专利名称：作为药物化合物分布图分析的体外筛选工具的双转染的细胞系肝胆管清除模型的制作方法
适宜作为药物化合物分布图分析的体外工具的用人NTCP和人MRP2转染的细胞系肝胆管清除模型本发明涉及表达人NTCP(Na/牛磺胆酸根协同转运蛋白(Na/taurocholate Cotransporting Protein)；SLC10A1)以及人BSEP(胆汁盐输出泵(Bile Salt Export Pump)；ABCB11)或人MRP2(多药耐性蛋白(Multidrug Resistance Protein)；ABCC2)的一些双转染的细胞系。
穿过生物屏障的跨细胞转运过程在药物和异生素的吸收、分布和清除中起重要作用。在肠上皮细胞中，转运蛋白参与药物向体循环/从体循环的吸收或者排除。血脑屏障的细胞中表达的转运蛋白参与毒性(和治疗性)化合物从脑的除去。在肾近曲小管上皮细胞和肝细胞中，转运蛋白参与多种内源和外源性物质的清除。在肝细胞中，该清除过程由(i)通过基底外侧膜从血液向细胞的摄取和(ii)通过顶膜向胆汁的清除来介导。预期在所有生物屏障中通过形成将顶膜和基底外侧膜隔室分开的紧密连接(提供相邻细胞之间非常紧密接触的分子结构)实现细胞周(Paracellular)扩散。保持生物屏障的特征(产生通过紧密连接分开的基底外侧膜和顶膜隔室)的细胞系也称作极性细胞系。通常，这些细胞系以称作单层的单细胞层生长。
化合物向人肝细胞的基底外侧(也称作血窦)摄入通过多种不同的转运蛋白介导大的有机阴离子由OATP8(SLC21A8)、OATP2(SLC21A6，也称作OATP-C或LST1)和OATP-B(SLC21A9)介导，而胆汁酸和可能地类似于胆汁酸的其他化合物由钠牛磺胆酸根协同转运多肽NTCP(SLC10A1)接受。OAT2(SLC22A7)将小的有机阴离子输入肝细胞并且已经报导OCT1(SLC22A1)促进小的有机阳离子的细胞摄入。在顶膜(也称作小管膜)，有机阴离子和胆汁盐向胆汁的清除由多药耐性相关蛋白MRP2(ABCC2)和胆汁盐输出泵BSEP(ABCB11)介导，MRP2和BSEP都是ABC转运蛋白家族(ATP-依赖性输出泵)的成员。也已知在人肝细胞的小管膜表达的其他ABC转运蛋白是乳腺癌抗性蛋白BCRP(ABCG2，也称作MXR)和多药耐性蛋白MDR1(ABCB1，也称作P-糖蛋白)。认为这两种蛋白质参与两亲性和阳离子化合物的小管分泌过程。
多药耐性蛋白(MDR)家族介导亲脂性物质与谷胱甘肽、葡糖醛酸或者硫酸的缀合物的依赖ATP的单向转运(综述Knig J.et al.，Biochimicaet Biophysica Acta 1461(1999)377-394)。
胆汁盐库经历由不同的胆汁盐转运蛋白介导的肠肝循环，这些转运蛋白包括小管胆汁盐输出泵BSEP、回肠NA+-依赖性胆汁盐输出蛋白SIBT，和肝血窦NA+-牛磺胆酸根协同转运多肽NTCP。其他胆汁盐转运蛋白包括有机阴离子转运多肽OATP和多药耐性相关蛋白2和3MRP2，2(综述Trauner et al.，Physiol.Rev.83633-671，2003)。
迄今为止，研究药物的肝胆管清除的唯一方法是在大鼠中进行的胆汁瘘管研究，该方法是复杂且费时的体内测定法。此外，胆汁瘘管研究不能提供关于清除过程的分子基础的任何信息。这里我们描述了一种基于细胞的测定系统，其中肝摄入转运蛋白(在该情况中为人NTCP)与肝输出泵(通常为ABC转运蛋白，在该情况中为人MRP2或者人BSEP)在极化的犬肾细胞系MDCKII中组成性表达(参考文献见Louvard，1980；Fulleret al.，1984)。因此，所得细胞系在一种细胞系中表达两种转基因(i)人NTCP以及人BSEP(MDCKII-hNTCP/hBSEP)和(ii)人NTCP以及人MRP2(MDCKII-hNTCP-hMRP2)。细胞在多孔滤膜上6孔滤器插入物(filterinsert)中培养，从而分离基底外侧隔室和顶端隔室(
图1)。将推定的底物(例如，药物化合物)加入顶端或者基底外侧隔室用于在两个方向进行跨细胞(向量的)转运测量。所指示的培养期间之后，从每个隔室取出样品。给定转运蛋白组合(在该情况中为人NTCP和人BSEP或者人NTCP和人MRP2)的底物表明当与未转染的或者单转染的细胞比较时，从基底外侧向顶端隔室的显著的净转运(图4+5)。
借助所述的双转染的细胞系，将能够预测转运蛋白组合人NTCP/人BSEP或者人NTCP/人MRP2是否参与药物化合物的肝胆管清除过程。
