指数。结合和非结合胆汁盐都具有这种有益的功效，但结合胆汁盐中碳酸或碳酸氢根离子的作用与非结合胆汁盐中的稍有不同。对于结合胆汁盐，足量碳酸氢盐或碳酸盐的存在使在细胞暴露于给定量的胆汁盐时有效增加细胞膜通透性，并且不影响细胞存活力。这意味着为达到通透性给定的增加值可减少胆汁盐的用量，即在不增加胆汁盐副作用的同时增加细胞的通透性。对于碳酸盐或碳酸氢盐存在下的非结合胆汁盐，在细胞暴露于胆汁盐期间细胞通透性不增加，相反地，在暴露于胆汁盐之后对细胞的毒性作用减小。这意味着在不影响细胞存活力的情况下胆汁盐的给药量在碳酸氢根或碳酸根离子存在下有所增加。总之，当单位剂量组合物分散在适量液体(该液体存在于整个肠内)中时pH调节剂的用量将取决于该组合物对患者的给药情况，即让组合物分布在整个肠内。虽然更精确的计算可以参照上述MES缓冲剂试验，但pH调节剂的浓度至少约为0.01M。但是，对于优选的碳酸盐和碳酸氢盐，碳酸氢盐或碳酸盐的浓度通常大于0.05M。虽然可以使用更高的浓度，如高至1M，但最优选的浓度是至少约为0.1M。本发明组合物可能分布在小肠内的具体长度为30cm，在这段长度的肠内的液体含量可能约为10ml。但是，作为适宜长度被随意选取的30cm应该压缩，而本发明不想对分布在小肠这段距离上的组合物加以限制。理由是想让分布在肠内的组合物保持较短或长得多的时间，例如，持续释放的组合物可以更缓慢地分散，并因此可以在小肠内分布更长的长度。这些组合物是本领域普通技术人员所熟悉的，他们能够很容易地确定最适合的组合物类型，以符合具体的治疗要求。如果采用的组合物要分散于小肠内较长或较短的一段距离，那么水的用量应该相应地增多或减少，所说的水中含有分散后达到指定浓度的单位剂量组合物。分散在水中以确定所需碳酸氢盐最小用量的单位剂量将是在任何时间给患者给药的剂量。对于液体制剂，这个剂量是医生或药剂师通过计算预先确定的剂量。对于固体制剂如片剂或囊剂，单位剂量通常是单个药片或单个胶囊。但是，也有患者需要超过一片或一粒胶囊的情况，例如，如果需要大剂量活性物质，则在这种情况下可将所需量的碳酸氢盐分成两个或多个片剂或胶囊。显然，由于他们可以增加胆汁酸的溶解性，因此优选碳酸根或碳酸氢根离子的其他有益作用还会提高。一般，胆汁盐开始被转化为pH为6.8或以下的相应的酸，而该酸不溶于水溶液。由于缓冲剂有将本发明组合物缓冲到pH约为7.5或以上的作用，所以将出现溶解了的胆汁盐而不是不溶性胆汁酸。当溶解了的胆汁盐在溶液中时，它能够作用于上皮细胞，而这在固体酸形式时是不可能的。缓冲剂的浓度越高，得到满意pH就越快，进而胆汁酸或盐溶解得越快；这将造成胆汁盐在溶液中有较高的局部浓度，进而导致更大效率地提高对生物活性物质的通透性。还一个原因可能是由于碳酸根或碳酸氢根离子的特殊有益作用是以某种方式与碳酸氢盐受体被表达在肠细胞表面这样一个事实相联系。但是，这种联系的本质——如果它确实存在的话——目前还不清楚，而且，在任何情况下，应该强调这种理论的修正或其它情况都不能限制本发明的效力。用碳酸氢盐得到的结果通常是超乎寻常的。如上所述，可以认为，碳酸氢根或碳酸根离子的作用之一是保证胆汁盐能够溶解。然而，钙离子的存在增加了pH使胆汁盐成为普通形式，而且，由于pH值低使得不溶的胆汁酸开始从溶液中沉淀出来。pH值根据具体的胆汁盐而变化，但要能防止胆汁酸沉淀。由于这个原因，组合物中经常含有钙离子螯合剂是有利的。