在药物开发中，化合物通常由于它们的弱的药代动力学分布图而不能进入临床研发。一个理由是它们通过肝脏快速清除到胆汁中。该现象的实例是绿原酸衍生物，其是葡萄糖-6-磷酸移位酶的有效且特异的抑制剂(II型糖尿病患者中潜在的新的药学靶标)。药物动力学研究表明在Wistar大鼠中，静脉内快速浓注后，一些绿原酸衍生物的血糖降低作用仅持续很短时间。胆汁瘘管研究表明该弱的药物动力学效果是由于快速肝胆管清除过程导致的不适宜的药物动力学。借助双转染的转运蛋白细胞系，将能够鉴定参与清除过程的转运蛋白。在下一步中，可以化学修饰所述化合物使得减轻它们对清除性转运蛋白的亲和力以改善化合物的药理学。
另一个应用领域将是在肝脏中转运蛋白的水平上检查潜在的药物-药物相互作用。例如，肝脏中两种药物对一种转运蛋白的竞争可以显著改变两种化合物的药物动力学分布图。此外，一种药物对转运蛋白的抑制或者活化也可以改变转运蛋白底物的药理学行为。
本发明涉及哺乳动物细胞，其具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。
这种哺乳动物细胞的第一面是例如基底外侧面并且第二面是顶面或者第一面是例如顶面并且第二面是例如基底外侧面。
哺乳动物细胞可以选自肾、肠系统，肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。
此类细胞可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通的哺乳动物组织或者原代细胞培养物。此类细胞还可以是细胞培养物的细胞，例如LLC-PK1细胞或者MDCKII细胞，尤其当还携带重组载体时。
LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。作为备选，hNTCP和hBSEP蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。MDCKII细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hBSEP蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSM ACC2643。
本发明还涉及携带功能性人NTCP蛋白质和功能性人BSEP蛋白质的哺乳动物细胞的生产方法，其中a]提供哺乳动物细胞；b]提供包含hNTCP的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.4设计或者等于SEQ ID NO.4的载体)；c]提供包含hBSEP的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.5设计或者等于SEQ ID NO.5的载体)；d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。
将为这种生产提供的哺乳动物细胞可以是上皮细胞，尤其是肾、肠系统、肝或者血/脑屏障的上皮细胞。此类细胞还可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通哺乳动物组织或者原代细胞培养物。从如上述生产得到的根据e]的此类双转染子细胞可以是例如，LLC-PK1细胞或者MDCKII，尤其当携带重组载体时。此类LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。hNTCP和hBSEP蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。此类MDCKII细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hBSEP蛋白质(如通过SEQ ID NO.5例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hBSEP蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSMACC2643。
本发明还涉及包含至少两个哺乳动物细胞的细胞单层，所述哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。
此类单层可以占据整个或者部分固体表面。本发明还涉及携带此类细胞单层的这种固体表面。
可以通过塑料形成固体表面。固体表面还可以是培养皿或者滤器插入物(filter-insert)的部分。
本发明还涉及携带前述细胞单层的培养皿以及携带前述细胞单层的滤器插入物。此类滤器插入物的膜支持体可以由聚碳酸酯和/或聚酯制造。膜支持体的孔径可以为0.4μm+/-0.2μm。滤器插入物的相应的实例已经在图1中描绘。一些生产商生产的滤器插入物可以用于将所述细胞单层置于该插入物上。这些生产商为例如“Corning Inc.，Corning，NY”或者“Millipore”。
具有如下特征的哺乳动物细胞可以用于例如确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图该哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。对于这些应用，所述哺乳动物细胞可以在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层的部分。
本发明还涉及哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端的定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。
此类哺乳动物细胞的第一面为例如基底外侧面并且第二面为顶面或者第一面为例如顶面并且第二面为例如基底外侧面。
哺乳动物细胞可以选自上皮细胞，尤其肾、肠系统，肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。
此类细胞还可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通哺乳动物组织或者原代细胞培养物。此类细胞还可以是细胞培养物的细胞，例如LLC-PK1细胞或者MDCKII细胞，尤其当携带重组载体时。
LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2蛋白质(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。作为备选，hNTCP和hMRP2蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。MDCKII细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ ID NO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2蛋白质(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hMRP2蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSM ACC2644。
本发明还涉及携带功能性人NTCP蛋白质和功能性人MRP2蛋白质的哺乳动物细胞的生产方法，其中a]提供哺乳动物细胞；b]提供包含hNTCP的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.4设计或者等于SEQ ID NO.4的载体)；c]提供包含hMRP2的编码序列的载体(例如，根据SEQ ID NO.6设计或者等于SEQ ID NO.6的载体)；d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。
将为这种生产方法提供的哺乳动物细胞可以是上皮细胞，尤其是肾、肠系统、肝或者血/脑屏障的上皮细胞。此类细胞还可以是永生化细胞或者重组细胞。细胞可以来自普通哺乳动物组织或者原代细胞培养物。
从如上述生产方法得到的根据e]的此类双转染子细胞可以是细胞培养物的细胞，例如，LLC-PK1细胞或者MDCKII细胞，尤其当携带重组载体时。此类LLC-PK1细胞可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQID NO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2蛋白质(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。hNTCP和hMRP2蛋白质可以从相同的载体构建体同时表达。此类MDCKII可以含有例如适于表达hNTCP蛋白质(如SEQ IDNO.4例证)的重组载体和适于表达hMRP2(如通过SEQ ID NO.6例证)的重组载体。这种携带能够表达hNTCP蛋白质和hMRP2蛋白质的两种单独载体的MDCKII型的哺乳动物细胞已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。保藏号是DSMACC2644。
本发明还涉及包含至少两个哺乳动物细胞的细胞单层，所述哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。
此类单层可以占据部分或者整个固体表面。本发明还涉及携带此类细胞单层的这种固体表面。
可以通过塑料形成固体表面。固体表面还可以是培养皿或者滤器插入物的部分。