所说螯合剂包括二或三羧酸盐(如柠檬酸盐)，乙二胺四乙酸盐(EDTA)，乙二醇双(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸盐(EGTA)或肌醇六磷酸盐，以及其它多磷化合物。当用柠檬酸盐作为钙离子螯合剂时，最好它是能溶于水的形式。因此，尽管有些情况下也可以使用柠檬酸铵，但最适合的盐是柠檬酸钠或钾。特别地，术语“生物活性物质”包括药物活性蛋白质类物质。该蛋白质类物质可以是纯蛋白质，或含有蛋白质，例如，既含有蛋白质又含有糖基的糖蛋白。该物质既可用作人药或兽药用于治疗或预防疾病或其症状，也可以用于整容和诊断。符合本发明并可用于口服或直肠给药制剂的蛋白质类生物物质的实例包括蛋白质或肽激素或激素释放因子，如胰岛素，降钙素和生长激素，无论是人或动物的，还是半合成或全合成的；或其它生物活性肽，如人干扰素α，以及包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4和IL-5在内的白介素。这些蛋白质和其它蛋白质的类似物和活性片段也可以使用。由于胰岛素正常情况下很难在本发明预期的pH值溶解，但本发明不仅能使胰岛素产生作用而且使其作用得很好，这一点非常重要。由于胰岛素与胆汁盐之间不期望的相互作用使胰岛素似乎只能进行分散，其中胆汁盐的作用是使其在碳酸氢盐或其它高pH溶液中稳定。生物活性物质也可以是低聚核苷酸，如反义低聚核苷酸及其可用于干扰核酸在病毒感染或癌细胞复制方面，或可用于校正不适宜细胞的增生的其它形式方面的类似物。多糖类如肝素也适用于本发明，因为多糖类是一种或多种蛋白质，核酸或多糖类的结合形式。生物活性物质的分子量应该优选不超过20,000Da。这是因为即使使用了本发明组合物使细胞的通透性有所增加，但要用大于这个量的活性分子来达到有效的生物利用度也绝非一件容易的事。因此，一般情况下，活性分子越小，其传递越容易。所以，优选分子量小于10,000Da的生物活性分子，最优选分子量小于5,000Da的。目前，生物活性物质的用量本质上依赖于它的内在潜力。所有必须的是当口服时在足量物质存在的情况下仍表现出其具有所需的活性。对于药品，给药量要遵从医生或临床医师的指导。其它可以使用的赋形剂包括用作填充剂的乳糖，用以保证组合物的均匀性和有助于制剂；Ac-di-solTM(交联羟甲醚纤维素钠)，一种有助于片剂崩解的膨胀剂；以及在制粒过程中常被用作粘合剂的聚乙烯基吡咯烷酮。除了液体剂型外通常还有固体剂型。固体剂型是优选的，因为依靠肠包衣可以很容易地避免活性物质在胃中被消化，而且，可以更容易地保证活性成份和胆汁盐完整和同时到达小肠；这对于液体剂型实现起来要困难地多。如果组合物是固体剂型，为了长期存放，它应该基本是干的。它可以是片，块，粉，颗粒或微粒形式，并可以含有适当的，本领域普通技术人员熟知的填充剂或粘合剂。粉末，颗粒或微粒可以充于胶囊。如上所述，胆汁酸或胆汁盐都可以用于固体制剂。液体剂型有上述不足。但为了某种特殊需要本发明组合物也可制成液体形式，用肠包衣胶囊也许是糖浆或酏剂最好的给药方式。为了迅速或持续释放或将这两种释放形式结合，本发明组合物可制成相应的形式。该组合物还可以被制成立即释放，延迟释放或脉冲释放型制剂。组合物中所用缓冲剂的量取决于组合物的制剂方法和它在肠内分散所需要的时间。因此，在缓释制剂中缓冲剂的含量通常比即释制剂中的用量要大得多。总之，本发明组合物可以用药剂制备领域普通技术人员熟知的技术通过简单地混合各种组分来制备。