本发明还涉及携带前述细胞单层的培养皿以及携带前述细胞单层的滤器插入物。此类滤器插入物的膜支持体可以由聚碳酸酯和/或聚酯制造。膜支持体的孔径可以为约0.4μm+/-0.2μm。滤器插入物的相应的实例已经在图1中描绘。一些生产商生产的滤器插入物可以用于将所述细胞单层置于该插入物上。这些生产商为例如“Corning Inc.，Corning，NY”或者“Millipore”。
具有如下特征的哺乳动物细胞可以用于例如确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图该哺乳动物细胞具有第一面和第二面，两面形成该细胞的外表面的部分，并且两面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。对于这些应用，所述哺乳动物细胞可以在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层的部分。
当蛋白质处于在生物学背景，尤其作为活细胞的部分发挥活性的条件下时，认为该蛋白质是有功能的。此类活性可以例如通过测定法检测。例如，当转运蛋白将化合物，尤其该转运蛋白的生物学底物从细胞外移动到该细胞的内部隔室，或者反之亦然时，该转运蛋白是有功能的。离子转运蛋白的生物学底物由例如单价和/或二价离子或者其他离子组成。葡萄糖转运蛋白的底物是例如葡萄糖。多耐药性蛋白质的底物是例如仅药物或者缀合到谷胱甘肽或者葡糖酸的药物。
本发明上下文中蛋白质的处理可以通过本领域技术人员通过应用John Wiley & Sons出版的“Current Protocols in Molecular Biology”(编辑John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield；0-471-11184-8-Looseleaf；0-471-14098-8-CDROM)的方案来实现。
有关分子生物学技术的操作，如克隆、细胞的转化、测序、修饰启动子、表达蛋白质或者其他可以由技术人员应用John Wiley & Sons出版的“Current Protocols in Molecular Biology”(编辑Fred M.Ausubel，RogerBrent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl；0-471-50338-X-Looseleaf；0-471-306614CDROM)的方案来实现。
生物细胞的操作可以由技术人员应用John Wiley & Sons出版的“Current Protocols in Molecular Biology”(编辑Fred M.Ausubel，RogerBrent，Robert E.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl；0-471-50338-X-Looseleaf；0-471-306614CDROM)的方案来实现。
实施例细胞系产生MDCKII-hBSEP和MDCKII-hNTCP/hBSEP在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的基本培养基中37℃，5％CO2，和95％湿度下培养MDCK II细胞(Madin-Darby犬肾细胞，株系II)。如下产生MDCKII-hNTCP/hBSEP细胞系(DSM ACC2643)使用如生产商(Roche)描述的FuGene6转染试剂将MDCK II细胞首先用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1zeo(+)-hBSEP转染。用1000μg/ml Zeocin选择转染的细胞。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。所得细胞克隆用免疫印迹筛选重组人BSEP表达，然后用共聚焦激光扫描显微术(Confocal Laser Scanning Microscopy)分析重组人BSEP的适当的亚细胞定位。以最高水平表达人BSEP并且重组BSEP伴随着定位在顶膜的细胞克隆选择用来用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1neo(+)-hNTCP进行FuGene6转染。转染的细胞用800μg/ml遗传霉素和1000μg/ml Zeocin选择。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。双转染的细胞系再次用免疫印迹来筛选重组BSEP和重组人NTCP的表达，然后用共聚焦激光扫描显微术分析两种转基因的适当的亚细胞定位。具有人BSEP(顶膜)和人NTCP(基底外侧膜)的最高表达和适当亚细胞定位的细胞克隆被选择用于进一步的检查。
细胞系产生MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP/hMRP2