本发明还涉及改进活性物质生物利用度的方法，该方法包括给患者联合施用活性物质，胆汁盐和将肠内pH调整到7.5-9的缓冲剂。因此，本发明第二个方面是提供胆汁盐和调整肠内ph至7.5-9的缓冲剂在制备某种制剂方面的用途，该制剂用于增加与其联合使用的生物活性物质的生物利用度。本发明第一方面的优选特征已作了必要的说明。下面将用实施例和附图进一步说明本发明，其中图1表示Caco-2细胞体外暴露于平衡盐或碳酸氢盐溶液中的胆汁盐之后的存活力比较，结果用胆汁盐的最大耐受浓度mg/ml表示；图2表示Caco-2细胞体外暴露于HBSS或碳酸氢盐溶液中的结合胆汁盐期间和之后的中性红通透性比较，结果用胆汁盐的最大耐受浓度mg/ml表示；图3表示Caco-2细胞体外暴露于HBSS或碳酸氢盐溶液中的非结合胆汁盐期间和之后的中性红通透性比较，结果用胆汁盐的最大耐受浓度mg/ml表示；图4曲线表示细胞染料用不同缓冲剂中的鹅脱氧胆酸盐培养之后染料释放的百分比；图5曲线表示用不同缓冲剂中的鹅脱氧胆酸盐培养之后线粒体活性减少的百分比；图6涉及实施例3，它表示给猪注射(intrajejunally)给药后pH和胆汁盐浓度对鲑降钙素的作用效果；及图7涉及实施例4，它表示口服胰岛素固体剂型与碳酸氢盐结合使用时效率提高的程度。实施例所用溶液的制备以在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)中0.5mg/ml的浓度制备中性红储液，然后，在使用前用TCM(TissueCultrueMedium)或HBSS(HanksBalancedSaltSolution)稀释成1∶10。制备的HBSS含有以下成份g/LmMCaCl2.2H2O0.191.26KCl0.405.37KH2PO40.060.44MgCl2.6H2O0.100.49MgSO4.7H2O0.100.41NaCl8.00133.33NaHCO30.354.17Na2HPO40.483.38D-葡萄糖1.005.56酚红0.01.制备0.1M碳酸氢钠蒸馏水溶液(缓冲溶液)。类似地制备乙酸钠，硼酸钠和碳酸钠的0.1M蒸馏水溶液。它们都在实施例中作为缓冲液。在HBSS或在一种0.1M缓冲液中制备含有各种浓度胆汁盐的试验溶液。试验下列胆汁盐非结合胆汁盐胆酸钠，乌索脱氧胆酸钠，鹅脱氧胆酸钠，脱氧胆酸钠；结合胆汁盐牛磺胆酸钠，甘胆酸钠，牛磺脱氧胆酸钠，甘脱氧胆酸钠。以在蒸馏水中为5mg/ml的浓度制备MTT储液，使用前用TCM稀释成1∶10。实施例1和2中所述的试验为已知试验并符合英国标准(BS5750)。Caco-2细胞是本领域普通技术人员普遍认为最合适的肠细胞体外模型。实施例1测定细胞毒性和细胞膜通透性的体外培养实验细胞的制备在96孔微量滴定盘的每个孔中以200μl等分地加入浓度为1×105细胞/ml的Caco-2细胞悬浮液。在最外侧的孔中加入200μl盐水，以抵销蒸发作用。在37℃含5％CO2的空气中将细胞在高葡萄糖Dulbecco改性的伊格尔介质(DMEM)组织培养基(TCM)中培养8天，并根据需要添加。然后用该细胞进行最初损害或恢复的研究。A.评价毒性对最初损害的影响中性红染料被活细胞所摄取。有较强通透性膜的细胞会失去染料使之进入到培养基浴中。因此，在暴露于试验物质之后，测定残留在细胞中染料的量即可直接评价细胞膜的通透性。因而，在此方法中，细胞首先被染色，然后用试验物质培养，最后测定用试验物质进行的培养在暴露期间引起染料从细胞泄漏的程度。采用2小时暴露时间；该实验根据以下方法进行。从每个孔的细胞单层中除去TCM，代之以200μl染料。将众盘在37℃的含5％CO2的空气中培养2小时，然后检查均匀染色和正常形态情况。从各孔中除去染料并代之以150μl适当缓冲剂。再从第2列孔中除去缓冲剂并代之以150μl最大浓度的试验溶液。在第3列各孔中加入150μl试验溶液，通过反复抽吸达到均匀混合，再将其中150μl移到第4列孔中。对各盘重复这个过程以得到每行为另一行稀释度两倍的试验物质的稀释液。各盘中有一行以HBSS作为对照组，另一行如果需要可作为缓冲液对照组。在37℃的5％CO2中培养细胞2小时，然后从各孔抽吸染料，并将各盘在含有1％冰醋酸的50％乙醇解吸附溶液(100μl/孔)中摇荡培养20分钟。为了给残留在细胞中的染料定量，在550nm位置测量吸收度。将读数值与缓冲液对照组比较来评价染料从细胞漏出的情况。因此，该试验被用于暴露于胆汁盐期间细胞膜通透性的测量。B.毒害后的恢复中性红染料被活细胞摄取而非存活细胞不被染色。细胞膜透过性增加的细胞染料含量会减少。在不同方法中，细胞首先用试验物质培养，然后用染料培养，最后测定用试验物质进行的培养在暴露之后引起细胞不能吸收/保留中性红的程度。采用2小时暴露时间和在最佳生长物质中的3小时恢复时间，在此期间染料被吸收。该实验用以下方法从各孔中除去TCM并代之以150μl适当缓冲液。从第2列孔中除去缓冲液并代之以150μl最大浓度的试验溶液。在第3列各孔中加入150μl试验溶液，通过反复抽吸达到均匀混合，再将其中150μl移到第4列孔中。对各盘重复这个过程以得到每行为另一行稀释度两倍的试验物质的稀释液。各盘中有一行以HBSS作为对照组，另一行如果需要可作为缓冲液对照组。在37℃的5％CO2中培养细胞2小时。从各孔的细胞单层中除去上清液并代之以200μl染料。将各盘在37℃的含5％CO2的空气中培养细胞3小时。然后从各孔中抽吸染料，并将各盘在含有1％冰醋酸的50％乙醇解吸附溶液(100μl/孔)中摇荡培养20分钟。在550nm位置测量吸收度。将读数值与缓冲液对照组比较来评价活化摄取染料后中性红从细胞漏出的情况。因此，该试验被用于暴露于胆汁盐后恢复期间内细胞膜通透性的测量。碳酸氢盐与HBSS对用胆汁盐处理的细胞的作用效果比较列于表1和2及图2和3。HBSS与碳酸氢盐，乙酸盐与硼酸盐缓冲剂的作用效果比较列于图4和5。应该注意的是，对于HBSS，各组分的比例被调整到当它们被溶解于蒸馏水时能使溶液的pH达到7.0-7.2。在小肠中，pH将低于这个值。相对而言，正如从以前所给的表可以看到的那样，采用碳酸氢盐可使pH接近于8.0，而且，在这里所述各实验结束时也肯定如此。实施例2利用MTT染色测定线粒体活性进而测定细胞毒性的体外培养试验细胞的制备在96孔微量滴定盘的每个孔中以200μl等分地加入浓度为1×105细胞/ml的Caco-2细胞悬浮液。在各盘最外侧孔中加入200μl盐水，以抵销蒸发作用。在37℃含5％CO2的空气中将细胞在高葡萄糖DMEM组织培养基(TCM)中培养8天，并根据需要添加。线粒体活性试验MTT是四唑金翁盐，它是在存活细胞中通过线粒体脱氢酶的转化形成的不溶性紫色晶体。死亡的细胞不影响该转化过程。晶体的形成可用比色法进行定量分析，并用来评价线粒体活性以及细胞存活性。MTT储液，试验溶液和缓冲液的制备如上所述。在此方法中，细胞首先用试验物质培养，然后用MTT培养，最后测定用试验物质进行的培养改变了细胞线粒体活性的程度。