在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的基本培养基中37℃，5％CO2，和95％湿度下培养MDCK II细胞(Madin-Darby犬肾细胞，株系II)。如下产生MDCKII-hNTCP/hMRP2细胞系(DSM ACC2644)使用如生产商(Roche)描述的FuGene6转染试剂将MDCK II细胞首先用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1zeo(+)-hMRP2转染。用1000μg/ml Zeocin选择转染的细胞。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。所得细胞克隆用免疫印迹筛选重组人MRP2表达，然后用共聚焦激光扫描显微术分析重组人MRP2的适当的亚细胞定位。以最高水平表达人MRP2并且重组MRP2伴随着定位在顶膜的细胞克隆选择用来用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1neo(+)-hNTCP进行FuGene6转染。转染的细胞用800μg/ml遗传霉素和1000μg/ml Zeocin选择。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。双转染的细胞系再次用免疫印迹来筛选重组人MRP2和重组人NTCP的表达，然后用共聚焦激光扫描显微术分析两种转基因的适当的亚细胞定位。具有人MRP2(顶膜)和人NTCP(基底外侧膜)的最高表达和适当亚细胞定位的细胞克隆被选择用于进一步的检查。
细胞系产生MDCKII-hNTCP在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良的基本培养基中37℃，5％CO2，和95％湿度下培养MDCK II细胞(Madin-Darby犬肾细胞，株系II)。为了产生MDCKII-hNTCP细胞系，使用如生产商(Roche)描述的FuGene6转染试剂将MDCK II细胞用哺乳动物表达质粒pcDNA3.1neo(+)-hNTCP转染。转染的细胞用800μg/ml遗传霉素选择。在选择期间，组织培养基还补充100单位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素。所得细胞克隆用免疫印迹来筛选重组人NTCP的表达，然后对具有最高人NTCP表达的细胞克隆进行功能分析(测量与亲代MDCKII细胞比较在MDCKII-hNTCP细胞中牛磺胆酸的摄入)。
化学药品[3H(G)]-磺溴酞钠(BSP)(0.2TBq/mmol)购自HartmannAnalytic(Braunschweig，Germany)。[2，4-3H(N)]-胆酸(0.7TBq/mmol)，[羧基-14C]-鹅脱氧胆酸(1.9GBq/mmol)和[甘氨酸-2-3H]-甘氨胆酸(0.15TBq/mmol)购自Biotrend Chemikalien(Kln，Germany)。[3H(G)]-牛磺胆酸(0.1TBq/mmol)购自PerkinElmer Life Sciences。Zeocin、遗传霉素、青霉素G和硫酸链霉素从Invitrogen得到。额外分析纯的化学药品从Sigma和Merck(Darmstadt，Germany)得到。
转运测定法细胞在6孔板中在聚酯膜插入物(insert)(孔径0.4μM，插入物直径24mm，Costar)上以汇合(1×106个细胞/插入物)生长6天。通过向生长培养基加入10mM丁酸钠24小时诱导转基因的过表达。第二天，将细胞用转运测定缓冲液(142mM NaCl，5mM KCl，5mM葡萄糖，1.5mM CaCl2，1.2mM MgSO4，1mM KH2PO4，12.5mM HEPES，pH 7.3)洗涤一次，然后向顶部(1.5ml)或者基底外侧(2.5ml)隔室加入[3H]-或[14C]-标记的化合物。相对的隔室填充转运测定缓冲液。所指示的温育期(37℃)后，从每个隔室取出样品并通过闪烁计数(Wallac，Winspectral 1414 LiquidScintillation Counter)测量。如下计算输入的跨细胞转运百分数从顶部隔室向基底外侧隔室的转运转运A-B[％]＝100×(放射性(t1)基底外侧[dpm]×2.5[ml])/(放射性(t0)顶部的[dpm]×1.5[ml])从基底外侧隔室向顶部隔室的转运转运B-A[％]＝100×(放射性(t1)顶部的[dpm]×1.5[ml])/(放射性(t0)基底外侧的[dpm]×2.5[ml])在本发明上下文中将下面的生物材料保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroder Weg 1b；D-38124 Braunschweig)DSM ACC2643双转染的MDCKII细胞，含有用于表达人NTCP(SeqID No.4)的载体和用于表达人BSEP(Seq ID No.5)的载体。
DSM ACC2644双转染的MDCKII细胞，含有用于表达人NTCP(Seq ID No.4)的载体和用于表达人MRP2(Seq ID No.6)的载体。
附图描述图1一般测定法设计细胞在多孔膜(聚酯膜，孔径0.4μM，6-孔)上滤器插入物中作为极化和紧密的单层生长，从而分开基底外侧隔室和顶部隔室。图1描绘了携带细胞单层的滤器插入物的实例。
图2测定法设计MDCK II-hNTCP/hBSEP用人BSEP(B)或人NTCP(C)，或人NTCP和人BSEP(D)转染的MDCK II细胞(A)和MDCK II细胞的图示。人NTCP定位在基底外侧膜而人BSEP定位在顶膜。单转化的细胞系MDCKII-hBSEP和MDCKII-hNTCP用作对照。
图3测定法设计MDCK II-hNTCP/hMRP2用人MRP2(B)或人NTCP(C)，或人NTCP和人MRP2(D)转染的MDCK II细胞(A)和MDCK II细胞的图示。人NTCP定位在基底外侧膜而人MRP2定位在顶膜。单转化的细胞系MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP用作对照。
图4在MDCKII-hNTCP/hBSEP单层中[3H]甘氨胆酸、[3H]牛磺胆酸、[3H]胆酸、[14C]鹅脱氧胆酸和[3H]BSP(磺溴酞钠)的向量转运MDCKII、MDCKII-hNTCP、MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP/hMRP2在滤器插入物上生长6天(1×106个细胞/孔)。通过加入10mM丁酸钠24小时诱导转基因表达。每种化合物的所指示的量分别加入基底外侧或者顶部隔室。45分钟和90分钟后，从相对隔室取出等分试样并通过液体闪烁计数分析。A-B表示向顶部隔室加入化合物和从基底外侧隔室取样(从顶部向基底外侧隔室的向量转运)。B-A表示向基底外侧隔室加入化合物和从顶部隔室取样(从基底外侧向顶部隔室的向量转运)。数据代表平均值±SD(n＝3)。
图5在MDCKII-hNTCP/hMRP2单层中[3H]BSP(磺溴酞钠)、[3H]胆酸和[3H]牛磺胆酸的向量转运MDCKII、MDCKII-hMRP2和MDCKII-hNTCP/hMRP2细胞在滤器插入物上生长6天(1×106个细胞/孔)。通过加入10mM丁酸钠24小时诱导转基因表达。100nM每种化合物分别加入基底外侧或者顶部隔室。1小时和2小时后，从相对的隔室取出等分试样并通过液体闪烁计数分析。A-B表示向顶部隔室加入化合物和从基底外侧隔室取样(从顶部向基底外侧隔室的向量转运)。B-A表示向基底外侧隔室加入化合物和从顶部隔室取样(从基底外侧向顶部隔室的向量转运)。数据代表平均值±SD(n＝3)。
图6人NTCP(Slc10A1)，cDNA序列；长度1061个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.1。
图7人BSEP(ABCB11)，cDNA序列；长度3966个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.2。
图8人MRP2(ABCC2)，cDNA序列；长度4650个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.3。
图9pcDNA3.1neo(+)-hNTCP，全序列；长度6433个碱基；描绘的序列对应于Seq ID No.4人依赖钠的牛磺胆酸根协同转运蛋白(hNTCP，SLC10A1)cDNA经由BamH I和Xba I克隆到pcDNA3.1neo(+)(Invitrogen)的MCS中。用来自人肝脏cDNA文库(Clontech)的基因特异引物对人NTCP cDNA进行PCR扩增。所克隆的cDNA对应于GenBank检索号L21893从76-1136位(编码序列83-1132位)。例外616位c→t(无氨基酸改变)和774位t→c(氨基酸改变F→S)。
图10pcDNA3.1zeo(+)-hBSEP，全序列；长度9043个碱基；所描绘的序列对应于Seq ID No.5用Gateway Technology(Invitrogen)克隆人胆汁盐输出泵(hBSEP，ABCB11)cDNA。用attB-修饰的基因特异引物从人胎儿肝脏cDNA文库(Clontech)对人BSEP cDNA进行PCR扩增并通过pDONR221克隆到pcDNA3.1zeo(+)载体(Invitrogen，修饰成Gateway目的载体)。克隆的cDNA对应于GenBank检索号AF136523从128-4093位(编码序列128-4093位)。例外3211位G→A(无氨基酸改变)。