采用2小时暴露时间和3小时恢复时间，在此期间加入染料。从各孔中除去TCM并代之以150μl适当缓冲剂。从第2列孔中除去缓冲剂并代之以150μl最大浓度的试验溶液。在第3列各孔中加入150μl试验溶液，通过反复抽吸达到均匀混合，再将其中150μl移到第4列孔中。对各盘重复这个过程以得到每行为另一行稀释度两倍的试验物质的稀释液。各盘中有一行以HBSS(参见实施例1)作为对照组，另一行如果需要可作为缓冲剂对照组。在37℃5％CO2中培养细胞2小时。从各孔的细胞单层中除去上清液并代之以200μlMTT。将各盘在37℃5％CO2中培养细胞3小时，然后用肉眼观察以评价各孔的染色水平。从各孔中抽吸染料，并将各盘在含有0.1MHCl的无水异丙醇解吸附溶液(100μl/孔)中摇荡培养20分钟。在550-650nm处测量吸收度。将读数值与缓冲剂对照组比较来评价线粒体活性的变化。以下对照组染色的减弱表明线粒体活性的减弱，而且是培养基中活性物质毒性的充分体现。结果实施例1和2的结果列于表1和2，图1至图5说明在高pH缓冲剂存在下，用碳酸氢盐作为具体实例时结合和非结合胆汁酸所发挥的作用。表1-在碳酸氢盐或HBSS存在下Caco-2细胞在体外所能耐受的非结合胆汁盐的最大浓度(mg/mL)</tables>表2-在碳酸氢盐或HBSS存在下Caco-2细胞在体外所能耐受的结合胆汁盐的最大浓度(mg/mL)表1和2表示实施例1和2所述实验结果。表中第一列列出了试验介质中的胆汁盐，试验介质本身列于第二列。试验介质是HBSS或0.1M碳酸氢钠溶液。暴露于胆汁盐期间和之后对中性红测定的结果给出用mg/mL表示的胆汁盐最大浓度，其中细胞通透性保持未受影响(与在没有胆汁盐的培养基中培养的细胞相比)。在MTT一列的结果表示胆汁盐的最大浓度，其中细胞的存活性在培养之后保持未受影响。表1给出了非结合胆汁盐的实验结果，而且它指出在各种情况下，在中性红和MTT(暴露之后)两列中通过碳酸氢盐施加胆汁盐比通过HBSS施加的数值大，尽管在中性红(暴露期间)一列两数的差别不大。这表示，在用胆汁盐培养期间细胞的通透性在碳酸氢根离子存在时不会有大的改变，但是，由于培养之后细胞中出现毒性作用，所以需要更多的胆汁盐。因此，这意味着在碳酸氢根离子存在时及毒性明显地作用于细胞之前，这些细胞可以暴露于更多的胆汁盐。因为可以增加胆汁盐的用量，所以，培养之后细胞的通透性也可以在不受细胞存活性影响的情况下得以增加。表2给出了结合胆汁盐的实验结果，而且它指出在各种情况下，当在碳酸氢盐存在的情况下施用胆汁盐时中性红(暴露期间)列的数字增加，而中性红和MTT(暴露之后)两列中数值不变。这表示，在用胆汁盐培养时，有碳酸氢盐存在比没有碳酸氢盐存在需要较少的胆汁盐来增加细胞的通透性。所列结果还表示，培养之后细胞的通透性和存活性不受胆汁盐存在的影响。因此，在碳酸氢根离子存在时，可在培养期间用结合胆汁盐，在不增加胆汁盐浓度的情况下增加细胞的通透性，而且也不会反向影响细胞存活性。图1至图3是表1和2所列结果的图形表示。图1表示碳酸氢盐对用胆汁盐溶液培养的细胞的存活性的作用效果，是MTT存活性试验的测量结果。对于结合胆汁盐，可以看到，碳酸氢盐的存在不影响用胆汁盐培养之后的细胞的存活性，而对于非结合胆汁盐，胆汁盐的浓度在碳酸氢盐存在时明显增加，用这样的胆汁盐处理的细胞不影响它们的存活性。图2表示在用结合胆汁盐培养期间和之后通过中性红测定测量的细胞存活性。