图11pcDNA3.1zeo(+)-hMRP2，全序列；长度9658个碱基；所描绘的序列对应于Seq ID No.6通过Nhe I和Afl II将人多抗药性相关蛋白2(MRP2，ABCC2)cDNA克隆到pcDNA3.1zeo(+)(Invitrogen)的MCS。用基因特异引物从HepG2cDNA文库PCR扩增人MRP2 cDNA。克隆的cDNA对应于GenBank检索号X96395的26-4675位(编码序列38-4675位)。例外4009位C→T(无氨基酸改变)。
Seq ID描述Seq ID No.1人NTCP(Slc10A1)，cDNA序列；长度1061个碱基；Seq ID No.1在图6中公开。
Seq ID No.2
人BSEP(ABCB11)，cDNA序列；长度3966个碱基；Seq ID No.2在图7中公开。
Seq ID No.3人MRP2(ABCC2)，cDNA序列；长度4650个碱基；Seq ID No.3在图8中公开。
Seq ID No.4pcDNA3.1neo(+)-hNTCP，全序列；长度6433个碱基；Seq ID No.4在图9中公开。
Seq ID No.5pcDNA3.1zeo(+)-hBSEP，全序列；长度9043个碱基；Seq ID No.5在图10中公开。
Seq ID No.6pcDNA3.1zeo(+)-hMRP2，全序列；长度9658个碱基；Seq ID No.6在图11中公开。
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权利要求
1.哺乳动物细胞，其具有第一面和第二面，两个面形成该细胞的外表面的部分，并且两个面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端的定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hBSEP蛋白。
2.权利要求1所述的哺乳动物细胞，其中第一面是基底外侧面并且第二面是顶面。
3.权利要求1和2所述的哺乳动物细胞，其中第一面是顶面并且第二面是基底外侧面。
4.权利要求1到3所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。
5.权利要求1到4所述的哺乳动物细胞，其是永生化的细胞。
6.权利要求1到5所述的哺乳动物细胞，其是重组细胞。
7.权利要求1到6所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hBSEP蛋白的载体的LLC-PK1细胞。
8.权利要求1到6所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hBSEP蛋白的载体的MDCKII细胞。
9.权利要求8的哺乳动物细胞，其是根据保藏物DSM ACC2643的细胞。
10.权利要求1到9的哺乳动物细胞的生产方法，其中a]提供哺乳动物细胞；b]提供包含hNTCP的编码序列的载体；c]提供包含hBSEP的编码序列的载体；d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。
11.权利要求10的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。
12.权利要求10和11的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是永生化的细胞。
13.权利要求10到12的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自b]的载体是根据图9的多核苷酸(Seq ID No.4)。
14.权利要求10到12的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自c]的载体是根据图10的多核苷酸(Seq ID No.5)。
15.权利要求10到14的哺乳动物细胞的生产方法，其中将所述哺乳动物细胞建立为所保藏的细胞DSM ACC2643。
16.细胞单层，其包含至少两个权利要求1到9的细胞。
17.携带权利要求16的单层的固体表面，其中该细胞单层可以占据部分或者整个固体表面。
18.权利要求17的固体表面，其由塑料形成。
19.权利要求17的固体表面，其是培养皿的部分。
20.权利要求17的固体表面，其是滤器插入物(filter-insert)的部分。