可以看出，在暴露期间，在0.1M碳酸氢盐存在时，为增加细胞存活性所需要的胆汁盐的用量低于HBSS存在时。但是，在暴露之后，细胞的通透性转为正常。这意味着，对于给定量的胆汁盐，细胞通透性在暴露期间可以明显增加。然而，在暴露之后，与对照组(用胆汁盐和HBSS而非碳酸氢盐培养的细胞)相比细胞的存活性保持未变。图3类似于图2，是非结合胆汁盐存在情况下的结果。在这种情况下，可以看到，在暴露于胆汁盐期间碳酸氢盐并没有非常清晰地影响细胞的通透性，而是在暴露之后，而且，在不引起细胞通透性增加的情况下可以施用的胆汁盐的最大浓度增加，因而，在碳酸氢盐存在时细胞通透性明显减小。图4的曲线表示在中性红测定中将染色细胞暴露于不同pH值的胆汁盐后染料释放的百分比，以鹅脱氧胆酸盐为例。该曲线相当明确得到表示从用pH在7.5以上培养基培养的细胞中释放的染料要少得多，而且，这种对细胞短期和长期恢复预见性的培养在升高pH的情况下会更好。同样，图5表示在升高pH的条件下毒性明显减小，该图表示在用不同缓冲液中的鹅脱氧胆酸盐培养之后线粒体活性减少的百分比。pH7.0培养基的制备是将含有3％(v/v)1MHEPES(羟乙基亚丙基乙磺酸)的HBSS溶液调至pH7.0。pH7.5培养基的制备是将含有50mMTRIZMATM的HBSS溶液调至pH7.5。pH8.0培养基的制备是将含有50mMTRIZMATM的HBSS溶液调至pH8.0。pH8.5培养基的制备是将含有50mMTricine的HBSS溶液调至pH8.5。该结果还表明，用0.1MpH为8.0的碳酸氢盐可以观察到此现象，但仅用pH为7.5的HBSS则观察不到。在下列实施例所报告的体内实验中可以证明所用碳酸氢盐的浓度在肠内环境中确实具有所需要的作用。实施例3体内效率研究——鲑降钙素(SalmonCalcitonin)先将用于研究的猪(大白×大白/长白猪，雄性，65kg)麻醉后进行准备性手术，10天后将两个电极经中央隐静脉动脉插入背侧主动脉。将内径约1.6-2mm的插管插入空肠。随意给这些猪喂些水，禁食一夜，然后每天早晚喂食两次。在治疗的那些天禁止早晨喂食，直到取得最后的血样之后。将药剂鲑降钙素(sCT)经插管滴注到空肠内，然后用温消毒水冲洗。给药前后取血样多次，每次8ml，并分成两部分。一部分允许在室温凝结，抽取血清并储存于-20℃，以备后用。另一部分被转移到肝素化管，并加入4000kiu(iu为国际单位)抑肽酶。离心之后倾析血浆并贮存于-20℃。用钙敏感螯合剂偶氮胂III络合之后比色法测量血清钙浓度。用9只猪进行研究。分3天给药，每次相隔至少一天，以随机三路交叉方式，因此，所有的猪都接受三次治疗。每次的治疗剂可以仅含溶解于2ml磷酸盐缓冲盐水的625iusCT，pH为7.5，或与25mg鹅脱氧胆酸钠(_Δ_)一起使用，或与50mg鹅脱氧胆酸钠(_■_)一起使用，或与50mg鹅脱氧胆酸钠一起使用，然后用盐酸将pH降至6.5(_×_)。结果示于图6，以血浆钙浓度与时间相对于降钙素的变化表示。由此可见，胆汁盐在提高降钙素摄取量方面的效率依赖于所含胆汁盐的浓度，以及给药时的pH值。实施例4体内效率研究——胰岛素用实施例3所用相同方法对猪进行预处理。用标准酶分析方法对血样的葡萄糖进行分析。用2ml含200iu胰岛素的溶液(在pH5时加肽至该溶液)，或用胰岛素固体制剂，以及用或不用碳酸氢钠对动物给药。每个药剂含有300mg上述制剂，并能在使用前迅速悬浮于2ml磷酸盐缓冲盐水溶液。