21.培养皿，其携带根据权利要求17的细胞单层。
22.滤器插入物，其携带根据权利要求17的细胞单层。
23.权利要求22的滤器插入物，其中膜支持体由聚碳酸酯和/或聚酯制造。
24.权利要求22和23的滤器插入物，其中膜支持体的孔径为0.4μm。
25.权利要求1到9的哺乳动物细胞的用途，用于确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图。
26.权利要求25的哺乳动物细胞的用途，其中哺乳动物细胞在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层。
27.哺乳动物细胞，其具有第一面和第二面，两个面形成该细胞的外表面的部分，并且两个面与该细胞的接触区不同，并且所述第一面和第二面通过它们在该细胞的相对末端的定位而相互区别，其中第一面携带功能hNTCP蛋白，第二面携带功能hMRP2蛋白。
28.权利要求27所述的哺乳动物细胞，其中第一面是基底外侧面并且第二面是顶面。
29.权利要求27和28所述的哺乳动物细胞，其中第一面是顶面并且第二面是基底外侧面。
30.权利要求27到29所述的哺乳动物细胞，其中所述细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。
31.权利要求27到30所述的哺乳动物细胞，其是永生化的细胞。
32.权利要求27到31所述的哺乳动物细胞，其是重组细胞。
33.权利要求27到32所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hMRP2蛋白的载体的LLC-PK1细胞。
34.权利要求27到33所述的哺乳动物细胞，其是含有用于表达hNTCP蛋白的载体和用于表达hMRP2蛋白的载体的MDCKII细胞。
35.权利要求27到34的哺乳动物细胞，其是根据保藏物DSMACC2644的细胞。
36.权利要求27到35的哺乳动物细胞的生产方法，其中a]提供哺乳动物细胞；b]提供包含hNTCP的编码序列的载体；c]提供包含hMRP2的编码序列的载体；d]将来自a]的哺乳动物细胞通过来自b]的载体和来自c]的载体同时或者连续转化；e]鉴定并增殖来自d]的双转染子细胞。
37.权利要求36的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是肾脏、肠系统、肝脏或者血/脑屏障的上皮细胞。
38.权利要求36和37的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自a]的哺乳动物细胞是永生化的细胞。
39.权利要求36到38的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自b]的载体是根据图9的多核苷酸(Seq ID No.4)。
40.权利要求36到38的哺乳动物细胞的生产方法，其中来自c]的载体是根据图11的多核苷酸(Seq ID No.6)。
41.权利要求36到38的哺乳动物细胞的生产方法，其中将所述哺乳动物细胞建立为所保藏的细胞DSM ACC2644。
42.细胞单层，其包含至少两个权利要求27到35的细胞。
43.携带权利要求42的单层的固体表面，其中该细胞单层可以占据部分或者整个固体表面。
44.权利要求43的固体表面，其由塑料形成。
45.权利要求43的固体表面，其是培养皿的部分。
46.权利要求43的固体表面，其是滤器插入物的部分。
47.培养皿，其携带根据权利要求27到35的细胞单层。
48.滤器插入物，其携带根据权利要求27到35的细胞单层。
49.权利要求48的滤器插入物，其中膜支持体由聚碳酸酯和/或聚酯制造。
50.权利要求48的滤器插入物，其中膜支持体的孔径为0.4μm。
51.权利要求27到35的哺乳动物细胞的用途，用于确定关于肝胆管清除和/或肾脏排泄和/或脑吸收和/或肠吸收的药理学分布图。
52.权利要求51的哺乳动物细胞的用途，其中哺乳动物细胞在固体表面和/或培养皿和/或滤器插入物上形成单层的部分。
全文摘要
本发明涉及表达人NTCP(Na/牛磺胆酸根协同转运蛋白；SLC10A1)以及人BSEP(胆汁盐输出泵；ABCB11)或人MRP2(多药耐性蛋白；ABCC2)的一些双转染的细胞系，其适宜作为药物化合物分布图分析的体外工具，尤其作为肝胆管清除的模型。
文档编号C07K14/47GK1934242SQ200580009574
公开日2007年3月21日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月16日
发明者S·泰斯, T·艾森布莱特 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司