两种制剂的组分以重量-重量形式列于下表。无碳酸氢盐(wt/wt)有碳酸氢盐(wt/wt)牛胰岛素2.4牛胰岛素2.4鹅脱氧胆酸16.7鹅脱氧胆酸16.7乳糖74.9乳糖66.6Ac-di-sol3.0Ac-di-sol3.0聚乙烯基吡咯烷酮3.0聚乙烯基吡咯烷酮3.0碳酸氢钠8.3pH＜7.0pH＞7.5结果示于图6，以血浆葡萄糖浓度与时间相对于胰岛素的变化表示。由此可见，胆汁酸鹅脱氧胆酸在提高通过肠的肽摄取量方面的效率由于固体药剂中碳酸氢钠的存在而明显改善。权利要求1.一种药用和/或兽用组合物，包括生物活性物质，胆汁酸或盐，以及将肠内pH调至7.5-9的缓冲剂。2.权利要求1的组合物，其中缓冲剂将肠内pH调至7.8-8.3。3.权利要求1或2的组合物，其中存在可溶性平衡离子。4.权利要求1，2或3的组合物，其中胆汁酸或盐是非结合的。5.权利要求4的组合物，其中胆汁酸或盐是鹅脱氧胆酸或乌索脱氧胆酸或它们的盐。6.权利要求1，2或3的组合物，其中胆汁酸或盐是结合的。7.权利要求1-6中任一组合物，其中pH调节剂适于将肠内pH调整到所述范围。8.权利要求7的组合物，其中缓冲剂含有碳酸根和/或碳酸氢根离子。9.权利要求8的组合物，其中碳酸氢根或碳酸根的浓度至少约为0.1M。10.权利要求8或9的组合物，其中含有当将单位剂量组合物分散于10ml水中时足以使碳酸氢根或碳酸根浓度至少达到0.045M的碳酸氢根或碳酸根离子。11.权利要求1-10中任一组合物，其中pH调节剂本身含有胆汁酸或盐。12.权利要求1-11中任一组合物，其中包括钙离子螯合剂如二-或三-羧酸盐，例如，柠檬酸盐，乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇双(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，或多磷酸盐如肌醇六磷酸盐。13.权利要求1-12中任一组合物，其中生物活性物质是蛋白质如胰岛素，降钙素，生长激素，干扰素，白介素或它们中任一个的活性片段。14.权利要求1-12中任一组合物，其中生物活性物质是低聚核苷酸(或其类似物)或多糖类。15.权利要求1-14中任一组合物，其中生物活性物质的分子量小于约20,000Da。16.权利要求15的组合物，其中生物活性物质的分子量小于约10,000Da。17.权利要求1-16中任一组合物，被制成干燥固体制剂。18.权利要求17的组合物，其为片剂，丸剂，粉剂，颗粒或微粒形式。19.胆汁盐和将肠内pH调至7.5-9的缓冲剂的用途，同时使用缓冲剂可以增加生物活性物质的生物利用度。20.一种改善活性物质生物利用度的方法，该方法包括给患者在施用活性物质的同时共同施用胆汁盐和将肠内pH调至7.5-9的缓冲剂。21.一种改善胆汁盐(与其作为通透性增强剂提高活性物质在肠内的能力有关)有效治疗指数的方法，该方法包括给患者在施用活性物质的同时共同施用胆汁盐和将肠内pH调至7.5-9的缓冲剂。全文摘要本发明组合物含有胆汁盐和可将肠内pH调整到7.5-9的缓冲剂如碳酸盐或碳酸氢盐，它能够在使毒性副作用(胆汁盐通常都伴有毒副作用)最小的同时增加活性分子的生物利用度。文档编号A61K38/28GK1163573SQ9519483公开日1997年10月29日申请日期1995年8月25日优先权日1995年8月25日发明者R·R·C·纽申请人:科特克斯有限公司